Informe caseina

7/26/2019 Informe caseina

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UNIVERSIDAD DEL CAUCAFACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA

EDUCACIÓNDEPARTAMENTO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMCA I: BIOMOLECULAS

Elaborado por: Brandon Rosero López ([email protected])

Determinación cuantitativa de proteínas y determinación

cualitativa de Caseína.

1. Objetivos.

Determinar la concentración de muestras problemas y muestras conocidas a partir de una curva de calibración

Realizar el procedimiento de separación de la caseína se!n su punto isoel"ctrico.

2. Resultados

Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 30 0,000 0,00 0,00

10 0,011 0,007 0,013

20 0,017 0,012 0,017

30 0,029 0,02 0,019

40 0,03 0,025 0,024

50 0,036 0,031 0,032

Tabla 1. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión sin o!r", cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos a 2%0 nm&


10 0,009 0,1% 0,002

20 0,012 0,00% 0,023

30 0,015 0,016 0,09

40 0,024 0,3 0,01150 0,026 0,052 0,035

Tabla 2. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión con

o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos a 760 nm&

Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .



Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 20 0,000 0,000

10 0,003 0,004

20 0,006 0,007

30 0,00% 0,00%

40 0,011 0,011

50 0,012 0,013

Tabla 3. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión sin

o!r"& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos


10 )0,026 0,002 )0,027

20 )0,026 0,003 )0,02%

30 )0,015 0,005 )0,02%40 )0,02% 0,010 )0,01%

50 0,012 0,042 )0,010

Tabla . Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión con

o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&


50 0,049 0,033

100 0,0%0 0,071

150 0,115 0,104200 0,147 0,136

250 0,1%3 0,170

Tabla !. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión sin

o!r"& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos


50 )0,007 0,056

100 0,05% )0,016

150 0,121 0,002

200 0,19% 0,02%

250 0,202 0,196

Tabla ". Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con

o!r" un tiempo de reacción de 10 min&





50 )0,004 0,050

100 0,074 )0,010

150 0,12% )0,002

200 0,217 0,047

250 0,23% 0,236

Tabla #. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con

o!r" un tiempo de reacción de 30 min& as absorbencias #ueron tomadas por di#erentes

$rupos


50 0,044 0,029

100 0,020 0,0%2

150 0,127 0,117

200 0,163 0,155

250 0,19% 0,200

Tabla $. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión sin o!r", cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&


50 0,013 )0,03

100 0,0%9 0,025

150 0,091 0,043

200 0,14% 0,131

250 0,1%2 0,15%

Tabla %. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con

o!r" " un tiempo de reacción de 10 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&


50 0,050 0,01%

100 0,075 0,077

150 0,110 0,10%

200 0,1%5 0,11%250 0,244 0,160

Tabla 1&. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con

o!r" " un tiempo de reacción de 30 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&




3. An*lisis y resultados.

La determinación de la concentración de proteínas es com!n en los laboratorios. E#isten

diversos m"todos para dic$a operación% entre ellos podemos encontrar el m"todo de Biuret%el m"todo de &zul de 'oomasie% el m"todo de Lory% cada uno tiene una determinadasensibilidad% pero este !ltimo (Lory) combina el reactivo de Biuret y el reactivo de olin%lo *ue proporciona una me+or sensibilidad al m"todo.

En eneral el m"todo se desarrolla en unos determinados pasos estandarizados% se iniciacon la ,abricación de una curva de calibración% para ello es necesario la utilización de un patrón% en nuestro caso se utilizaron - patrones% primero la &lbumina y la seundo lacaseína% posteriormente se realiza una lectura en el espectro,otómetro el cual arro+ara unvalor determinado de absorbancia de cada patrón% ,inalmente con el previo tratamiento de lamuestras problemas se realiza la lectura de absorbencias% las cuales con la ayuda de laecuación de las curvas de calibración se determina su concentración.

