La Consulenza Genetica ed itest genetici nella pratica clinica

La Consulenza Genetica ed i test genetici nella pratica clinica

La Sindrome di Epstein, la Sindrome di Fechtner e le sindromi correlate

Marco Seri

Siena, Giovedì 24 Settembre 2009

Un po’ di storia……

Cataracts

Nephritis

Deafness

Macrothrombocytopenia

Leukocyte inclusion bodiesFECHTNER SYNDROME

Cataracts

Nephritis

Deafness


Leukocyte inclusion bodies

MAY-HEGGLIN ANOMALYSEBASTIAN SYNDROME

FECHTNER SYNDROME

In MHA, the “Döhle-like bodies” consist of an amorphous area of cytoplasm

containing clusters of ribosomes oriented along parallel microfilaments

In SBS, the “Döhle-like bodies” are composed of highly dispersed

filaments and few ribosomes

D22S278

D22S426

D22S283 4.10 q11-q13

Lod score θθθθ=0.0

Z82217

Z95114

AL031426

Z82215

AL022302

AL022313

AL031845

Z70289

FTNS/MHA critical region: ca. 480000 bp

TNF-inducible

protein CG12-1

APOL2

APOL

MYH9 TXN2

dJ1119A7. 5

E1F3S7

dJ1119A7.3

CACNG2

D22S683

Cen Tel

D22S278

D22S1173

D22S283

D22S426

Il gene MYH9 codifica per la catena pesante della miosina non muscolare di tipo IIA (NMMHC-IIA) che è espressa in alcuni tessuti quali piastrine, rene, leucociti e coclea.

Altre miosine non convenzionali sono associate a malattie nell’uomo che mostrano sordità o difetti dell’occhio.

Miosina VIIA Usher syndrome type IB (sordità congenita, areflessia vestibolare e retinite pigmentosa progressiva)DFNB2 (sordità recessiva non sindromica)

Miosina XV DFNB3 (sordità recessiva non sindromica)

Miosina VI Snell's waltzer deafness: modello murino DFNA22 (sordità dominante non sindromica)

Cataracts

Nephritis

Deafness



EPS

TEIN

SYNDROME


FECHTNER SYNDROME

Sarcomeric, smooth muscle and nonmuscle class II myosins

COOH

Exameric enzymes

light chain

heavy chain

COOH

Coiled coil• assembly of bipolar myosin filaments

Motor domain• ATP hydrolysis• actin binding

Cataracts

Nephritis

Deafness



EPS

TEIN

SYNDROME


FECHTNER SYNDROME

DFNA17

MYH9-RELATED DISEASE

•Recurrent mutations (codons 96, 702, 1155, 1165, 1424, 1841, 1933) represents 88% of all mutations identified up to date in the MYH9 gene.

•Deletions and missense or frameshift mutations resulting in a truncated protein have never been described.

•The presence of missense or frameshift mutations have been described only in the last exon, coding for the C-terminal tail which is essential to assemble the molecule in bipolar filaments, suggesting that the dominant negative effect is the pathogenetic mechanism.

•However, it is still being debated if the pathogenetic mechanism is a Dominant Negative effect due to the altered dimer formation orrather if it is Haploinsufficiency.

A locus presents Haploinsufficiency if more genic product than the one obtained by a single gene allele is necessary for

the expression of the normal phenotype.

The Dominant Negative effect takes place when the genic product of the mutated allele affects the function of the wild type one.

La patogenesi

Aploinsufficienza?Effetto Dominante Negativo?

Kunishima S et al. “Immunofluorescence analysis of neutrophil Nonmuscle Myosin Heavy Chain-A in MYH9 disorders: association of subcellular localization with MYH9 mutations” Laboratory Investigation (2003)

Deutsch S et al.”Asp1424Asn MYH9 mutation results in an unstable protein responsible for the phenotypes in May-Hegglin anomaly/Fechtner syndrome”Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Biology (2003)

Takubo T et al.”Expression of non muscle type myosin heavy polypeptide 9 (MYH9) in mammalin cells” European Journal of Histochemistry (2003)

Franke JD et al. “Rod mutations associated with MYH9-related disorders disrupt non-muscle myosin-IIA assembly” Blood (2004)

Pecci A et al. “Pathogenetic mechanisms of hematological abnormalities of patients with MYH9 mutations” Human Molecular Genetics (2005)

It seems that several genetic mechanisms take place in the pathogenesis of the disease in different tissues.

