Infezioni delSistema Nervoso:

diagnostica microbiologicadiagnostica microbiologica

Giovanni Di Bonaventura, PhDUniversità “G. d’Annunzio”

Chieti-Pescara

Sistema nervosoOrganizzazione

• Sistema Nervoso Centrale (SNC): encefalo e midollo spinale

• Sistema Nervoso Periferico (SNP): nervi periferici• Fisiologicamente sterile:

– assenza di flora “autoctona”

• Difese naturali del SN:• Difese naturali del SN:– cranio e vertebre– cellule di microglia e macrofagi– presenza di una Barriera Emato-Encefalica (BEE) e

della Barriera Emato-fluido cerebrospinale (BECS)che impediscono l’accesso cerebrale/meningeo a:

• microrganismi• farmaci (es. antibiotici)• sistema immune

Sistema NervosoInfezioni

• Infezioni del SNC:– Meningiti (acute o croniche)– Encefaliti (acute o croniche)– Ascessi cerebrali– Ascessi cerebrali

• Infezioni del SNP:– Tetano– Sindrome Guillian-Barrè– Botulismo

MeningiStruttura ed organizzazione

• 3 membrane connettivali (nell’insieme costituiscono la barriera emato-encefalica) a rivestimento del cervello e della colonna vertebrale:

– Dura madre• doppio strato: il primo a contatto con il

periostio; l’altro, a contatto con le periostio; l’altro, a contatto con le meningi (decorre attraverso il foramen magnum, copre CN’s)

– Aracnoide• tesa a ponte sopra i solchi cerebrali• granulazioni aracnoidali che si

proiettano nei seni venosi, (dove il liquor diffonde verso il torrente ematico)

• spazio subaracnoidale occupato dal liquor cefalo-rachidiano

– Pia madre• delicata, altamente vascolarizzata• a contatto con il cervello e la colonna

vertebrale

Con il rachide, le meningi delimitano tre spazi:� vertebra < spazio EPIDURALE < dura madre� dura madre < spazio SUBDURALE < aracnoide� aracnoide < spazio SUBARACNOIDALE < pia madre (contiene il liquor; sede specifica di esordio della meningite)

Ciascuno di questi spazi è sede di infezioni distinte

MeningiSpazi meningei

Ciascuno di questi spazi è sede di infezioni distinte

I villi estremamente vascolarizzati della pia madre si proiettano in 4 ventricoli all’interno dell’encefalo e sono rivestiti da cellule epiteliali ependimali.

Queste proiezioni, note come plessi coronoidei , sono i siti nei quali la componente fluida del sangue è modificata attraverso secrezione e assorbimento di certi soluti e convogliata all’interno dei ventricoli sotto forma di liquido cefalorachidiano (LCR) o liquor cefalorachidiano (LCR) o liquor (adulti: 400-600 ml/die; volume totale: 40-60 ml nei neonati e 100-160 ml negli adulti).

Il liquor circola nei ventricoli e nello spazio subaracnoidale , attorno all’encefalo ed alla corda spinale e ritorna al sistema circolatorio sanguigno attraverso i villi subaracnoidali che proiettano nel seno sagittale superiore nella volta interna del cranio.

Meningite: definizione e tipologia

DefinizioneLa meningite è definita come l’infiammazione delle menin gi : pachimeningite(dura madre), leptomeningite (pia madre, aracnoide). Se severa, può evolvere in encefalite, stato infiammatorio del cervello. Può essere causata da agenti infettivi, metastasi, agenti chimici e/o farmaci.metastasi, agenti chimici e/o farmaci.

TipologiaFULMINANTE : evoluzione rapida (coma, shock), quasi sempre irreversibile.ACUTA : esordio e sviluppo nel corso di ore o di pochi giorni.SUBACUTA : decorso lento e insidioso, con segni meningei sfumati (solitamente causata da bacillo tubercolare oppure da miceti).RICORRENTE: ripetuti episodi anche a distanza che sono espressione generalmente di un difetto dell'ospite, o dell'anatomia locale oppure delle difese antibatteriche immunologiche (trauma cranico, pazienti HIV+, ecc).DECAPITATA : forma il cui decorso è attenuato per il precoce intervento con terapia antibiotica (N. meningitidis; alta frequenza di falsi negativi al colturale).

