Incontro con i Centri Trasfusionali della Regione MarcheAncona, 27 Maggio 2010

ALTRI PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO

TRASFUSIONALE:Raggiungere e Mantenere l’Eccellenza

Bruno BrandoDirettoreCentro Trasfusionalee Laboratorio di EmatologiaOspedale di Legnano (MI)bruno.brando@ao-legnano.it

Azienda Ospedaliera Ospedale Civile di Legnano

Membro dello Steering Committee

For Leucocyte Immunophenotyping

UKUK NEQAS

I PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO TRASFUSIONALE

• Blood Transfusion Laboratory Practice• Feto-Maternal Haemorrhage

• CD34+ Stem Cells• Low Level Leucocyte Count in leucoreduced products• Immune Monitoring Programme

• Leukaemia Immunophenotyping / MRD• Molecular Diagnostics• PNH Scheme

• General Haematology• Blood Coagulation

Di StrettaCompetenzaTrasfusionale

Laboratori diEmatologia oTrasfusionali

Ematologia eCoagulazione

Quanto lontano vogliamo andare?

Szechuan shoes: 3 € Church’s full brogues: 380 €

Mettiamo un po' d'ordine nella terminologia...

IQCIQC (Controllo Interno di Qualit(Controllo Interno di Qualitàà):):Esercizio autoprodotto o distribuito dalle Ditte del settore, che include materiali a vari livelli direattività attesa (es. Low, Med, High).Assicura la precisione e la riproducibilità dei dati.

VEQVEQ (Valutazione Esterna di Qualit(Valutazione Esterna di Qualitàà):):Esercizio promosso da Società Scientifiche, Regioni,Università, che si limita a descrivere la distribuzionedei dati analitici ottenuti dai partecipanti su campionia titolo ignoto inviati periodicamente.

EQASEQAS (External Quality Assurance Scheme):(External Quality Assurance Scheme):Valuta l'intero processo analitico, favorendo il passaggioa tests di migliori prestazioni. Di natura educazionale, ègestito solo da enti accreditati, che devono intervenire in caso di prestazioni insoddisfacenti. Punta al raggiun-gimento ed al mantenimento di risultati di eccellenza.

www.ilac.org

InternationalLaboratoryAccreditationCooperation

UK NEQAS ORGANISATION & ADVISORY STRUCTUREUK NEQAS ORGANISATION & ADVISORY STRUCTURE

HostAuthorities

UK NEQAS

Consultant Executive BoardAdvisor Trustees Joint

WorkingGroup

RegulatoryBody

CPA(UK) Ltd

local accountability(facilitation)

professionalaccountability

externalaccountability

(financial & policy)

co-ordinationand services

professionalaccountability

accreditationto standards

advise and support

UK NEQASSteering

committee

IndividualIndividualUK NEQASUK NEQASschemesschemes

other EQAS

INDIVIDUALLABORATORY

National QualityAssuranceAdvisory

PanelNQAAP

performancesurveillance

performancesurveillance

UKNEQAS QUALITY MANUAL

• Riassume tutte le modalità operative del sistema UKNEQAS e dei suoi

processi di certificazione e accreditamento.

• Revisionato ogni 6 mesi.

• Riporta tutti i criteri utilizzati per la definizione degli scores e dei livelli

prestazionali, richiamabili come riferimento nei propri sistemi qualità.

• Dà un’idea della complessità organizzativa e gestionale attualmente

richiesta ad un promotore di schemi EQA, a garanzia dei partecipanti.

• Può costituire una traccia per impostare un sistema qualità specifico

per i laboratori di citometria.

UK NEQAS for Leucocyte UK NEQAS for Leucocyte ImmunophenotypingImmunophenotyping

Seven Full Schemes:

Participants (5/10)

Immune Monitoring 645Leukaemia Phenotyping & Diagnosis 227+ 449CD34+ Stem Cell Quantitation 279Low-Level Leucocyte Counting 112Molecular Analysis of HaematologicalMalignancies 116+ 102Minimal Residual Disease 37PNH Analysis 99

Worldwide

CD 34 Scheme

CD34+

776 VERI CD34+

Flow-Count

CD45+

Cellule NUcleateCellule NUcleateCellule NUcleateCellule NUcleate

Gate su Cellule NucleateNO Beads

Gate su CD45+

Gate su Nucleate CD45+ CD34+

4089 BeadsCD34+ 45+ SSC Low

776 CD34+ eventi

4089 Bead eventix 1012 = 192 CD34+ PBSC/µL(# beads/µL)

Metodo EWGCCA – ISHAGE in Singola Piataformaper l’Identificazione e il Conteggio dei PBSC CD34+