The difficult accessibility of the other tissues involved in the disease (e.g. inner ear and kidneys) makes it extremely difficult to understand the molecular

mechanism leading to the disease.

MYH9

nephritis

deafness cataracts

leukocyte inclusions

giant platelets

thrombocytopenia

Protocollo diagnostico

• Striscio di sangue

Control

Platelet

s

Platelet

s

MGG

mAb agai nst

NMMHC- IIA

Immunoistochimica

A B

Immunofluorescenza

Se positivo analisi degli esoni contenenti le

mutazioni ricorrenti, (1, 16, 24, 25, 26, 30,

38, 40) quindi analisi delle altre parti del

gene

Se negativo non viene effettuata la diagnosi

molecolare ma…..

…….è sempre importante inviare il paziente

alla CONSULENZA GENETICA

Acknowledge

University of BolognaDr E. PanzaProf M.Seri

University of PaviaDr A. PecciProf C. Balduini

University of GenovaDr.ssa M. MariniProf R. Ravazzolo

University of TriesteDr.ssa F. Di BariProf.ssa A. Savoia

Setting up an in vitro model to study the effect of MYH9 mutations

CLONING OF THE ENTIRE MYH9 cDNA

SCHEMA CLONAGGIO MIOSINA 9

Frammento A Frammento B Frammento C

2338 bp 1675 bp 1865 bp

Aat II Eco RI

MYH9 RT3 MYH9 RTMYH9 RT2

NMMHC-IIA (red) GST (green)

COOH

Motor domain Coiled coil

COOH

heavy chains

lightchains

N93K A95T

S96L

R1933X

R1165L

T1155I

S1114P

R702H

R705H

R702C

5828delG

5779delC5774delA

E1841K

R1165C

Del L1205-Q1207

D1424N

D1424H

D1424Y

K371N

381 16 2610 25 4030

MHA

SBS

MHA/SBS

DFNA17

FTNS

EPTS

FTNS/EPTS

E1945X

24

Del E1066-A1072

D1424H

NMMHC-IIA (red)

Transfection of COS cells with wild-type MYH9 cDNA

NMMHC-IIA (red)

Transfection of COS cells with D1424H MYH9 cDNA

FLAG (D1424H) V5 (WT)

The coThe co--trasfection, revealed by the double FLAG/V5 labelling is good trasfection, revealed by the double FLAG/V5 labelling is good

Cotransfection experiments with MYH9 WT and D1424H

C D

A B

x

Flag-Tag V5-Tag

FLAG (D1424H) V5 (WT)

FLAG (mutant) signal has a strong preferential localization in tFLAG (mutant) signal has a strong preferential localization in the subhe sub--membrane regionmembrane regionrather than in the cytoplasm, rather than in the cytoplasm, V5 (WT) signal has a more homogeneous distribution among the suV5 (WT) signal has a more homogeneous distribution among the subb--membrane region membrane region And the cytoplasmAnd the cytoplasm


TRANSFECTED CELLS

A

WILD-TYPE NMMHC-IIA D1424H NMMHC-IIA

B CPERIPHERAL BLOOD

D E F

CO-TRANSFECTED CELLS WILD-TYPE NMMHC-IIAD1424H NMMHC-IIA MERGING

G H I

In co-transfected cells the mutant MYH9 showed adistribution similar to that observed in cells transfectedwith mutant MYH9 alone, with part of the Flag signal diffused in the cytoplasm and part organized in rodlike aggregates.

Aggregates were globally less frequent than in cells transfected with D1424H cDNA alone.

Confocal analysis demonstrates that WT signal presented a high degree of co-localization with the mutant signal diffused in the cytoplasm, thus suggesting that transfectedWT and D1424H molecules interact in these cells.

