La diagnosi delle linfoadenopatie infettive - ATS Bergamo$all... · linfoadenopatie infettive Marco...

USC Microbiologia e Virologiadirettore Claudio Farina

““Diagnostica sierologica delle Diagnostica sierologica delle Malattie InfettiveMalattie Infettive inin etetàà pediatricapediatrica””

La diagnosi delle La diagnosi delle

linfoadenopatie infettivelinfoadenopatie infettive

Marco ArosioMarco Arosio

Bergamo, 22Bergamo, 22 novembre novembre 20142014

� Ad oggi non esistono studi che confrontino i risultati ottenuticon la biopsia con l’agoaspirato. Esistono tuttavia pareri controversi circa l’esecuzione di quest’ultima procedura.

� L’agospirato ha infatti un’elevata percentuale di falsi-negativi e spesso la quantità di tessuto prelevata non èsufficiente per una diagnosi di patologia infettiva o oncologica, inoltre, non consente di ottenere dettagli sulla struttura del linfonodo, essenziali per la diagnosi di linfoma.

Bambino Gesù - Roma

� Secondo numerosi autori, l’agoaspirato non è indicato ai fini diagnostici mentre la biopsia rappresenta il gold standard per la diagnosi eziologica di linfoadenopatia.

� Per la biopsia va rimosso il linfonodo di maggiori dimensioni, rimuovendolo con la capsula ed inviando campioni non solo per gli esami istopatologici ma anche per eventuali esami microbiologici.

Quali indagini sul materiale bioptico ?

� IL linfonodo dovrebbe pervenire al laboratorio non fissato, “a fresco”, non oltre 30 min dall’asportazione.

� Devono essere fornite dal clinico tutte le informazioni disponibili, utili ad un preciso inquadramento anamnestico.

� Il linfonodo deve giungere in un contenitore sterile, privo di qualsiasi fissativo.

� Il materiale “ a fresco” consente:- eseguire indagini microbiologiche; - ottenere sospensioni per le indagini citofluorimetriche e

citogenetiche;- estrarre DNA e RNA per eventuali test molecolari;- conservare parte del tessuto fresco (bio-banking).

� In letteratura, la biopsia è raccomandata come procedura diagnostica (talvolta diventa risolutiva dal punto di vista terapeutico) in presenza di:

- mancata diminuzione delle dimensioni linfonodali entro 4-6 settimane o assente normalizzazione delle sue dimensioni nell’arco di 8-12 settimane;

- mancata diminuzione delle dimensioni linfonodali dopo un ciclo di terapia antibiotica;

- ingrossamento dei linfonodi sovraclaveari;

- linfonodi duri, fissi o non doloranti;

- presenza di segni e sintomi generalizzati che non suggerisconoun’infezione;

- febbre da più di 1 settimana, sudorazione notturna, perdita di peso maggiore del 10%.

Cervicotomia esplorativa

Algoritmo testa collo

Tubercolosi linfonodaleTubercolosi linfonodale

� La linfoadenite tubercolare (TB) è la presentazione più comune della tubercolosi extrapolmonare, 35% dei casi (Cortez,2011).

� La diagnosi di linfoadenite TB è impegnativa in quanto entra in diagnosi differenziale con altri processi patologici (sarcoidosi, infezioni fungine e da micobatteri non tubercolari, ... (Derese, 2012).

