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IV° CONGRESSO LATTIERO – CASEARIO AI.T.e.L.

Latte e Derivati : ricerca , innovazione e valorizzazione

G. Bolzoni Centro Referenza Nazionale Qualità Latte Bovino

Legnaro (PD) 12/09/2014

Determinazione quantitativa di Cl. tyrobutyricum nel latte con tecniche biomolecolari : risultati preliminari e prospettive

D. Bassi , P.S. Cocconcelli – Università Cattolica sede di PC e CR

G. Delle Donne, E. Pavoni, G. Bolzoni - IZSLER Brescia

CLOSTRIDI SPORIGENI ANAEROBI

Nel secolo della globalizzazione (anche lattiero-casearia) un vecchio (e complicato) problema per pochi eletti

Industrializzazione della caseificazione, riduzione delle stagionature, incremento igiene del latte e standardizzazione delle flore microbiche ambientali, metodi analitici poco efficaci, influenza ridotta sulla sicurezza alimentare, limitate novità, poche possibilità di interventi correttivi e preventivi

G. Bolzoni - C.Ref. Naz. QLB - IZSLER Brescia- Airtel 2014

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SPORIGENI NEL LATTE


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Pagamento Latte Qualità Lombardia

3.300 allevamenti nel 1997 1.800 allevamenti nel 2014

( circa 40 % degli allevamenti controllati)

Principali fattori : Raccolta e Stoccaggio foraggi

Igiene di mungitura Lettiera ed ambiente stalla

Micro e Macroclima Alimentazione

Tabella 1 – Medie annuali qualità del la1e in Lombardia – CONFRONTO tra “secoli” 1985 1999 2012 2013

Sporigeni Anaerobi Spore/L 1.152 244 174 220

SPORIGENI NEL FORMAGGIO «GONFIORE TARDIVO»


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La notevole variabilità in Frequenza ed Entità rende difficile quantificare il danno produttivo

(differenze PR e GP, utilizzo forme alterate, tempi di comparsa)

Soprattutto differenze tra caseifici e tra periodi ( 1-4 % delle forme con ± 1000 % !!)

difficile anche definire con precisione causa-effetto •  Quali e quante spore determinano un danno quantificabile ? •  In quali condizioni ? •  Senza Lisozima (GP) ??

G. Bolzoni - C.Ref. Naz. QLB - IZSLER Brescia-Airtel 2014

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Malgrado decenni di ricerche e sperimentazione la relazione tra quantità e tipo di spore nel latte e tipo ed entità del danno nel

formaggio è tutt’altro che «robusta»

Tra i tanti motivi :

• ridotta accuratezza analitica del metodo di Screening (MPN) • la germinazione delle spore nella cagliata è variabile

• l’azione fermentante delle forme vegetative è variabile e condizionata dalle condizioni microambientali • l’azione di altri microrganismi ( sporigeni e non ) e di altri fattori tecnologici interagiscono con comparsa ed entità del gonfiore o La formalina prima, il lisozima poi ed il divieto di insilati condizionano le possibilità di indagine, tenendo sotto controllo relativo l’incidenza del problema

SPORIGENI NEL FORMAGGIO «GONFIORE TARDIVO»

Metodica tradizionale (J. Weinzirl, 1916; Annibaldi S. 1969, Frier & Halligan 1976)

o  VANTAGGI : Applicabile su grandi numeri di campioni a costi contenuti (strumentazione limitata,

competenze ridotte) ; Risultati aspecifici ma ormai consolidati in termini di significatività ; Migliorabile marginalmente con appesantimenti procedura ;

o  SVANTAGGI : Ridotta accuratezza , limitata ripetibilità, scarsa riproducibilità, tempi lunghi; Conteggio «Spore» aspecifico; Correlazione con danni caseari poco costante; Distribuzione dati «non normale» per elaborazioni statistiche, e valutazioni ; Variabilità procedura applicativa, soggettività esito; NOTA BENE : se utilizzato per una classificazione sul medio periodo del latte di un allevamento

«problema» rimane idonea all’uso; se utilizzata per valutare una tantum il latte ed i prodotti derivati non è sufficientemente efficace


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ALTRE METODICHE POSSIBILI

Microbiologia classica con varianti (terreni, condizioni, prove biochimiche di tipizzazione ) Conducibilità Metodiche Molecolari o Vantaggi : notevoli in termini di specificità, accuratezza , ripetibilità

o Svantaggi : applicabilità su ampi numeri, quasi sempre, limitata ; differenziazione spore e forme vegetative non sempre efficace/possibile NOTA BENE : per ricerche , approfondimenti, verifiche sono tutte idonee ; attualmente non ancora applicabili in termini routinari