These findings suggest that the NMMHC-IIA mutated in position 1424 is able to interact with the WT form in living cells, despitepart of the mutant protein precipitates in non functional aggregates.

The fact that NMMHC-IIA mutated in position 1424 retains the ability to interact with WT protein represents the basis for it to exert a dominant negative biochemical effect on the normal protein.

COOH


COOH

heavy chains

lightchains

N93K A95T

S96L

R1933X

R1165L

T1155I

S1114P

R702H

R705H

R702C

5828delG

5779delC5774delA

E1841K

R1165C

Del L1205-Q1207

D1424N

D1424H

D1424Y

K371N

381 16 2610 25 4030

MHA

SBS

MHA/SBS

DFNA17

FTNS

EPTS

FTNS/EPTS

E1945X

24

Del E1066-A1072

D1424H

E1841KR1933X

R702C

R702H

D1424N

R1165C

Malattie Mendeliane

Malattie Multifattoriali

MYH9 is associated with nondiabetic end-stage renal disease in African Americans (Nature Genetics 2008)

MYH9 is a major-effect risk gene for focal segmental glomerulosclerosis (Nature Genetics 2008)

Genome-wide linkage analysis of serum creatinine in three isolated European populations (Kidney International 2009)

Polymorphisms in the Nonmuscle Myosin Heavy Chain 9 gene (MYH9) are associated with albuminuria in hypertensive African Americans (American Journal of Nephrology 2009)

Polymorphisms in the Nonmuscle Myosin Heavy Chain 9 gene (MYH9) are strongly associated to end stage renal disease hystorically attribuited to hypertension in African Americans (Kidney International 2009)

From Nat. Genet. 24:333-335; 2000

Figure 1

C

A

B

Two-Hybrid System

MYH9 (NMMHC-IIA) – MYH10 (NMMHC-IIB)

Future prospectives........

COOH


COOH

heavy chains

lightchains

WT

R1933X

Y1460X

W828X

∆∆∆∆451X

Deletion constructs

In collaboration with Professor Francesco Blasi, San Raffaele, Milano,Italy.

WT K371N R702H R702C R1165C D1424H D1424N E1841K E1945X R1933X

Entry Clone 201

(Kanamicina)x x x

Entry Clone 207

(Gentamicina)x x - x - x - x x x

pDEST 26 6xHIS

(Ampicillina)x

pDEST 27 GST

(Ampicillina)x

pcDNA3.1/nV5 DEST-V5

(Ampicillina)x x x

pDEST-FLAG (Kanamicina) x x x x

pDEST53GFP

(Ampicillina)x x x x x x

VECTORS, MUTANTS and MYH9 CLONES

A B C

D E F

WILD-TYPE NMMHC-IIA D1424H NMMHC-IIA

TRANSFECTED CELL LIN

ES

PERIPHERAL BLO

OD

Panza E, Pecci A, Marini M, Giacopelli F, BozziV, Seri M,Balduini C, Ravazzolo R.“Transfection of the mutant MYH9 cDNA reproduces the most typical cellular phenotype of MYH9-related disease in different cell lines”Pathogenetics 2008 Dec 1;1(1):5.

FLAG (mutant) V5 (WT)

In some cells the FLAG (mutant) signal has a high irregular distIn some cells the FLAG (mutant) signal has a high irregular distribution, and form ribution, and form structures similar to filaments and spots, while the V5 (WT) sigstructures similar to filaments and spots, while the V5 (WT) signal is more nal is more regularly distributed (microscopic spots uniformly distributed iregularly distributed (microscopic spots uniformly distributed in the cytoplasm). n the cytoplasm).


FLAG (mutata) V5 (WT)

Some aggregates are evident with antiSome aggregates are evident with anti--FLAG (mutant) antibody;FLAG (mutant) antibody;these aggregates are more evident in FLAGpos / V5neg cells orthese aggregates are more evident in FLAGpos / V5neg cells orin cells with weak V5 signal, where WT has not been trasfected oin cells with weak V5 signal, where WT has not been trasfected or seems to be poorly r seems to be poorly expressed.expressed.