Gate su Nucleate CD45+ CD34+ SSC Low

SSC/FSC SSC/CD45 SSC/LDS751

CD34+

0,012% 0,016% 0,018%

CALCOLO DEL VALORE PERCENTUALEDI CD34+

COEFFICIENTE DIVARIAZIONE (CV)TRA I DIVERSIDENOMINATORI:

30 - 80 % Per Valori di CD34+ Inferiori all' 1%

PROBABILMENTE IL MIGLIOR DENOMINATOREOGGI IDENTIFICABILE: LDS751 AND CD45LDS751 AND CD45

0 256 512 768 1024

Side Scatter ->

0 256 512 768 1024

Side Scatter ->

SOGLIA su LDS751

Consigliabile impostare la SOGLIA su LDS751

CONTEGGIO DEI PBSC CD34+ NELL’ AUTO- e ALLOTRAPIANT OApplicazioni e Pericoli

• Conteggi dei PBSC CD34+ in numerosi punti CRUCIALI del processo:

• Monitoraggio ripresa post-chemio

• Decisione di eseguire l’aferesi

• Calcolo della resa aferetica

• Calcolo del quantitativo raccolto nella sacca di aferesi

• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del congelamento

• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI dopo manipolazioni (purging)

• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del TRAPIANTO

• Applicazioni extra-trapianto del conteggio dei CD34+ periferici

IL VERO PERICOLO E’ QUELLO DI SOVRASTIMARE I CONTEGGI DI CD34+

(Raccolgo con troppo poche cellule, Credo di avere raccolto abbastanza, Credo di avere CD34+ vitali a sufficienza...)

Comparative Analysis of Comparative Analysis of InterInter--LaboratoryLaboratoryCVs for CD34CVs for CD34++ Enumeration by PlatformEnumeration by Platform

Sample All Dual Single

A 44.2% 44.2 36.9

B 30.2% 32.6 4

C 26.9% 26.9 22.8

D 29.7% 29.7 23.9

E 38.5% 30.8 21.4

F 18.8% 19.0 4.9

G 31.3% 25 25

H 18.9% 22.3 3.1

I 27.3 27.3 25

Effect of Gating Strategy

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

6 9 12 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53

Trial6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57

0.00 CD34+0.00 CD34+

UKUK NEQAS

Trial CV%ISHAGEBender protocolMilan protocol

VA

LUE

(A

BS

6 C

V%

)

57%32%

1%

1%

2%1%

5%

1% Correct

Missing gate

Gating on wrong parameter

Using wrong antibody

Missing plot and gate

Wrong gate and parameter

Wrong gate and parameter andmissing gate

Using different protocol to thatstated

Inchiesta su COME viene usato il protocollo ISHAGEdai partecipanti allo schema UKNEQAS CD34+

CD34 SchemeCytometry Part B 2008; 74B: 364-376

Conta solo il valore assolutodi CD34+

Ex 0706Issued both with CD34 stem cell counts <10 cells/ul

We have relaxed the scoring system to reflect the degree of difficulty in these samples

Ex 0801Please note if you are a UK laboratory our Steering Committee and the Haematology NQAAP require all UK laboratories to use a single platform approach when undertaking CD34 stem cell enumeration.

Effect of Instrument Service on Performance

0

5

10

15

20

25

30

35

40

031 033 035 037 039 041 043 045 047 049 051 053 055 057 059 061 063 065

Trial

Run

ning

Sco

re

OneYear

OneYear

OneYear

Service Performed

Partecipante A B C D E F G H

Esercizio

O702

O703

O704

O705

O706

O801

O802

O803

Non Return

Outlier

CD34 Scheme: Italian UPs & PUPs

Qualcuno sembra non volere fare sforzi per migliorare...

Cellule CD34+ nelSangue PerifericoNORMALE

DONATORI (19-65a)NORMALI (n= 35)

%Mean = 0.063 %ABS Mean = 4.41 /μL± SD ABS = 0.42Mean CV % = 7.7%%min = 0.01%%Max = 0.13%

ABS min = 0.01/μLABS Max = 6/μL

CV dei Replicati= 5 – 15%

R4

R1

R3

R1

R3

R2

300.000eventiacquisiti

0.0130 – 3200 – 1420

2.0 – 10.03.0 – 57.1

4.112.6

<0.00115 (25)29 (59)

Number of Cytopenias0 – 12 - 3

<0.0010 – 762.4 – 1717.4 - 1420

1.0 – 13.64.0 – 25.215.0 - 128

3.710.882.2

<0.00122 (30)11 (52)11 (84)