Las reacciones *uímicas ocurridas en la e#perimentación se presentan y se describen acontinuación. El m"todo de Lory inicia con la adición del reactivo de Biuret a lasmuestras a traba+ar% el reactivo de Biuret est compuesto por una disolución bsica desul,ato de cobre ('u/01) lo cual permite la ,ormación de un comple+o oranometlicodonde el centro metlico ser el 'u-2% los pares electrónicos presentes en los tomos de 3itróeno se coordinan al centro metlico% adems debido a la eometría plana del enlace peptídico y la tetra$"drica del carbono 4% los cuatro enlaces coordinados entre losnitróenos y catión cobre (55) solo es posible si en la cadena de 46aminocidos e#isten dos%tres o ms enlaces peptídicos se!n se trate de una estructura $"lice o pleada de la proteína. La coordinación de los cationes cobre (55) se repite sistemticamente a lo laro detodo la estructura de cadena proteica. El medio bsico en el cual est presente el /ul,ato de'obre% permite la ,ormación de $idró#ido de cobre ('u(07)-) el cual se disocia como 'u-2

y -076% por lo tanto $ay iones c!pricos presentes en solución acuosa para poder reaccionar%adems de ello evita la reducción a 'obre (5).

+i,ura 1. Reacción del reactivo de iuret con los enlaces pept(dicos&




8ara aumentar la sensibilidad de la reacción de Biuret% el comple+o proteína6'u-2 se $acereacciona con el reactivo de ilon6 'iocalteus% dando una coloración azul% con un m#imode absorción de 9; nm <=>. Esta coloración se atribuye a la reducción del ?cido,os,omolibdico ,os,otunstico a azul de $eteropolimolibdeno de composición no de,inida por medio de los residuos tirosilos% tripto,anilos% ye una menor rado% cisteínilos e $istidilos

de la proteína *ue ,orman comple+o con 'u

-2

<->

. Anas determinadas características delm"todo de Lory son la intensidad de la coloración% *ue varía con la composición deaminocidos de de la proteína% es ms sensible *ue el m"todo de Biuret. El rano es de ;%=6= mmL. <-> la reacción de Lory se puede represar mediante el siuiente es*uema (,iura-).

+i,ura 2. s/uema para la reacción de o!r"&

La e#perimentación para esta prctica se realizó en dos sesiones en la primera sesión no seobtuvieron los resultados esperado% debido a una serie de errores e#perimentales cometidos por cada rupo de traba+o% uno de ellos ,ue el no desenrasado de las muestras de caseína%la cual se e#tra+o en ,unción del punto isoel"ctrico% otro error *ue se cometió ,ue el tiempode reacción para Lory% cada rupo no se sincronizo para poder obtener un buen resultado%los valores obtenidos en esta sesión se reportaron en las tablas =% -% % 1% == y =-.

/e tomó un rano de concentraciones para las curvas de calibración de ; a ; ppm% *ue esun rano muy pe*ueCo para las muestras% en las ,iuras se representan las curvas decalibración realizadas para la alb!mina (tabla =) en donde la absorbancia - corresponde latomada por mi rupo. /e realizó una comparación entre etas tres r,icas y se obtiene *uela me+or ra,ica para representativa es la *ue nosotros realizamos debido a *ue elcoe,iciente de 8irson (R -) posee una mayor linealidad *ue las dems (ver tabla =).

Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3

Coe-iciente de

earson / R2 0 0,957 0,997 0,934

cuación de la

recta "0,000711 0,002714 " 0,000602 0,000333 " 0,000557

0,00357

Tabla 1!. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 3&




0 10 20 30 40 50 00

0!01

0!01

0!02

0!02

0!03

0!03

0!04

0!04

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A"#$"%&'(% 3

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+

Concentracion / ppm

Absorbancia

+i,ura 3. 'omparación entre las curvas de calibración para la tabla 1&

& las mismos patrones se les adiciono el reactivo de Lory *ue se tomó un tiempo dereacción apro#imadamente durante =; minutos% los resultado de esta parte de lae#perimentación se consinan en la tabla -. /e procedió a ra,icar los datos obtenidos paracada rupo% la r,ica 1 re,le+a los datos presentes en la tabla -. La absorbancia -corresponde a la tomada por nuestro rupo.