Some feeble aggregates are evident with the antibody antiSome feeble aggregates are evident with the antibody anti--FLAG (mutant) also in someFLAG (mutant) also in somecells cocells co--transfected FLAGpos / V5pos with strong V5 signal; transfected FLAGpos / V5pos with strong V5 signal; In these cells aggregates are not visible with antiIn these cells aggregates are not visible with anti--V5 (WT) antibody.V5 (WT) antibody.

Cotrasfection experiments with MYH9 WT and D1424H

�GST signal is not a good tag to follow WT MYH9

�6xHis is not a good tag to follow mutant MYH9

MYH9 WT MYH9 D1424H

Cotransfection experiments in COS7 cell linesCotransfection experiments in COS7 cell lines

MYH9 D1424H

MYH9 WT

�V5 is good to follow WT MYH9

Cotransfection experiments in COS7 cell linesCotransfection experiments in COS7 cell lines

but still, the overall system is not good enough......

Looking for a new expression vector........

Gateway Converting System KitGateway Converting System Kit

FLAG

pCMVpCMV--FLAGFLAG--DESTDEST

The genotype-phenotype correlation leads to the concept that

the MYH9-RD phenotype results from the joint effect of MYH9

mutations and unknown enviromental and/or genetic factors, such as

multiple gene products.

21 Families

6FTNS 6EPTS 4MHA 1SBS 4MHA/SBS

47 Patients

38 familial cases 9 sporadic

16FTNS 3FTNS6EPTS 3EPTS9MHA 1MHA3SBS4MHA/SBS 2MHA/SBS

19FTNS 8EPTS 10MHA 3SBS 6MHA/SBS

MYH9 Mutations Exon FTNS EPTS MHA SBS MHA/SBS

N93K 1 1 case

R702C 16 1 case 2 case 1 case 1 case

R702H 16 3 cases

K910Q 21 1 caso*

Del E1066-A1072 24 1 case

T1155I 25 1 case

R1165C 26 1 case

D1424H 30 3 cases*

D1424H 30 1 case

E1841K 38 1 case

R1933X 40 1 case

E1945X 40 1 case

* same patient

MYH9 mutations are present in 19 out of 21 patients analyzed

COOH


COOH

heavy chains

lightchains

N93K A95T

S96L

R1933X

R1165L

T1155I

S1114P

R702H

R705H

R702C

5828delG

5779delC5774delA

E1841K

R1165C

Del L1205-Q1207

D1424N

D1424H

D1424Y

K371N

381 16 2610 25 4030

MHA

SBS

MHA/SBS

DFNA17

FTNS

EPTS

FTNS/EPTS

E1945X

24

Del E1066-A1072

•Alcune mutazioni sono ricorrenti 96 (S->L); 702 (R->C, R->H); 1155 (T->I); 1165 (R->C, R->L); 1424 (D->H, D->N); 1841 (E->K); 1933 (R->X)

•Mutazioni Nonsenso e frameshift colpiscono solo l’ultimo esone del gene MYH9 gene (R1933X, E1945X, 5774delA, 5779delC and 5828delG)

•Solo delezioni “in frame” di pochi aminoacidi sono state identificate nel gene MYH9 (del L1205-Q1207; del E1066-A1072 )

geni

modificatori

FTNS-EPTS

R1933XMHA-SBS

E1841K

R702C

R702HFTNS-EPTS

D1424H

MHA-SBST1155I

R1165C

Control

Neutrop

hils

Platelet

s

Neutrop

hils

Platelet

s

MGG

mAb agai nst

NMMHC- IIA

A

E

B C

F G

•Pertanto la classificazione di FTNS, EPTS, MHA and SBS come malattie separate appare non corretta ed i criteri clinici utilizzati per questa classificazione vanno riconsiderati.

•Queste malattie mostrano uno spettro continuo di sintomi dalla macrotrombocitopenia, alle inclusioni nei polimorfonucleati fino alla sordità neurosensoriale, alla cataratta ed infine alla nefrite.

•Noi proponiamo così che queste patologie siano considerate come un’unica entità clinica da chiamare “MYH9-related disease”.