Bone Marrow Blasts (Microscopy)< 5%

5% - 10%11% - 20%

<0.0010 – 14200.6 – 1711 – 320

1.7 – 11.74.6 – 37.3

16.9 – 57.8

4.037.357.8

<0.00122 (27)19 (20)13 (93)

Karyotype ClassGood Outcome

Intermediate OutcomePoor Outcome

<0.0010 – 30.50 – 86.9

7.4 – 1420

1.2 – 6.41.7 – 14.3

18.2 – 85.4

3.24.158.5

<0.0015 (12)16 (38)23 (92)

IPSS ClassLow Risk

Intermediate Risk-1Intermediate Risk-2 / High Risk

# and % of pts withCD34+ > 10/µL

# (%) p-value Median 25 th-75th perc Range p-value

Circulating CD34+ / µL

Circulating CD34+ Cells in MDS patients stratified by IPSS and its determinants

Cesana C, Klersy C, Brando B et al. Leuk Res 2008; 32: 1715 - 1723

Long-term overall survival of MDS patients according to baseline CD34+ cells / µL

Months

Cum

ulat

ive

Pro

port

ion

Sur

vivi

ng

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80 100 120 140

Circulating CD34+ Cells </= 10/µL

Circulating CD34+ Cells > 10/µL

P<.0001

Cesana C, Klersy C, Brando B et al. Leuk Res 2008; 32: 1715 - 1723

Passamonti F. et al. Haematologica 2003; 88: 1123 – 1129.

Discrimine attornoa 15 CD34+ /µL

Low Level Leucocyte Scheme - LLLC

Conteggio dei Leucociti Residui

negli Emocomponenti Leucodepleti

PROBLEMI CAUSATI DAL TRASFERIMENTO DIWBC RESIDUI NELLA TRASFUSIONE

• Reazioni Febbrili (Ridotte dalla lavorazione Top&Bo ttom)

• Trasferimento di Microrganismi (CMV, EBV, HSV, Toxo ...)

• Trasferimento di Prioni (Creutzfeld-Jacob Variants)

• Immunizzazione ANTI-HLA (Trapianti d’organo solido )

• Refrattarietà Piastrinica (Pazienti oncologici)

• Reazione GVH Acuta Trasfusionale (pz immunodepressi )

• Immunosoppressione Trasitoria (Immuno-modulazione)

CD4+ T Cells

CD34+ PBSC

WBC Residui

10 - 50%

0.01 - 6.0%

-

50 - 2000 /µL

0.1 - 350 /µL

0.00 - 5 /µL

% / µL

Range Valori

• Diversi range di valori % e /µL• Diverse richieste in termini di precisione

• Diversi setup strumentali

UnUn’’unitunitàà di Emazie prefiltrate deve venire DECLASSATAdi Emazie prefiltrate deve venire DECLASSATAse il conteggio di WBC Residui se il conteggio di WBC Residui èè = > ~ 3 Cells / = > ~ 3 Cells / µµLL

ACCEPTABLE RESIDUAL CELL LEVELSIN PLASMA (Obtained by Fractionation)

EC law 2002 / 98

• Red Cells < 6 x 10 9 / Liter (< 6000/µL)

• White Cells < 0.1 x 10 9 / Liter (< 100/µL)

• Platelets < 50 x 10 9 / Liter (< 50000/µL)

Fresh Frozen Plasma obtained by fractionation cantransfer residual cells which may enhance anti-RBC,anti-PTL and anti-HLA responses.Apheresis Plasma is virtually cell-free.

500 µLSTAININGMEDIUM

100 µLANY

BLOODPRODUCT

100 µLFlow -CountBEADS(Or TruCOUNTTube)

500 µLSTAININGMEDIUM

5 µLANY

NORMALPLASMA

500 µLSTAININGMEDIUM(Plus Beads)

+CTRL

–CTRL

TIPS & TRICKS

* Staining is Almost Immediate* Run NEGATIVE CTRL First* Pass RINSE Solution after

running Positive CTRL or aftera rWBC-Rich sample

* Process ≥≥≥≥ 15 µL raw sample

Medium di Colorazione DNA - WBC Residui

• Sodio Citrato 1g / Litro

• Propidio Ioduro 50 mg / Litro Sigma P 4170

• IGEPAL CA630 200 µL / Litro Sigma I 3021

• RNAsi A III 6 mg / Litro Sigma R 5125

Preparare 100 mL alla volta, filtrare con 0.22 µm M illipore,

Conservare a 4 °°°° C in vetro scuro, stabile ≥≥≥≥ 1 mese.