Campioni per la ricerca deiCampioni per la ricerca dei micobatterimicobatteri

Diagnosi MicrobiologicaDiagnosi Microbiologica

� Esame microscopico

� Diagnosi molecolare diretta

� Esame colturale

� Identificazione� M. tuberculosis complex� MOTT (Micobatteri non tubercolari)

� Antibiogramma

� Diagnosi immunologica di TBC latente

Esame microscopicoEsame microscopico

� Colorazione:� - Ziehl-Neelsen� - Kinyoun

� Fluorescenza

Tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica

Indicato per tutti i campioni ad eccezione delle emocolture

Esame microscopico:Ziehl-Neelsen

Esame microscopico:Esame microscopico:ZiehlZiehl--NeelsenNeelsen

1000x

Esame microscopico: fluorescenza

Esame microscopico: Esame microscopico: fluorescenzafluorescenza

400x

Tabella interpretativaTabella interpretativa




� Esame colturale

� Identificazione�M. tuberculosis complex�MOTT (Micobatteri non tubercolari)

� Antibiogramma


Diagnosi molecolareDiagnosi molecolare didi linfoadenitelinfoadenite TBTB

� Geni target: IS6110, 16S rRNA, IS1081, 65kDA, …

� Materiali:- agoaspirato- biopsia linfonodale- tessuto fissato in formalina- tessuto incluso in paraffina

UtilitUtilitàà clinica deiclinica dei test ditest di amplificazioneamplificazione

� Il Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)suggerisce che l’impiego su campioni extrapolmonari dovrebbe essere concordato fra microbiologo e clinico (CLSI, 2008).

� L’accuratezza diagnostica della PCR è stata valutata in uno studio dell’Heath Technology Assessment(HTA) che segnala per i kit commerciali risultati meno accurati sui materiali extrapolmonari mentre in confronto ai test in-house meno sensibili ma molto più specifici (Dinnes, 2007).

Autore Test commerciale No. campioni

Gold standard

Sensibilità%

Specificità %

O'Sullivan (2002) MTD 164 M + C 77,3 98,5

Laraque (2009) MTD 682 M + C 89,3 74,5

Rüsch Gerdes(2004)

Probetec ET 396 M + C 81,4 97,5

Causse (2011) Cobas TaqMan 340 M + C 78,0 98,0

Piersimoni (2012) Probetec ET 918 M + C 82,7 99,0

Performance diagnostica di alcuni sistemi commerciali Performance diagnostica di alcuni sistemi commerciali su campioni extrapolmonari su campioni extrapolmonari

Tortoli, 2013

La performance di Xpert nella diagnosi di linfoadenite TB:

Sens.% Spec.%Linthelm (2011) 96.7 88.9

Tortoli (2012) 84.8 100

PCR GENEXPERTPCR GENEXPERT

� Vantaggi� molto più rapida� se positiva rende superflua l’identificazione� eseguibile anche su campioni pesantemente

contaminati

� Svantaggi� non altrettanto sensibile� non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie� false negatività dovute agli inibitori� false positività dovute a contaminazioni� costo elevato� esecuzione complessa

PCRPCR vsvs esame colturaleesame colturale

Algoritmo interpretativoAlgoritmo interpretativo

microscopia negativa (3 campioni) microscopia negativa (3 campioni)

amplificazionenegativa

(2 campioni)


(2 campioni)

amplificazionepositiva

(2 campioni)


(2 campioni)

amplificazionidiscordanti

(2 campioni)

amplificazionidiscordanti

(2 campioni)

TBC ulterioriindagininon TBC


microscopia positiva (1, o più campioni) microscopia positiva (1, o più campioni)


(1 campione)


(1 campione) amplificazione

negativa(2 campioni)


(2 campioni)

monitoraggio degli inibitori

monitoraggio degli inibitori

TBC presentipresenti assentiassenti

micobatteriosiripetizione del test


Indicazioni generaliIndicazioni generali

E’ pertanto sempre necessario oltre alla PCR l’esecuzione dell’esame microscopico e colturale che rimane l’indagine “gold standard”

La PCR puo’ rimanere positiva anche dopo lanegativizzazione dell’esame colturale ed al termine della terapia, deve quindi essere utilizzata:

- SOLO IN FASE DIAGNOSTICA

- E NON NEL FOLLOW-UP TERAPEUTICO

PCR GENEXPERTPCR GENEXPERT

Linfoadeniti superficiali Linfoadeniti superficiali

da micobatterida micobatteri nonnon tubercolaritubercolari (MNT)(MNT)

� Le linfoadeniti da MNT sono patologie infantili e interessano i linfonodi cervicali superiori .