•L’espressività variabile della malattia può essere poi spiegata dall’effetto congiunto di specifiche mutazioni, di fattori ambientalicosì come dalla presenza di "modifier genes”.

Cataracts

Nephritis

Deafness



EPS

TEIN

SYNDROME


FECHTNER SYNDROME

DFNA17

MYH9-RELATED DISEASE

•Per meglio definire lo spettro delle malattie da mutazioni nel gene MYH9, abbiamo studiato 3 famiglie aggiuntive che mostrano fenotipi caratterizzati da trombocitopenia associata a vari livelli con sordità, anomalie oculari e nefrite e pertanto in parte sovrapponibili al quadro clinico presente nei pazienti con mutazioni nel gene MYH9.

•L’analisi di linkage e/o l’analisi di sequenza ha escluso un coinvolgimento del gene MYH9 come responsabile delle malattie presenti in queste famiglie.


Hearing loss


Bilateral Cataracts

Hearing loss


Hearing loss

Nephritis

•Infine abbiamo raccolto un gruppo di 10 pazienti Alport nei quali era stata ipotizzata una trasmissione autosomica dominante e senza mutazioni nei geni del collagene di tipo 4 (COL4).

•L’analisi di questi casi tramite sequenziamento diretto della regione codificante del gene MYH9 ci ha consentito di escludere un coinvolgimento di questo gene nella patogenesi delle forme dominanti di Sindrome di Alport.

•Tutti questi dati dimostrano che le malattie da mutazioni nel gene MYH9 presentano un fenotipo definito che ha come caratteristica fondamentale la presenza delle inclusioni nei leucociti rilevabili attraverso la microscopia ottica o tramite esperimenti di immunocitochimica.

Cosa stiamo facendo:

Sistema del doppio ibrido per trovare proteine ineragenti con la MYH9

Sistema del doppio ibrido mirato per proteine candidate

Esperimenti di coimmunoprecipitazione

Esperimenti di trasfezione del gene MYH9 wild-type e mutato

Studi di immunocitochimica su tessuti di pazienti

Modello animale

CLONAGGIO cDNA MIOSINA NON MUSCOLARE 9

NMMHC-A (red) GST (green)

NMMHC-A (red)

Transfection of COS cells with wild-type MYH9 cDNA

NMMHC-A (red)

Transfection of COS cells with D1424H MYH9 cDNA

A

B

C

D

E

F

G

H

A

B

C

D

•Il gene codificante per la podocina (NPHS2) è stato recentemente identificato come responsabile di una sindrome nefrosica autosomica recessiva resistente agli steroidi.

•Il gene NPHS1 che codifica per la nefrina è stato identificato essere coinvolto nella forma congenita di sindrome nefrosica del tipo Finnico.

•La nefrina è il componente maggiore dello "slit-diaphragm" presente tra i processi interdigitati dei podociti ed è stato ipotizzato che questa proteina èimportante per mantenere la struttura di questi processi.

•Recentemente è stato dimostrato che la nefrina rappresenta una molecola di segnale ed i segnali indotti dalla nefrina sono enormemente amplificati dalla podocina che si lega alla coda citoplasmatica della nefrina.

•Infine è stato dimostrato di recente che la nefrina ancora lo "slit-diaphragm" all'actina nel citoscheletro

•Queste due proteine giocano così un ruolo cruciale nella funzione di filtrazione della barriera glomerulare e quando mutate determinano una disfunzione del podocita e la presenza di proteinuria.