Marker Events MeanAll 22884 1496.19

rWBC 39 94.50Beads 20845 1499.88

res WBC

rWBC

Beads

BEADS

FLOWCOUNT 1026/µL

Flow-Count

Beads

rWBC = 39 / 20845 * 1026 = 1.91/µL

Flow -Count

Marker Events CVAll 10947 27.37

rWBC 842 10.48Beads 10105 5.83

res WBC

rWBC

Beads

BEADS

WBC Residui negli Emocomponenti Leucodepleti

rWBC = 86.8 /µL(Declassare la sacca!)

Pro

pidi

o Io

duro

LLLC SCHEME:

6 Invii / anno

3 Emazie Concentrate +3 Concentrati PiastriniciLeucodepleti ogni invio

LLLC SCHEME:

Possibile tenere sottoEQA due strumenti odue sistemi analitici diversi

Manufacturer Mean rWBC/µL rWBC/Unit x10^6 % Rejected Proces s Time

Baxter 1 0.001 ± 0.003 0.0003 ± 0.0001 0 6.2 min

Baxter 2 3.09 ± 2.86 0.83 ± 0.75 30 11.2 min

Braun 5.97 ± 4.20 1.53 ± 1.17 70 5.2 min

Fresenius 1 1.72 ± 1.55 0.47 ± 0.44 20 7.6 min

Fresenius 2 0.86 ± 0.59 0.23 ± 0.19 0 8.7 min

Pall 2.48 ± 1.58 0.67 ± 0.47 20 5.2 min

Terumo 2.59 ± 2.04 0.67 ± 0.59 20 6.9 min

Studio di comparazione di 7 diversi sistemi di filtrazione in-linea(Gara di aggiudicazione - Sacche quadruple con filtro)

Valutata una campionatura di 10 sacche per ogni concorrente.Parametri valutati: Recupero emazie, Emazie residue nel filtro,Tempo di processamento, rWBC/µL e rWBC/Unità.

Immune Monitoring Scheme

Ex # - sample CD4+ ABS CD4+ %

0801-196 280 9,9

0801-197 217 28,3

0802-198 56 2,7

0802-199 100 4,5

0803-200 306 20,1

0803-201 828 53,8

0804-202 804 55,3

0804-203 740 51,7

0805-204 228 19,2

0805-205 186 13,8

Il processamento dei preparati cellulari con Clinimacs Miltenyipermette di generare campioni con valori di CD4 anormali

EX 0801: Ultimo con il calcolo dello Score Cumulativo

EX 0802: Nuova modalità di calcolo dello Score

• Scorporando gli scores per CD3, CD4 e CD8 emerge ilcontributo relativo delle varie misure.

• Valori Assoluti e Percentuali (singola piattaforma) possonoseguire trends differenti

UK NEQAS for Leucocyte Immunophenotyping

CV della Conta Percentuale di CD4+ nel TempoUtilizzatori di "Leukogate" CD45/CD14

0

5

10

15

20

25

30

35

40

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Trial

cv

Tutti i partecipanti Utilizzatori di

Gate CD45 / CD14

Introduzione delGate CD45 / SSC

Effetto dell'introduzione di cambiamentinella pratica di lavoro

Introduzione delleguardie notturne

Ospedale Niguarda 2002-2003

Immune Monitoring Scheme

Immune Monitoring SchemeCytometry Part B 2008; 74B: 364-376

UK NEQAS and IQA (Duke) have reported the introduction of VERIQAS, a CD4+ T lymphocyte training panel using stabilized whole blood specimens that provides immediate feedback via an interactive website.

Ex # # Outliers

O805 28

O804 24

O803 19

O802 23

O801 24

Immune Monitoring SchemePoor Performers & Persistent Poor Performers

Italia

immune Monitoring Ex 0805

All

immune Monitoring Ex 0805

All

Italia

Leukaemia Immunophenotyping

& Diagnostic Interpretation

CORE ANTIGENS:

6 Antigeni Obbligatori

GENERANO SCORE

RECOMMENDEDANTIGENS:

8 Antigeni Raccomandatima NON Obbligatori

GENERANO SCORESOLO QUELLI TESTATI

Zoom INZoom OUT

Open Imagein new window

0603

28 – April - 200610 – April - 2006

ReportO

ptio

nal

Rec

omm

ende

dC

ore

Ex. 0504: PROBLEMI

Ex. 0504: PROBLEMI

Per la difficoltà di accettare il criterio BCSH di definizione dei positivinelle distribuzioni omogenee di fluorescenza, si tende a riportare valori"polarizzati" attorno a 0% (neg) e 100% (pos). E' un problema!