Meningitepatogenesi

I microrganismi debbono superare la barriera morfo-funzionale (emato-liquorale, emato-encefalica, meningo-encefalica) posta a protezione di LCR e SNC:

– via ematogena (batteriemia, viremia): la più frequente– per contiguità :

• da focolai infettivi parameningei (otiti, sinusiti, mastoiditi, ascessi cerebrali) attraverso la lamina cribrosa etmoidea, la guaina olfattoria, plessi corioidei, i vasi ematici/linfatici;

• comunicazioni anomale post-chirurgiche e traumatiche fra gli spazi subaracnoidali e siti • comunicazioni anomale post-chirurgiche e traumatiche fra gli spazi subaracnoidali e siti colonizzati (naso e seni paranasali, secondaria a frattura della base cranica);

• drenaggio di LCR;

– per contagio diretto : rachicentesi, ferite penetranti, traumi cerebrali aperti, fratture, interventi neurochirurgici

Site all’interfaccia tra circolo sistemico e parenchima cerebrale, le leptomeningi - ed in particolare gli spazi di Virchow-Robin - rappresentano il principale sito di ingresso dei microrganismi.

Il liquor è veicolo di diffusione dell’infezione che, se non contrastata, si estende al parenchima cerebrale (meningo-encefaliti).

Le forme PRIMARIE , si sviluppano in assenza di infezioni extra-cerebrali.Nelle forme SECONDARIE , l’infezione diffonde per contiguità dai foci infettivi

parameningei, o per metastasi da foci situati a distanza (tifo, polmonite,tubercolosi).

Photomicrograph (original magnification, x20; hematoxylin-eosin stain) of a coronal section through the anterior perforated substance shows two arteries (straight arrows) with surrounding VR spaces (curved arrows).

� Epitelio mucosale� IgA seceretorie� Attività ciliare

� Abs anti-capsulari

� Complemento� Abs specifici

� Fimbrie (pili)� Capsula� Proteasi vs IgA (pneumococco)� Endocitosi (menigococco)� Rottura tight-junctions epitelio colonnare (H. influenzae)� Recettori specifici (H. influenzae, N. meningitidis)

Meningite batterica: patogenesi

BEE

� ridotti livelli di fagociti e IgG� ridotta attività opsonizzante

� Fimbrie (pili)� Associazione con monociti� Capsula

Meningite batterica: patogenesi

Meningiteeziologia

• Le meningiti batteriche vengono indicate con il termine “meningiti purulente ” (a liquor purulento)

• Le meningiti non batteriche, ad esempio quelle virali, vengono indicate come “meningiti asettiche ” (a liquor trasparente)

– Il liquor risulta trasparente anche in caso di infezione da M. tuberculosis, Funghi, LeptospiraLeptospira

• La causa più frequente di meningite è una infezione virale che generalmente si risolve in assenza di trattamento.

• Le meningiti batteriche sono meno frequenti ed estremamente più gravi (vs virali); possono causare exitus o danno cerebrale anche in presenza di trattamento.

• Altri agenti eziologici: parassiti, Chlamydia spp, Mycoplasma spp, Spirochete, Rickettsiae.

Meningite batterica epidemiologia� Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 3-12 casi/100.000 persone/anno (Italia)� Mortalità: 5% negli adolescenti, 25% nei neonati e negli adulti� Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione� Trattamento disponibile: terapia antibiotica (“mirata” vs l’agente eziologico)� Reservoir: uomo� Eziologia: dipendente dall’età del paziente; tuttavia, le meningiti pneumococciche sono le più

comuni (6.000 casi/anno) ed associate al più alto tasso di mortalità (20-30%):1. neonati (< 1 mese):

bacilli Gram-negativi (E. coli K1) (50-60%)bacilli Gram-negativi (E. coli K1) (50-60%)streptococchi gruppo B (Streptococcus agalactiae) (20-40%)Listeria monocytogenes (2-10%)

2. bambini e ragazzi fino a 15 anni :Neisseria meningitidis (25-40%; max incidenza nel 1°anno di vita)Streptococcus pneumoniae (10-20%)Haemophilus influenzae tipo b (25-40%; in declino, per vaccinazione)

3. adulti (anziani, immunocompromessi):Streptococcus pneumoniae (30-50%)Neisseria meningitidis (10-35%) (causa principale di fenomeni epidemici)Staphylococcus aureus (5-15%)bacilli Gram-negativi (anziani) (1-10%)

Meningite da anaerobi: associata a foci contigui di infezione (otite, sinusite, faringite, ascesso cerebrale, tumori testa/collo, interventi chirurgici o ferite infette, post-trauma, post-operatorio neurochirurgico).