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

3

C

A

7

T

A

3

C

A

7

T

A

3

C

A

7

T

A

7

C

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

7

T

A

3

C

A

7

C

A

7

T

A

3

T

A

7

T

A

9

C

A

7

C

A

7

T

A

3

C

G

1

C

A

7

T

A

9

C

A

7

T

A

3

C

G

7

T

A

7

T

A

NPHS2P

1- Intron 1 (301-309)

2- 951T>C

4- 1038A>G

7

C

A

7

C

A

Marco Seri Simone GangarossaRoberto CusanoEmanuele Panza Bianca Rocca

Monica Marini Raffaele LandolfiRoberto Ravazzolo

Nicola BizzarroFilomena Di BariAnna Savoia Paola Malatesta

Maria CapriaAlessandro PecciPatrizia Noris Pasi A. KoivistoUmberto MagriniCarlo L. Balduini Ilaria Meloni

Alessandra RenieriMaria SavinoMaria Del Vecchio Luisa MurerMaria d’ApolitoLeopoldo Zelante Giovanni Banfi

Gianluca Caridi Michele PurrelloGian Marco Ghiggeri

Carmine PecoraroSaverio Sartore

Achille Iolascon

A B

C D

Normal platelets

Normal PMN

Giant

platelet

PMN with

Dohle-like

body

Myh9 Myh10

Esempio 1. L’anticorpo anti-Myh9e quello anti-Myh10 sembrano riconoscere due sistemi di filamenti apparentemente differenti. Myh9 forma

filamenti grossolani uniformemente distribuiti in tutto il citoplasma della cellula, dalla regione perinucleare a quella corticale, dove

definiscono bene i confini cellulari; appaiono orientati lungo l’asse longitudinale dei prolungamenti e lungo le linee di forza. Myh10 forma

filamenti più sottili, che appaiono differenti innanzitutto perché possono essere orientati in maniera diversa, come nel nella parte inferiore della

cellula; inoltre sono presenti solo in alcune zone di citoplasma e non disegnano mai l’intero profilo della cellula – in particolare non sono mai

presenti fino alla zona corticale, che è sempre delimitata da Myh9.

La sovrapposizione dei due segnali sullo stesso piano dimostra meglio questi aspetti; si osserva come il segnale rosso e quello verde

siano in parte separati, me si intuiscono anche dei punti di sovrapposizione, contrassegnati da un segnale giallo.

Esempio 2. Idem. Notare come Myh9 disegni sempre bene il profilo e l’impalcatura della cellula e Myh10 corra solo in alcune

zone di citoplasma

Esempio 2, sovrapposizione, idem.

Esempio di proiezione ortogonale della fluorescenza rilevata su un determinato piano confocale sull’asse z. A destra della linea

tratteggiata è riportata la proiezione della fluorescenza rilevata lungo la linea centrale verticale sull’asse y (in pratica x e z sono fisse,

viene rilevata la fluorescenza lungo y); sotto la linea tratteggiata è riportata la proiezione della fluorescenza rilevata lungo la linea cen

-trale orizzontale sull’asse x (z e y fisse).

Si osservi come sono presenti zone di segnale rosso (filamenti Myh9), zone di segnale verde (filamenti Myh10) zone buie (spazio fra

i filamenti), ma anche zone con un chiaro segnale giallo (zone di colocalizzazione), indicate dalle frecce.

y

x

Altro esempio, idem.

Altra metodica per effettuare lo studio di colocaliz-

zazione.

Tracciando una retta su un piano confocale viene

rilevata e confrontata l’intensità di segnale lungo la

retta per ciascun canale.

Qui si vede benissimo che su questo piano i due

maggiori picchi di fluorescenza nel verde - che

identificano due singole fibre di myh10 che passano

sul piano-, corrispondono con precisione nanometrica

ad altrettanti picchi di fluorescenza nel rosso,

identificando quindi due punti in cui le due strutture

vengono a contatto.

An accurate clinical re-evaluation of patients allows to observe that patients carrying MYH9 mutations show a continuous spectrum ofclinical manifestation without evidence to support the differentiation indistinct diseases.

The only two findings observed in all patients are the macrothrombocytopenia and the abnormal distribution of NMMHC-IIAwithin leukocytes.

Control

Platelet

s

Platelet

s

MGG

mAb agai nst

NMMHC- IIA

Biochemical mechanisms through which mutations affect the NMMHC-IIA function are not completely understood.

About 70% of the families have mutations in the C-terminal tailand 88% of them affect only 4 residues (1165, 1424, 1841, 1933)

representing less than 1% of all the possible residues involved.