0 10 20 30 40 50 00

0!01

0!02

0!03

0!04

0!05

0!0

0!0-

0!0.

0!0/

0!1

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A"#$"%&'(% 3

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+

Concentracion / ppm

Absorbancia

+i,ura . 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 2&




/i comparamos estas tres curvas de calibración la me+or se para ,iura 1 (ver tabla =9) se puede observar *ue la curva de absorbancia = posee me+or linealidad *ue las dems por lotanto es la me+or


Coe-iciente de

earson / R2 0 0,964 0,7%3 0,1%2

cuación de la

recta " 0,000509 0,001619 " 0,000%69 ) 0,00104% " 0,000769 0,007619

Tabla 1". 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 4&

La muestra para la curva de calibración de 'aseína se realizó por di,erentes rupos endonde como patrón primario se utilizó caseína con un buen porcenta+e de pureza% en la tabla

se representan las absorbancias de cada concentración obtenida% se representaron lasr,icas correspondiente en la ,iura % en la tabla = se especi,ica las características de la,iura .

0 10 20 30 40 50 00

0

0

0!01

0!01

0!01

0!01

0!01

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

Concentracion / ppm

Absorbancia

+i,ura !. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 3&

Absorbancia 1 Absorbancia 2

Coe-iciente de

earson / R2 0

0,9%4 0,975

cuación de la " 0,000246 0,000524 " 0,000249 0,000952




recta

Tabla 1#. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 5&/e!n la ,iura y la tabla = la me+or linealidad la representa la absorbancia =. & los patrones se les adiciono Lory y se de+ó reaccionar durante =; min y se obtuvieron los

datos *ue estn consinados en la tabla 1% se compararon estos datos con una r,ica *ue serepresenta en la ,iura 9 y las características de las r,icas se representan en la tabla =.

0 10 20 30 40 50 0

0!04

0!03

0!02

0!01

0

0!01

0!02

0!03

0!04

0!05

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A"#$"%&'(% 3

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+

Concentracion / ppm

Absorbancia

+i,ura ". 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 4&


Coe-iciente de

earson / R2 0

0,0445 0,631 0,011

cuación de la

recta

" 0,0001%6 ) 0,01%476 " 0,000674 ) 0,006524 " )0,000066 ) 0,016%57

Tabla 1$. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 6&

La ra,ica *ue posee mayor linealidad es la de absorbancia -.

En la seunda sesión se lleó a un acuerdo por cada rupo en donde se acordó una me+or sincronización% un desenrasado de muestra de caseína% y la corrección para laconcentraciones de la curva de calibración% los resultados obtenidos en esta sesión seconsinaron en las tablas %9% % % F y =;. &$ora se proceder de la misma manera parara,icar y comparar los resultados de di,erentes rupos% y posteriormente a este se comparar los datos de la primera sesión con los de la seunda sesión.




La ra,ica muestra la comparación de los resultados de la tabla *ue corresponde a lacurva de calibración de la &lb!mina% en la tabla =F se representa las características de la,iura . 'abe resaltar *ue la absorbancia ,ue tomada por nuestro rupo

0 50 100 150 200 250 3000

0!02

0!04

0!0

0!0.

0!1

0!12

0!14

0!10!1.

0!2

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

Concentracio / ppm

Absorbancia

+i,ura #. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 5& Albumina sin o!r"

se$unda sesión&

Absorbancia 1 Absorbancia 2Coe-iciente de

earson / R2 0

0,995 0,999

cuación de la

recta

" 0,000711 0,006%10 " 0,0006%1 0,000524

Tabla 1%. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 7&

/e concluye *ue la r,ica &bsorbancia - posee mayor linealidad. /e adicionaron a los patrones el reactivo de Lory y se tomó un tiempo de reacción de =; minutos% estos datosestn consinados en la tabla 9% la ,iura y la tabla -; representan las características de las

r,icas.