Trial 0801

Trial 0805

Diagnosi controversa !FISH showed a deletion of 11q23

Diagnosi controversa ! (1) Trial 0805

DLBCL or MZL

Diagnosi controversa ! (2) Trial 0805

B-PLL dd spMZL w/oVL or MCL blast var

Diagnosi controversa ! (3) Trial 0805

B-PLL

Questions Raised by Leukaemia Scheme # 0904

• Why the slide is submitted to expertevaluation “in isolation of all otherclinical or laboratory information” ?

• Auer rods were noted by the expertreviewer in the slide, but they were undetectable in the digital images (both at Immunophenotyping and

at Diagnostic Interpretation).

• How to evaluate Myelodysplasia-related leukaemia if the availabledigital images were just peripheralblood with no other maturation lines?

• Is there any Cytometric cutoff valuefor Myeloperoxidase? (i.e: 3%, 5%,20%?....)

DOMANDE E PROBLEMILeukaemia Scheme # 0904

• Perché il revisore esperto valuta il vetrino “isolatamente da altri dati clinici e di laboratorio” ?

• Corpi di Auer sono stati notati dal revisore sul vetrino, ma erano assenti nelle immagini digitali fornite.

• Come diagnosticare una LAM MDS-correlata, se le immagini disponibili sono solo periferico senza altre lineematurative?

• Quale può essere oggi il valore di cutoff Citometrico per la Mieloperos-sidasi? (i.e: 3%, 5%, 20%?....)

Questions Raised by Leukaemia Scheme # 0906

• Case # 0906 was referred to UKNEQASas a MANTLE CELL Lymphoma.

• 53% participants diagnosed Mantle CellLymphoma, according to a phenotypicscore system (Leukemia 1994;8:1640).

• No t(11;14) nor Cyclin D1 status wereavailable. MCL is usually FMC7+ and CD79b+ (case 0906 was negative forboth). sIg intensity level is not easilyevaluable in stabilized samples.

• At the end of the diagnostic workup,Case # 0906 was reclassified by thereferring clinical Centre as a “Heavy disease load of lymphoma, B- chronic lymphocytic leukaemia / smalllymphocytic lymphoma” !

DOMANDE E PROBLEMILeukaemia Scheme # 0906

• Il Caso # 0906 è stato riferito a UKNEQAS come un NHL Mantellare.

• Il 53% dei partecipanti ha diagnosticatoun Linfoma Mantellare, probabilmenteseguendo i criteri di score fenotipico indicati in Leukemia 1994;8:1640.

• Non erano riportati dati su t(11;14) nésu Ciclina D1. MCL è di solito FMC7+ e

CD79b+, ma il caso 0906 era negativo.L’intensità delle sIg non è ben valutabilenei campioni stabilizzati.

• Sulla base di una BOM il centro clinicoha quindi riclassificato il caso 0906 come: “Infiltrato linfomatoso di alto grado da LLC-B / Linfoma Linfocitico a Piccole Cellule” !

SOMMARIO Esercizi 0705 - 1002

• Ingresso della Dssa Wendy Herber (Cambridge) nello steering committee ha migliorato l’analisi morfologica dei casi.

• L’elenco di ‘Core Antigens’ e di ‘Optional Antigens’ indica la traccia cheun ematologo esperto potrebbe dare al suo laboratorio di citometria perottimizzare il pannello di marcature (economia!).

• Emerge in alcuni casi un forte effetto ‘Clone’ o ‘Fluorocromo’, conimpatto sulla qualità dei risultati.

• Si rileva una notevole ‘sensibilità’ da parte di partecipanti (italiani e non)sugli scores generati anticorpo per anticorpo: fino a 100 per ciascun anticorpo non c’è da allarmarsi . Scores sistematicamente alti per singoli anticorpi possono indicare scarsa sensibilità o poca specificità dei coniugati impiegati.

Molecular Diagnosis

of Haematological Malignancies

JAK2 Scheme

Pilot PNH Scheme

PNH SchemePNH Scheme

Developing biological control material for internal & external quality assurance.

withDr S. Richards, HMDS, Leeds

23%

10%

66%

25%

11%

64%

Day 1 Day 113

Stabilised PNH Granulocytes

Stabilised PNH Red CellsStabilised PNH Red Cells

PNH Pilot StudyPNH Pilot Study

• Issued to 90 sites. 58 returned results.• Small minority of participants could not detect a PNH

clone.• Two participants detected a PNH clone with the

normal sample issued.• CD 59 was used by 83% of participants for the

detection of the red cell clones.• CD 55 and 59 was used by 80% of participants for

the detection of the granulocyte clones.