No consistent correlations have been identified between the 27 different MYH9 mutations identified so far and the variable

clinical evaluation of the disease.

Understanding genotype-phenotype correlation

Collection of new cases

“Italian registry for MYH9-Related Disease”Pavia, Italy.

Molecular analysis of MYH9 exon 1, 15, 16, 25, 26, 30, 38, 40. Bologna, Italy.

150 cases up to date (February 2008)

This study included 108 patients with MYH9-RD confirmed by molecular analysis, diagnosed by the collaborative groups from Junuary 2001 to December 2006.

Five new mutations identified; three missense and two single base deletions

•La Sindrome di Fechtner (FTNS; MIM 153640) è una malattia autosomica dominante descritta per la prima volta da Peterson et al. (1985) che è stata considerata come una variante della Sindrome di Alport.

•Infatti è caratterizzata da nefrite, sordità neurosensoriale ed anomalie dell’occhio ma mostra anche caratteristiche aggiuntive come la macrotrombocitopenia e corpi inclusi all’interno dei polomorfonucleati chiamati “Döhle-like bodies”.

•L’anomalia di May-Hegglin (MHA; OMIM 155100) condivide con la FTNS la triade clinica di trombocitopenia, piastrine giganti e le caratteristiche inclusioni leucocitiche.

•La Sindrome di Sebastian (SBS; MIM 605249) ècaratterizzata dalle stesse alterazioni ematologiche ma si differenzia dalla MHA sulla base delle immagini ultrastrutturali dei “Döhle-like bodies”.

MHA/SBSFTNS

38

E1841K

1 16 26

R1165CN93K R702C

30

D1424H

40

R1933X

Motor domain Coil coiled domainACD

Assembly competence domain

Missense K C C H K

93 702 1165 1424 1841

| | | | |

HsnmIIa (P35579) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRSKREQEVN---QQELDDLLVDL---QVRRTEKKLKD--

XlnmIIa (AAC83556) --ELACLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRTKREQEVT---QQELDDISVDL---QVRRTEKKLKD--

RnnmIIa (AAA74950) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRSKREQEVS---QQELDDLLVDL---QVRRAEKKLKD--

RnNeur (S21801) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRSKREQEVN---QQELDDLLVDL---QVRRTEKKLKD--

GgnmII (P14105) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRSKREQEVT---QQELDDIAVDL---QVRRAEKKLKD--

HsnmIIb (P35580) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRTKREQEVA---QQELDDLTVDL---LVRRTEKKLKE--

XlnmIIb (AAA49915) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRTKREQEVA---QQELDDLMVDL---LVRRTEKKLKE--

RnnmIIb (AAF61445) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRTKREQEVA---QQELDDLTVDL---LVRRTEKKLKE--

BtnmIIb (BAA36494) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRTKREQEVA---QQELDDLLVDL---LVRRTEKKLKE--

GgsmII (P10587) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRAKREQEVT---QQELDDLVVDL---TLRQKDKKLKD--

OcsmII (P35748) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRAKREQEVT---QQELDDLVVDL---ALKQRDKKLKE--

DmnmII (Q99323) --ELTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---ELRSKREQELA---QSELEDATIEL---ANRKMDKKIKE--

Cenmy1 (CAA99841) --MLTCLNEASVL---VLEGIRICRQG---QLKAKRDEEYA---IQEAEDVQKEL---TLRRMETKMAE--

Cenmy2 (AAA83339) --ELTYLNEASVL---VLEGIRICRQG---DLMSRKDEEVN---QQELEDSSMEL---AARRLEKRLND--

•La Sindrome di Epstein (EPTS-OMIM 153650) è una malattia ereditaria che si differenzia dalla FTNS solo per l’assenza dei “Döhle-like bodies” nei granulociti e per l’assenza della cataratta bilaterale.

•Gli esperimenti di immunocitochimica hanno messo in evidenza deipatterns di immunoreattività che è possibile correlare con le diverse mutazioni nel gene MYH9.