Coe-iciente de

earson / R2 0

0,935 0,3%7

cuación de la

recta

" 0,000965 ) 0,02523% " 0,000522 ) 0,020952




Tabla 2&. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura %&

0 50 100150200250300

0!05

0

0!05

0!1

0!15

0!2

0!25

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

Concentracion / ppm

Absorbancia

+i,ura $. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 6& Albúmina con o!r"

con 10 min de reacción, se$unda sesión&

La ra,ica absorbancia = posee la me+or linealidad. /e tomó un tiempo de reacción de ;minutos los resultados estn consinados en la tabla % se compararon las dos absorbanciastomadas y estas se presentan en la ,iura F y en la tabla -=.

0 100 200 3000!05

0

0!05

0!1

0!15

0!2

0!25

0!3

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

'#&')&$%'(#&

A"#$"%&'(%




+i,ura %. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 7& Albúmina con un

tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&


earson / R2 0

0,9525 0,45%2

cuación de la

recta

" 0,0011 ) 0,0274 " 0,0007 ) 0,0307

Tabla 21. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 9&

8ara la curva de calibración de la caseína se tomaron las mismas concentraciones y se prepararon los patrones% primero se midieron las absorbancias sin Lory estos datos seconsinaron en la tabla % se representaron los datos en la ,iura =; y las características de

estas se representaron en la tabla --.

0 50 100 150 200 250 3000

0!05

0!1

0!15

0!2

0!25

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

C#&')&$%'(#&

A"#$"%&'(%

+i,ura 1&. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla %& 'ase(na sin o!r", se$unda sesión&


Coe-iciente de

earson / R2 0

0,903 0,996

cuación de la

recta

" 0,000% ) 0,0119 " 0,000% ) 0,003%





De la misma manera se representaron los valores de la tabla F *ue corresponden a untiempo de reacción de =; minutos.

0 50 100 150 200 250 300

0!05

0

0!05

0!1

0!15

0!2

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A( T(6)

A( T(6)

+i,ura 11. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 9, 'ase(na con untiempo de reacción de 10 min, se$unda sesión&


Coe-iciente de

earson / R2

0

0,960 0,%603

cuación de la

recta

" 0,000% ) 0,0069 " 0,0007 ) 0,0377


8ara un tiempo de reacción de los patrones con caseína de ; minutos los datos obtenidosse representan en la tabla =;% se ra,icaron los datos (,iura =-) y las características serepresentaron en la tabla -1.


earson / R2 0

0,972 0,96%

cuación de la

recta

" 0,0009 ) 0,0079 " 0,0006 ) 0,0006





0 50 1001502002503000

0!05

0!1

0!15

0!2

0!25

0!3

A"#$"%&'(% 1

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+

A"#$"%&'(% 2

L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

C#&')&$%'(#&

A"#$"%&'(%

+i,ura 12. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 10& 'ase(na con o!r"

con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&

En comparación de las dos sesiones de traba+o en la seunda sesión se obtuvo un resultadome+or% debido a *ue se tuvo un mayor cuidado de traba+o% se tomaron las me+ores ra,icasde cada sesión teniendo en cuanta el coe,iciente de 8earson *ue se encuentran en lasrespectivas tablas para cada r,icas y se compararon en las ,iuras =%=1 y = y=9% no se puedo comparar los tiempos de reacción de ; min debido a *ue solo se realizó una vez% enla seunda sesión% pero si se observan sus respectivos coe,icientes de 8earson $ay unasabsorbancias *ue poseen mayor linealidad.

0 50 1001502002503000

0!020!04

0!0

0!0.

0!1

0!12

0!14

0!1

0!1.

R7 8 1

R7 8 1P$()$% ) (#&

L(&)%$ *P$()$% ) (#&+

S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

C#&')&$%'(#&

A"#$"%&'(%




+i,ura 13. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión

para la Albúmina sin o!r"&

0 50 100 150 200 250 300

0!05

0

0!05

0!1

0!15

0!2

0!25

R7 8 0!/

R7 8 0!/4

S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

P$()$% ) (#&

L(&)%$ *P$()$% ) (#&+

C#&')&$%'(#&

A"#$"%&'(%

+i,ura 1. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la Albúmina con o!r" " 10 min de reacción&

0 50 100 150 200 250 3000

0!05

0!1

0!15

0!2

0!25

R7 8 1

R7 8 0!/.