A

B

D

EPrincipali agenti eziologici di meningite batterica:

A. Escherichia coli K1B. Streptococcus agalactiae

C F

B. Streptococcus agalactiaeC. Listeria monocytogenesD. Neisseria meningitidisE. Haemophilus influenzaeF. Streptococcus pneumoniae

Meningiti virali (“asettiche”)

• Decorso meno grave della meningite batterica: benigno a risoluzione spontanea

• Sindrome caratterizzata da comparsa acuta di sintomi meningei (febbre, cefalea, fotofobia) ma senza rigidità nucale

• La meningite asettica può avere varia eziologia, sebbene più • La meningite asettica può avere varia eziologia, sebbene più frequentemente causata da un agente virale:– M. tuberculosis– Funghi– Leptospira

• Aspetto del liquor: trasparente, mai purulento• Cellularità del liquor: pleiocitosi (inizialmente mista neutrofilo-

mononucleare, quindi linfomonocitica)

Meningite viraleepidemiologia

� Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 5-35 casi/100.000 persone/anno (Italia)� Mortalità: decorso meno grave della meningite batterica: benigno a risoluzione

spontanea� Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione� Trasmissione: principalmente interpersonale, ma anche vettori animati (artropodi) per

Arbovirus.� Incubazione : Variabile: 3-6 gg (Enterovirus), 2-15 giorni (Arbovirus) � Incubazione : Variabile: 3-6 gg (Enterovirus), 2-15 giorni (Arbovirus) � Trattamento disponibile : generalmente ad autorisoluzione.� Reservoir: uomo (Enterovirus, Adenovirus, Morbillivirus, Herpes Simplex, Varicella) o

naturale (uccelli per Arbovirus)� Eziologia: le meningiti da Enterovirus sono le più comuni (85%):

� Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus) � Herpesvirus (HSV 1/2, Varicella-zoster, Epstein Barr, ytomegalovirus).� Togavirus (Eastern equine, Western equine, Venezuelan equine; St. Louis,

Powasson, California, West Nile)� Mixo/paramyxovirus (Influenza/parainfluenza, Parotite, Morbillo)� Miscellaneous (Adenovirus, LCM, Rabbia, HIV)

Meningite viraleepidemiologia

Gli Enterovirus rappresentano la forma più frequente di meningite asettica stagionale

Meningite virale: patogenesi

Colonizzazione mucosa nasale

Sede intracellulare

viremia nervi intracellulare

viremiaolfattivi

BEE

Sopravvivenza nel SNC

• Fattori virali:– Dimensione inoculo– Virulenza del

microrganismo– Neurotropismo

(rabbia, HSV tipo I)

Infezioni del SNCMeningite: diagnosi clinica

Insieme di segni/sintomi presenti indipendentemente dalla natura eziologica dell’infezione:

Infezioni del SNCMeningite: diagnosi di laboratorio

• Il sistema nervoso attua strategie atte a limitare l’infiammazione, perché i suoi effetti potrebbero essere più deleteri dell’agente patogeno che l’ha innescata.

• Le infezioni del SNC, la meningite in particolar modo, rappresentano una vera emergenza medica. Debbono quindi essere:

– riconosciute tempestivamente– correlate , possibilmente, con l’agente patogeno– trattate immediatamente sulla base della eziologia

• Il maggior contributo alla diagnosi eziologica è sic uramente dato dallo studio microbiologico del LCR . L’esame microbiologico si basa sulla ricerca diretta dell’agente infettivo (esame microscopico, ricerca di antigeni batterici/fungini, amplificazione genica), sugli esami colturali del liquor che vanno di norma associati alla contemporanea esecuzione dell’emocoltura ed alla ricerca della risposta anticorpale antimicrobica.

• Il sospetto di meningite richiede quindi il prelievo di LCR mediante esecuzione della puntura lombare, anche in presenza di sintomatologia sfumata.

• L’analisi di base del LCR si effettua in urgenza ed il laboratorio svolge un ruolo fondamentale.

Analisi del liquor cefalorachidianoPercorsi pre-analitici

• LCR è un materiale biologico molto prezioso : il prelievo, l’utilizzo e la sua conservazione debbono essere previamente ed accuratamente concordati tra il Clinico ed il Laboratorio per fare in modo che le procedure analitiche abbiano inizio immediatamente dopo il prelievo del campione.

• La raccolta andrebbe effettuata, quando possibile, prima dell’inizio • La raccolta andrebbe effettuata, quando possibile, prima dell’inizio della terapia antibiotica poiché essa:– modifica il significato diagnostico di varie tecniche– interferisce con l’isolamento colturale : false negatività

In caso contrario, bisogna avvertire il Laboratorio affinchè si possano mettere in atto procedimenti in grado di minimizzare gli effetti inibitori sui microrganismi (resine che rimuovono gli antibiotici, aumento dei volumi colturali e di liquor per diluire l’effetto inibente)

• E’ necessario segnalare la sede di prelievo (lombare, ventricolare, cistico), poiché i valori di riferimento sono, di norma, attribuiti al liquor lombare.