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Polymerase Chain Reaction (PCR) e Real Time PCR

La Real Time PCR misura l'amplificazione del DNA in tempo reale (qrt-PCR) durante la fase esponenziale della reazione permettendo di «tenere sotto controllo» le reazioni aspecifiche (falso positivo) e, con l’ausilio di standard di calibrazione, può esprimere risultati quantitativi della presenza iniziale dei microrganismi target

proge.o di fa3bilità

applicazione rou<naria e sviluppo di metodiche biotecnologiche per la determinazione quan<ta<va di sporigeni anaerobi nel la.e

Base di Partenza : Numerose Esperienze e Proge3 di Ricerca Università Ca.olica S.C. di PC/CR; PRC 2007 IZSLER -‐ PCR qualita<va e semiquan<ta<va per Cl. sporogenes – Cl. butyricum – Cl. tyrobutyricum ; varie altre esperienze nazionali ed internazionali : - Quan@ta@ve Detec@on of Clostridium tyrobutyricum in Milk by Real-‐Time PCR L. Lopez-‐Enriquez, D. Rodriguez-‐Lazaro, M. Hernandez; ( 2007) – Appl. Environ. Microbiol. , vol. 73 no. 11 3747-‐3751 -‐ Iden@fica@on of Clostridium tyrobutyricum as the causa@ve agent of late blowing in cheese by species-‐specific PCR amplifica@on.) N Klijn, F F Nieuwenhof, et. al. ( 1995 ). Appl. Environ. Microbiol., vol. 61 no. 8 2919-‐2924 -‐ A direct PCR detec@on method for Clostridium tyrobutyricum spores in up to 100 milliliters of raw milk. L.M. Herman, J.H. De Block, G.M. Waes (1995) Appl. Environ. Microbiol., vol. 61 no. 12 4141-‐4146


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Metodica Analitica : Bassi D., Fontana C., Zucchelli S., Gazzola S., Cocconcelli P.S. «TaqMan real time-quantitative PCR targeting the phosphotransacetylase gene for Clostridium tyrobutyricum quantification in animal feed, faeces, milk and cheese» International, Dairy Journal, Vol 33 (1), November 2013

RISULTATI PRELIMINARI- FASE 1

Confronto Strumento/ mix reazione (qrt-PCR)

Confronto metodi estrazione DNA A.  Kit Qiamp Cador à manuale, numero limitato di campioni

per sessione B.  Bio-Robot Qiagen àautomatizzata, fino a 96 campioni

per sessione

A.  Strumento: Bio-Rad CFX 9600 B.  Strumento: Applied Biosystem 7300

Campione contenente 2x105 spore/mL di Cl. tyrobutyricum diluito serialmente in S.F.

gene pta di Cl. tyrobutyricum


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Strumento / Master Mix CAMP. Estrazione kit Qiamp Cador Estrazione con BIO-ROBOT

Bio-Rad CFX 9600

Prima replica (Ct/45)

Seconda replica (Ct/45)

Prima replica (Ct/45)

Seconda replica (Ct/45)

104 19,67 19,76 19,06 18,2 103 23,68 24,16 24,21 23,54 102 26,79 26,95 27,38 26,45 101 28,45 27,96 29,43 28,87 100 33,91 34,29 33,79 34,35 10-1 37,21 38,71 36,88 37,7 10-2 0 0 0 0

Applied Biosistem 7300

104 25,57 25,36 24,01 24,01 103 31,19 30,13 29,76 30,39 102 35,31 35,3 35,6 34,23 101 35,52 37,85 34,38 38,65 100 0 0 0 0 10-1 0 0 0 0 10-2 0 0 0 0

Equivalenza estrazione

RISULTATI PRELIMINARI

Ciclo Soglia


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RISULTATI PRELIMINARI- FASE 2 Prove di estrazione e RTQ-PCR in matrice latte

Allestimento Latte «bianco» per diluizioni : UHT microfiltrato centrifugato, risospeso in S.F. ; verificato con colorazione di Shaeffer & Fulton

Preparazione Campioni : 100 mL di latte bianco sono stati contaminati con 100 µL di sospensione di spore di Cl. tyrobutyricum ottenendo una concentrazione in sospensione di 2 x 104 spore/ 100 mL à ovvero 200 spore/mL (à 200.000 spore/litro : «Latte +104»)

seguito da diluizioni seriali analizzate in doppio.