� L’infezione rimane di solito unilaterale e localizzata senza coinvolgimento dei linfonodi toracici.

� I casi di infezioni riguardanti altre sedilinfonodali (inguinale, ascellare, femorale,epitrocleare) o soggetti adulti sono estremamente rari.

Eziologia delle linfoadeniti daEziologia delle linfoadeniti da MNTMNT

Il quadro delle specie responsabili ha subito notevoli cambiamenti negli ultimi anni (Staufner, 2012):

� M. scrofulaceum viene oggi isolato piuttosto raramente;

� M. avium complex, le specie appartenenti sono di più frequente riscontro;

� M. fortuitum e M. kansasii rimangono in Italia di bassa frequenza, maggiori sono le segnalazioni in altri Paesi;

� M. malmoense è particolarmente diffusa nei paesi scandinavi e anglosassoni. Anche in Italia, negli ultimi anni si sono registrati casi in

linfonodi cervicali di bambini;

� M. haemophilum, isolamenti in bambini immunocompetenti;

� M. bohemicum, M. interjectum, M. lentiflavum: si tratta dimicobatteri che hanno interessato anche il nostro Paese.

� M. celatum, M genavense e M. heidelbergense: sono di più raro isolamento.




� Esame colturale


� Antibiogramma


Terreni di colturaTerreni di coltura

� Terreni solidi

� Terreni liquidi

- Sensibile ma richiede da una a otto settimane

- Problema delle contaminazioni

� Velocità di crescita

� Aspetto delle colonie� rugose - lisce

� fotocromogene

� scotocromogene

� non pigmentate

� Crescita a varie temperature

� Test di inibizione selettiva

Identificazione tradizionale: test colturali

Identificazione tradizionale: Identificazione tradizionale: test colturalitest colturali




� Esame colturale

� Identificazione�M. tuberculosis complex�MOTT (Micobatteri non tubercolari)

� Antibiogramma


Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis complexcomplex

Classificazione dei MOTT Classificazione dei MOTT basata sul fenotipo (sec.basata sul fenotipo (sec. RunyonRunyon))

� Micobatteri a crescita lenta� fotocromogeni (M.kansasii)

� scotocromogeni (M.xenopi)

� non cromogeni (M.avium)

� Micobatteri a crescita rapida� (M.chelonae)

� Accumulo di niacina

� Riduzione dei nitrati

� Catalasi

� Idrolisi del Tween 80

� Ureasi

� Arilsolfatasi

� Riduzione del tellurito

Identificazione tradizionale: test biochimici

Identificazione tradizionale: Identificazione tradizionale: test biochimicitest biochimici

Tecniche molecolariTecniche molecolari

� Sonde

� Sequenziamento

� Enorme risparmio di tempo

� Specificità pressoché assoluta� Disponibili per un numero limitato di specie

� (ad eccezione del sequenziamento)

� Costo

� Complessità di esecuzione

Tecniche molecolariTecniche molecolari

vsvs identificazione biochimicaidentificazione biochimica

IlIl sequenziamentosequenziamento genicogenico

� E’ la tecnica di riferimento per l’identificazione

� Possibili bersagli

� 16S rRNA o rDNA

� 23S rDNA

� gene codificante per le heat shock proteins

� gene codificante per la superossido dismutasi




� Esame colturale


� Antibiogramma


ResistenzeResistenze didiM. tuberculosis complexM. tuberculosis complex

� Esclusivamente cromosomiche

� Sviluppo spontaneo di mutanti resistenti confrequenza compresa fra 1x10-6 e 1x10-8