•La mutazione D1424H è associata con un singolo aggregato di medie/larghe dimensioni nel citoplasma dei granulociti talvolta associato con alcuni aggregati minori. I pazienti che presentanoquesta mutazione mostrano anche una distribuzione negativa ed irregolare della miosina nelle piastrine.

•Al contrario, le mutazioni al codone 702, normalmente identificate nei pazienti EPTS, determinano la presenza nei granulociti neutrofili di diversi microaggregati di dimensioni molto piccole spiegando cosìla difficoltà di rilevare la presenza delle inclusioni attraverso una colorazione con May-Grünwald-Giemsa. Le piastrine dei pazienti che presentano una mutazione al codone 702 mostrano un pattern diffuso.

•Macrotrombocitopenia è sempre presente.

•Anche nei pazienti EPTS si dimostra tramite esperimenti di immunocitochimica la presenza di aggregati di miosina nei leucociti.

•La presenza di ipoacusia è stata accertata nei pazienti indipendentemente dalla diagnosi iniziale di FTNS, EPTS or MHA-SBS ed in particolare nel 82% dei pazienti affetti da SBS o MHA.

•La cataratta bilaterale è stata identificata in 11 pazienti e sorprendentemente in 3 pazienti con una diagnosi di MHA-SBS.

•Una proteinuria massiva associata a ESRF è stata rilevata in 5 pazienti FTNS ed in 2 EPTS. Tuttavia una microematuria ricorrente e bassi livelli di proteinuria sono stati riscontratianche in casi MHA-SBS

•Le mutazioni ricorrenti (codoni 96, 702, 1155, 1165, 1424, 1841, 1933) rappresentano una percentuale dell’ 85% di tutte le mutazioni fino ad oggi identificate nel gene MYH9.

•Delezioni e mutazioni nonsenso o frameshift che risultano in unaprematura terminazione della proteina MYH9 non sono mai state descritte.

•La presenza di mutazioni nonsenso e frameshift solo nell’ultimo esone codificante per la parte C-terminale della proteina che contiene il dominio deputato ad assemblare le molecole di MYH9 in filamenti bipolari, suggeriscono come meccanismo patogeneticoun effetto dominante negativo.

•Tuttavia se il meccanismo patogenetico di queste malattie sia determinato da un meccanismo dominante negativo causato dalla alterata formazione di dimeri di miosina oppure dipenda da una aploinsufficienza resta ancora da dimostrare.

Kunishima S et al. “Immunofluorescence analysis of neutrophil Nonmuscle Myosin Heavy Chain-A in MYH9 disorders: association of subcellular localization with MYH9 mutations” Laboratory Investigation (2003)

Deutsch S et al.”Asp1424Asn MYH9 mutation results in an unstable protein responsible for the phenotypes in May-Hegglin anomaly/Fechtner syndrome”Hemostasis, Thrombosis, and Vascular Biology (2003)

Takubo T et al.”Expression of non muscle type myosin heavy polypeptide 9 (MYH9) in mammalin cells” European Journal of Histochemistry (2003)

Franke JD et al. “Rod mutations associated with MYH9-related disorders disrupt non-muscle myosin-IIA assembly” Blood (2004)

all subjects with mutations in the motor domainof NMMHC-IIA present with severe thrombocytopenia and develop nephritis and deafness before the age of 40;

while subjects with mutations in the tail domain have much lower risk ofnoncongenital complications and significantly higher platelet counts.

Mutations at residue 1933 do not induce kidney damage or cataracts and cause deafness only in the elderly;

mutations at residue 702 result in severe thrombocytopenia and producenephritis and deafness at a juvenile age;

alterations at residue 1424 or 1841 result in intermediate clinical pictures.

The work demonstrates that:

MYH9-related disease (MYH9-RD) is a rare autosomal dominant disorder caused by mutation in MYH9, the gene coding for the heavy chain of nonmuscle myosin IIA (NMMHC-IIA).

All patients present from birth with macrothrombocytopenia,but in infancy or adult life some of them develop sensorineural deafness, presenile cataracts, and/or progressive nephritis leading to end-stage renal failure.

COOH


COOH

heavy chains

lightchains

La Consulenza Genetica ed itest genetici nella pratica clinica

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