Processazione Campioni : centrifugazione, sospensione pellet, estrazione DNA con Lysis Tubes L + QIAamp Cador Mini Kit


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RISULTATI PRELIMINARI- FASE 2 RISULTATI E STIMA SENSIBILITA’

Strumento/ Mix CAMPIONE

Bio

RA

d C

FX 9

600/

Q

uant

itec

Viru

s M

ix 1° replica (Ct/

45) 2° replica (Ct/

45) Latte bianco 0 0 Latte + 104 24,45 24,51 Latte +103 27,75 27,76 Latte +102 30,49 30,44 Latte +101 34,36 34,65 Latte +100 36,76 36,00 Latte +10-1 40,15 39,01

SPORE / LITRO Latte bianco 0 Latte + 104 200.000 Latte +103 20.000 Latte +102 2.000 Latte +101 200 Latte +100 20 Latte +10-1 2

FASE 3 – RISULTATI PRELIMINARI : confronto con MPN


CAMPIONE Semina 10 mL Semina 1 mL Semina 0,1 mL Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3

Latte bianco - - - - - - - - - Latte + 104 + + + + + + + + + Latte +103 + + + + + + + + + Latte +102 + + + + + - + + - Latte +101 + - + + + - + - + Latte +100 + - - - + - - - - Latte +10-1 - - - + + - - - -

CAMPIONE Spore/ L

Risultato Metodo MPN

Valore MPN spore/L Limiti di confidenza (95%)

inferiore Superiore

Latte bianco 0 < 30 0 94

Latte + 104 200.000 > 11.000 n.s. n.s.

Latte +103 20.000 > 11.000 n.s. n.s.

Latte +102 2.000 2.100 300 4.000

Latte +101 200 350 90 940

Latte +100 20 74 13 200

Latte +10-1 2 62 12 170

(Calcolo in base a ISO 7218:2007 Tabella B.5 )


CAMPIONE Semina 10 mL Semina 1 mL Semina 0,1 mL Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3

Latte bianco - - - - - - - - - Latte + 104 + + + + + + + + + Latte +103 + + + + + + + + + Latte +102 + + + + + - + + - Latte +101 + - + + + - + - + Latte +100 + - - - + - - - - Latte +10-1 - - - + + - - - -

Negativo 0 0 0 122

Positivo 188.000 ∞ 350.000 ∞

Positivo 19.200 ∞ 350.000 ∞

Positivo 3.000 24. 000 7.995 73.000

Positivo 201 406 160 1.033

Positivo 31 81 19 341

Positivo 4 66 16 272

FASE 3 – RISULTATI PRELIMINARI : confronto con MPN Calcolo in base a «Equation for MPN calculation program «

FASE 3 –Stima (!!!) confronto esiti


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CAMPIONE Spore/ L

Risultato qrt-PCR Risultato Metodo MPN

Qualitativo Quantitativo spore/L

Valore MPN spore/L

Limiti di confidenza (95%)

inferiore Superiore

Latte bianco 0 Negativo 0 < 30 0 94

Latte + 104 200.000 Positivo 188.000 > 11.000 n.s. n.s.

Latte +103 20.000 Positivo 19.200 > 11.000 n.s. n.s.

Latte +102 2.000 Positivo 3.000 2.100 300 4.000

Latte +101 200 Positivo 201 350 90 940

Latte +100 20 Positivo 31 74 13 200

Latte +10-1 2 Positivo 4 62 12 170

Conclusioni TECNICHE

qrt-PCR Metodo MPN

Limite sensibilità sperimentale 2 spore/Litro 30 spore/Litro (**)

Specificità

100% per Cl. tyrobutyricum

Da valutare effetti di interferenza con altri Clostridi

??? % Germi Sporigeni Anaerobi Gasogeni

( Gen. Clostridium, Gen. Bacillus)

Tempo analisi 24/48 ore 7 giorni

Carico di lavoro 180 cp / giorno 400 cp / giorno

Costo complessivo E’ Stimabile un costo complessivo qrt-PCR da 2 a 4 volte quello MPN (esclusa strumentazione)

NOTA BENE : la sensibilità diagnos@ca NON E’ CONFRONTABILE (target diverso e differenza procedura di calcolo)

PROSPETTIVE

•  Ulteriori studi applica<vi e di validazione sono indispensabili

•  In par<colare sono da valutare le possibilità di

assemblare in un’unica procedura anali<ca gli altri Clostridi target ( Mul<plex)

•  Più che sperimentazione di confronto/ correlazione con i risulta@ della metodica tradizionale (MPN), sarebbe par@colarmente necessario sperimentare la correlazione tra esi@ PCR e cara1eris@che qualita@ve delle forme e comparsa di gonfiore nel formaggio

T.H.M. CAMBIAMENTO

Tanto per cambiare

(le conseguenze sono spesso peggiora<ve)

Perché tu1o rimanga uguale

( Ga.opardo)

Per migliorare

Nel caso degli Sporigeni Anaerobi sembra possibile con

sperimentazioni tecnico-scientifiche e modifica del «punto di vista» pratico

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