� Selezione di mutanti resistenti in caso diterapie inappropriate

- Antibiogramma diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni

- Antibiogramma da ceppo isolato: tempi lunghi

MDR MDR -- M.tuberculosisM.tuberculosis

�� MDRMDR = Multidrug resistantresistente almeno ai due principali farmaci isoniazide e

rifampicina

�� XRDXRD = Extensive drug resistant

resistente: a tutti i farmaci di prima scelta,

ai fluorochinolonici,

ad almeno uno dei tre farmaci iniettabili:capreomicina,

kanamicina,

amikacina

9.4Estonia

Ivanovo(Russia)

Latvia

Henan(China)

IranLiaoning(China)

Domenican Rep

3.1

5 7.810.4

99.312.2

MDRMDR--TB prevalence in new cases: 1994TB prevalence in new cases: 1994--2003 2003

MDRMDR--TB is rampant in the former Soviet Union and ChinaTB is rampant in the former Soviet Union and ChinaTomsk

(Russia)13.7

Israel

14.2

6.6

5.3

Ivory Coast

4.9

Ecuador

14.214.2

Kazakhstan13.2Uzbekistan

Lithuania

Ref: DRS Report #3 (in press)

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Nor

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Can

ada

Italy

Farmaci antitubercolariFarmaci antitubercolaridi primadi prima sceltascelta

� ISONIAZIDE: battericida, attiva sui batteri in rapida crescita,inibisce la sintesi degli acidi micolici.

� RIFAMPICINA: battericida, attiva sui batteri in rapida crescita che su quelli intracellulari a crescita rallentata, inibisce la sintesi proteica

� PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a PHacido, sui batteri intracellulari, meccanismo d’azione sconosciuto

� ETAMBUTOLO: batteriostatico, attivo sui batteri in rapida scescita, inibisce la sintesi della componente glucidica della parete

� STREPTOMICINA: battericida, attiva solo sui batteri extracellulari in rapida crescita, blocca la sintesi proteica

AntibiogrammaAntibiogramma tradizionaletradizionale

� Metodo delle proporzioni:

� su Lowenstein-Jensen: 28-42 gg

� su 7H10/11: 10-21 gg

� in terreno liquido (radiometrico, fluorescenza) 5-12 gg

MutazioniMutazioni ee resistenzeresistenze

� Nella grande maggioranza dei casi dei ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari sono state individuate mutazioni in determinate regioni geniche

� Per nessun altro farmaco sono state trovate mutazioni associate al 100% delle resistenze

� In molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro

Algoritmo dellAlgoritmo dell’’Iter Diagnostico deiIter Diagnostico dei MicobatteriMicobatteri

C a m p i o n e

C o l t u r a

R e f e r t o d e f i n i t i v o V e t r i n o : K i n y o u n

M o r f o l o g i a a F A S C I

M o r f o l o g i a N O N a F A S C I

P C R - M y c o s e n o n e s e g u i t a i n p r e c e d e n z a

S e q u e n z i a m e n t o

N E GP O S

N E G

P O S

A n t i b i o g r a m m a

P r o v e b i o c h i m i c h e: - M . T u b e r c u l o s i s : n i a c i n a - M B c o m p l e x : n i t r a t i

T C H 2

P O S

E s a m e m i c r o s c o p i c o

R e f e r t o p r e l i m i n a r e

T B c o m p l e x

M O T T i d e n t i f i c a t o

R e f e r t o d e f i n i t i v o e s e g n a l . v . b r e v e

P C R - M y c o

P O S



S e g n a l . v . b r e v e






� Esame colturale


� Antibiogramma


Infezione latente e malattia attivaInfezione latente e malattia attiva

�� Infezione tubercolare latenteInfezione tubercolare latente

Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza segni clinici, batteriologici o radiologici di malattia manifesta. Tipicamente si tratta di individui con intradermoreazione tubercolinica positiva ed un Rx torace normale, che possono essere contatti di un precedente caso di tubercolosi.