P$()$% ) (#&

L(&)%$ *P$()$% ) (#&+

S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

A( T(6)

A( T(6)

+i,ura 1!. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la 'ase(na sin o!r"




0 50 100 150 200 250 3000

0!02

0!04

0!0

0!0.

0!1

0!12

0!14

0!1

0!1.

0!2

R7 8 0!/

R7 8 0!3

P$()$% ) (#&

L(&)%$ *P$()$% )(#&+

S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

C#&')&$%'(#&

A"#$"%&'(%

+i,ura 1". 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión

para la 'ase(na con o!r" " un tiempo de reacción de 10 min&

La comparación de los traba+os realizados en la primera y la seunda sesión permitenobserva la ran di,erencia e#istente% anteriormente se $an nombrado aluno problemas *ue,ueron correidos para poder obtener un me+or resultado el cual es muy evidente% adems se puede observar *ue una curva de calibración sirve siempre y cuando en el lote de traba+olos paramentos utilizados sean constantes% en otras palabras *ue no cambien nin!nreactivo% o al!n paso de la e#perimentación% o la calibración del espectro,otómetro y $astalos e#perimentadores./e de,ine sensibilidad como la pendiente de la curva de calibración de inter"s% estade,inición aceptada por la 5A8&' <=>% aun*ue esta tambi"n est dada por los límites dedetección y los límites de cuanti,icación% en la tabla - se comparan las pendientes de lasrectas de las r,icas de la seunda sesión de traba+o./i se observa las pendientes *ue corresponden a la adición de Lory poseen un mayor rado de sensibilidad% *ue es el resultado esperado.

'uestra in (o)ry 1& min con (o)ry 3& min con (o)ry

Albúmina 0,0006%1 0,000965 0,0011

'ase(na 0,000%0 0,000%0 0,0009




Tabla 2!. 'omparación de la sensibilidad de las curvas de calibración realiadas en la

se$unda sesión, se tomaron las pendientes de las meores curvas de calibración se$ún el

par8metro de coe#iciente de earson

Las muestras estudiadas se reportan en las tablas = y =1% el tratamiento preliminar de las

muestras se realizaron de la siuiente manera. Las muestras correspondientes a la tabla =,ueron sólida y li*uida% la muestra sólida correspóndete a lec$e en polvo se llevó a unaconcentración de ;; ppm% en donde se diluyeron ;%- en -; mL de aua% despu"s setomó - mL y se a,oro a - con aua% con la muestra li*uida (muestra problema -) serealizaron diluciones se tomaron - mL y se a,oraron a - mL de aua% la muestra dealbumina de $uevo se preparó tomando el volumen total de la clara del $uevo la *ue sediluyo en -; mL de aua% posteriormente se centri,uo para poder eliminar suspensionesespumosas *ue podrían actuar como inter,erencia en la medida% Las muestras reportadas enla tabla =1 se prepararon de la siuiente manera% La muestra correspondiente a la caseínacon rasa se preparó a partir de ;; mL de lec$e% en donde se llevó a un p7 entre 16unidades con cido cítrico (limón) para realizar la separación en ,unción del p5 (presenciadel Giterion)% la mezcla se de+ó reposar durante = día% posteriormente se centri,uo veces y se eliminó el lí*uido sobrenadante separando la muestra sólida el cual se lavó conaua y para así arantizar la eliminación de partículas de cido cítrico% se secó la caseínaen la estu,a a una temperatura de 6; H'% de a*uí despu"s del secado se tomaron ;%= decaseína y se a,oro a -; mL con aua (1;; ppm)% parte de la muestra de caseína se e#tra+o yse realizó un proceso de desenrasado% se adiciono etanol lo *ue arantizaba esto% y asíevitar un reporte erróneo de la medida de la absorbancia% se tomaron ;%;= y se a,oraroncon aua a =;; mL (=;; ppm).