�� TubercolosiTubercolosiStato di malattia manifesta dal punto di vista clinico, batteriologico e/o radiologico.� Polmonare

� Malattia primaria� Malattia postprimaria

� Extrapolmonare

World Health Organization

Active TB – 8 million new cases a year- Unfortunately just the tip of the iceberg

LaLa puntapunta delldell’’ icebergiceberg

NUOVI TESTNUOVI TEST

� T SPOT-TB (Oxford Immunotech)

� QuantiFERON-TB Gold (Cellestis)

Linee guida CDC e NICELinee guida CDC e NICE

Naive T cell

Effector T cells

+

MTB antigens

Effector T cells require continual presence of antigen

RISPOSTA IMMUNE DOPO RISPOSTA IMMUNE DOPO INFEZIONE CON MTBINFEZIONE CON MTB

RISPOSTA IMMUNE DOPO RISPOSTA IMMUNE DOPO INFEZIONE CON MTBINFEZIONE CON MTB

Naive T cell

Effector T cells

+MTB antigens

If treatment is successful and no antigen remains,

what happens to the T cells?

DESTINO DEI LINFOCITI TDESTINO DEI LINFOCITI T

No antigen

Effector T cells

90%

10%

Apoptosis

Memory T cells

� Effector cells produce IFN-γ within a few hours of stimulation

� Memory cells must differentiate, and take >24 hours before significant IFN- γ production

� 16-20 hour incubation.

⇒The IFN- γ is from effector T cells & these cells need antigen to survive

PRODUZIONE DI PRODUZIONE DI IFNIFN -- γγ

• Antigens are all taken from the RD1 region of M. tuberculosis.

• RD1 is absent from all BCG strains (lost during original derivation of M. bovisBCG from M. bovis between 1908 and 1921 at Institut Pasteur)

• Crucially, therefore, does not give false positive results in BCG vaccinated individuals.

TEST IMMUNOLOGICITEST IMMUNOLOGICI

PREPARAZIONE DELLE CELLULE

• Blood collected intoVacutainer CPT™ tube

• Tube centrifuged

• Lymphocyte band removed

• Cells washed & counted

• Cells added to 96-well plate

U.O. Microbiologia e Virologia

T SPOT - TB

• T cells from the sample are exposed to an antigen from the pathogen of interest.

• If T cells recognise that antigen, they secrete cytokines (chemical messengers)

• CLINISPOT™ detects this cytokine secretion by cells.

• Incubation too short for proliferation (memory T cells response) to occur

• Each spot is the footprint of a single cell that has reacted to the antigen.

FORMAZIONE DEGLI SPOTFORMAZIONE DEGLI SPOT

• Antigens added to cells

• Incubate overnight

• Plate washed

• Add detection reagent for 60 minutes

• Plate washed

• Add substrate; spots in 7 minutes

• Plate washed and dried

-ve

+ve

QUANTIFERON -TB GOLD

• FDA approved product for the diagnosis of Latent TB, the new version uses as ESAT-6, CFP-10 and TB7.7 as antigens.

• It is a cytokine ELISA test.

• Looks for cellular immune responses by measuring IFN-γrelease.

• Requires 24 hour incubation to get IFN-γ release, which is then detected in the serum by ELISA

““ ININ --TUBETUBE”” QUANTIFERONQUANTIFERON --TB GOLD TESTTB GOLD TEST

NilTB

specificantigens

Mitogen

1. Collect blood directly into 3 X 1mL heparin tubes

2. Mix and incubatefor 16-24 hours

3. Harvest plasma OR Centrifuge and ship

Gel plug

4. Test for IFN-γ by ELISA

Easily automated, directly from tubes5. Computer determines test result using QuantiFERONGold software

Oltre aiOltre ai testtest diagnostici tradizionalidiagnostici tradizionali,,

esiste altroesiste altro per laper la tubercolositubercolosi ??

USC Microbiologia e Virologiadirettore Claudio Farina

Grazie per lGrazie per l’’ attenzioneattenzione

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