'on la ayuda de las ecuaciones de las me+ores curvas de calibración para la alb!mina y lacaseína se proceder a calcular la concentración de las muestras problemas (tabla = y =1).8ara la alb!mina las me+ores rectas se pueden observar en las tablas =F% -; y -=% cuyasra,icas corresponden a las ,iuras % y F respectivamente.

8ara la muestra problema = (tabla =) cuya absorbancia sin el reactivo de Lory es ;%;9 y

ecuación de curva de calibración es y=0,000681 x+0,000524 se calcula la

concentración de la siuiente manera:

8rimero la variable independiente representa la concentración (ppm) y la Iariabledependiente y representa la &bsorbancia% por ende si despe+amos de la ecuación de larecta podemos encontrar el valor de la concentración de la muestra *ue $a absorbido un unadeterminada lonitud de onda.

x= ym−b

(1)

En donde m es la pendiente de la recta y b es el intercepto.

&$ora reemplazamos cada valor en (=) y se obtiene




x=0,067

0,000681−0,000524=98,38 ppm

/e procede de la misma manera para cada valor correspondiente de la tabla = y =1 con surespectiva ecuación de recta y se enera la tabla -9.

'uestra Concentración /ppm0

0 min 10min 30 min

uestra problema 1

-sólida.

9%,3% 16,61 )0,%%2

uestra problema 2

-li/uida.

20%,52 119,20 101,%5

Albúmina de uevo 195,30 150,94 95,4%'ase(na $rasosa 161,26 )17,50 )34,44

'ase(na sin $rasa 166,26 )64,50 14,45

Tabla 2". Resultado de las concentraciones en ppm para cada muestra problema tratada

Los resultados obtenidos no ,ueron los esperados% las inconsistencias corresponden adeterminados errores% si se observa en las tablas = y =1 $ay absorbancias con valoresneativos% en la literatura se encontró *ue este tipo de errores se deben a cuatro tipos de posibles causas <>% la primera es la no presencia de muestra en la celda% una seunda causa

es la mala inserción de la celda en el e*uipo% una tercera causa puede ser una selecciónerrónea de la lonitud de onda% una cuarta causa es la calibración errónea delespectro,otómetro% cada una de estas causa tiene una posible solución por e+emplo para latercera causa se debe a+ustar la lonitud de onda al rano compatible con el anlisis% ennuestro caso se realizó la medición a sus respectivas lonitudes de ondas para enerar lam#ima absorción de la muestra% para la reacción sin Lory ,ue -; y para las reaccionescon Lory ,ue 9;% *ue coinciden con los valores teóricos reportados <1>% alunas muestras presentaron una absorción muc$o menor a las del rano permitido% $aciendo *ue estasabsorbancias este por deba+o del límite de detección (intercepto de la recta en el e+e de lasordenadas) J /e podría pensar en una interpolación de la recta para permitir *ue laabsorbancia caia dentro de la curva de calibración% pero analíticamente no se puede

realizar ya *ue la curva de calibración es una parte de una curva% adems los límites dedetección y cuanti,icación dela curva de calibración obtenida se!n los parmetrosobtenidos se vería a,ectados y la desviación estndar de estos aumentaría por ende el error tambi"n aumentaría% otro posible error es el error 7umano% ya *ue las muestras problemas,ueron tratadas por di,erentes personas% y es sabido *ue cada persona tiene un determinadoerror de traba+o. La concentración de la muestra total es posible calcular a partir de lasconcentraciones obtenidas por la absorbancia% si se $ace una relación entre la concentración




obtenida a unos determinados ramos o mL traba+os con el peso o volumen total de lamuestra.

&$ora en,aticemos un poco sobre la e#tracción de la caseína% es sabido *ue la lec$e poseediversas proteínas de las cuales la caseína es la ms abundante representando ms de ;K

de contenido total de proteínas. Las caseínas de la lec$e tienen pesos moleculares *ueoscilan entre -.;;; y 1;.;;;J las ms importantes son la 4% la y la M% *ue representan%respectivamente% el ;% ; y =K del total de las caseínas. En la lec$e% estas proteínas seasocian entre sí para ,ormar micelas% *ue se encuentran estabilizadas y solubilizadas raciasa la presencia de la caseína M% y del calcio <> (ver ,iura =).

+i,ura 1#. icelas de case(na en la lec*e&

La propiedad característica de la caseína es su ba+a solubilidad a p7 1%9. El p7 de la lec$ees 9%9 apro#imadamente% estando a ese p7 la caseína carada neativamente y solubilizadacomo sal clcica. /i se aCade cido a la lec$e% la cara neativa de la super,icie de la micela

se neutraliza (los rupos ,os,ato se protonan) y la proteína neutra precipita

+i,ura 1$& Reacción para la etracción dela case(na&

'omo recomendaciones para un me+or resultado en el traba+o se pueden enumerar:

1. 8ara enerar un me+or resultado la e#tracción de la caseína se debe realizar con uncido d"bil y diluido para así arantizar un me+or control en el radiente de p7

-) /i la absorbancia es mayor al límite superior del rano de medida% siempre se puederealizar la dilución correspondiente para introducirla en el rano del m"todo. 8ero si




es in,erior al límite de cuanti,icación del m"todo seleccionado% $ay *ue emplear unm"todo ms sensible.

) 8ara la determinación de la absorbancia despu"s de la adición del reactivo deLory% se debería planear un m"todo para poder arantizar una sincronía en con eltiempo de reacciones estimado

1) El desenrasado de la muestra de caseína es importante para evitar inter,erencias% es por ello *ue el lavado adecuado con etanol ayuda a reducir este inconveniente) 8ara el tratamiento de la muestra de albumina es necesario $acer un determinado

n!mero de centri,uaciones para eliminar las inter,erencias posibles% estas con laayuda de la ,uerza centrí,ua pueden llevarse a la separación de la disolución.

9) /e deben tener en cuenta los parmetros *ue puedan enerar un valor neativo en lamedida de absorbancia y solucionarlos de manera e,iciente y precisa.

4. Conclusiones

•

La comparación del traba+o de varios rupos pudo rea,irmar *ue cada persona tieneun determinado estilo de traba+o lo *ue es un parmetro importante al momento derealizar un anlisis cuantitativo% adems es importante tener en cuenta *ue para undeterminado lote de muestras le corresponde una determinada curva de calibración%una determinada calidad de reactivo% adems una determinada especie de reactivos.

• Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de losm"todos% y sus valores tambi"n son los correspondientes coe,icientes de absorciónde los comple+os proteína6reactivo.

• El m"todo de Lory posee una me+or sensibilidad *ue el m"todo de Biuret% esto se

pudo comprobar con la sensibilidad ( pendiente de la recta se!n la 5A8&') de cadacurva de calibración realizada% adems el coe,iciente de 8erson es un parmetrolineal *ue arantiza la calidad y la eneración de resultados proporcionales a laconcentración del analito en las muestras dentro de un determinado rano

• La eliminación de cual*uier tipo de inter,erencias de las muestras de traba+oarantizara un me+or reporte en el anlisis% adems si la absorbancia de la muestraest dentro del rano de medida del m"todo seleccionado% mediante la ecuación dela recta de calibrado se puede calcular la concentración de proteína de la disolución problema.

!. 4iblio,ra-ía

:1; <=oo$ A, oller >, 'rouc* R& rincipios de an8lisis instrumental, 6 ta d, editorial?

'en$a$e earnin$ eico +&@ 200%, p8$& 20&

:2; *ttp?catedras&/uimica&unlp&edu&ar/o3Apuntesroteinas&pd# -consultado 2%042013.




:3; *ttp?!!!&bvsde&pa*o&or$bvsacdcd29laboratoriocap11&pd# -consultado 11052013.

:4;*ttp?depa&#/uim&unam&mam"darc*iveroABCA+DEFCDD'AGRDBHAI12313&pd#

-'onsultado 11052013.

:5;*ttp?!!!&u*u&es4%0004034documentosJ20deJ20tetopracticasprotocoloIpracticasIalimentosI0%I09&pd#

-'onsultado 11052013.


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