Prelievo di LCRpuntura lombare (rachicentesi)

• Operare in asepsi: accurata disinfezione della • Operare in asepsi: accurata disinfezione della cute nella regione di prelievo

• Il paziente viene invitato a sdraiarsi su un fianco incurvandosi in avanti per separare i processi spinosi delle vertebre lombari

• Inserimento ago nel canale spinale generalmente tra L3-L4, ma anche L4-L5 o L5-S1

• Il liquor può anche essere ottenuto dal ventricolo, cisterna o fontanelle, o dal drenaggio di riserva

• Prelievo LCR (pressione > 600 mm Hg: fuoriuscita “spontanea”)

� La puntura lombare non è esente da rischi: la complicanza più temuta è ‘l’incuneamento’, che si verifica quando le tonsille cerebellari erniano attraverso il foramen magnum del cranio, comprimendo le strutture cerebrali vitali del peduncolo. Ciò accade più facilmente in presenza di lesioni cerebrali espanse o di pressione intracranica aumentata.

� Pertanto i pazienti con sospetto clinico di pressione intracranica aumentata non dovrebbero essere sottoposti a puntura lombare e quelli con segni neurologici di

Diagnosi di meningite... in assenza di LCR

dovrebbero essere sottoposti a puntura lombare e quelli con segni neurologici di lesioni localizzate dovrebbero essere sottoposti a TC prima di altre procedure volte ad escludere una lesione.

� Talvolta il paziente è in condizioni troppo instabili o presenta diatesi emorragica come risultato di una sindrome settica ed in queste condizioni non può essere sottoposto a puntura lombare.

� Nei pazienti con controindicazione alla puntura lombare, si deve conseguire il massimo impegno per definire la diagnosi microbiologica con ogni altra modalità:� Urine (antigeni batterici)� Markers infiammatori sierici : aumentatati livelli di procalcitonina (>=0.5 ng/ml) e

proteina C reattiva (>=20 mg/l) depongono a favore di una eziologia batterica

Analisi del LCRPercorsi pre-analitici: raccolta del campione

• Standardizzare il volume da prelevare:– in generale 6 ml (2 ml/provetta), ma almeno 1 ml;– raccolta in provette sterili con tappo a vite (siliconate, per evitare l’adesione dei

monociti alle pareti), numerando i campioni in maniera progressiva– possibilità di confrontare diversi prelievi (intra- inter-paziente)– volumi maggiori o campioni ripetuti per ricerca di M. tuberculosis o funghi

• Evitare la contaminazione ematica (principale causa di errore pre-analitico)• Evitare la contaminazione ematica (principale causa di errore pre-analitico)– generalmente secondaria al trauma da puntura lombare (diminuzione tracce

ematiche dal 1o al 3o campione)– il 3°campione è destinato al colturale (meno sogge tto a contaminazioni cutanee)– non processare il campione in presenza di massiccia contaminazione ematica

(presenza di inibitori di crescita batterica e/o PCR)

• Prelevare contestualmente anche campioni di sangue per:– indagini biochimiche e sierologiche (emocromo per leucocitosi neutrofila)– emocoltura per ricerca di funghi/batteri indicanti una sottostante infezione sistemica

• Seminare , al momento stesso del prelievo, parte del liquor in 2 flaconi (aerobi e anaerobi) per emocoltura

Analisi del LCRPercorsi pre-analitici: trasporto del campione

• Inserire i campioni in un contenitore di plastica chiuso (trasporto in “sicurezza biologica”)

• Inviare i campioni in laboratorio entro 15-30 min (max 2 h) dal prelievo:

– ipotonicità del liquor causa la lisi dei neutrofili– diminuzione della vitalità batterica: 32% dopo 1 h, 50% dopo 24 h– diminuzione della vitalità batterica: 32% dopo 1 h, 50% dopo 24 h

• Trasportare a temperatura ambiente, evitando la refrigerazione :– N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae sono organismi “esigenti” che non

potrebbero sopravvivere a lunghi tempi di trasporto od a variazioni di temperatura (microrganismi termosensibili)

– è consigliabile congelare il campione, residuo dalla esecuzione dell’esame colturale e microscopico, per indagini successive (ricerca virus, mediante PCR)

– trasporto in contenitori privi di ossigeno per la ricerca/coltura di anaerobi (utilizzo del flacone emocolturale per “anaerobi”)

Analisi del LCRFase analitica: esame chimico-fisico

L’esame chimico-fisico viene effettuato previa centrifugazione e rimozione del surnatante, poiché le cellule - lisandosi con il tempo - libererebbero il loro contenuto proteico in sospensione:

• [glucosio ]: ↓ (ipoglicorrachia), ↑ (iperglicorrachia)– [glucosio]liquor / [glucosio]sangue (soggetto sano = 0.45)

• [proteine ]: ↓ (ipoprotidorrachia), ↑ (iperprotidorrachia)• ↑ Proteina C-reattiva, LDH, e neopterina (infezioni batteriche)

• Conta cellulare : leucociti (mononucleati, neutrofili, etc.)• [LDH ]liquor, ↑ LDH (infezioni batteriche)• Esame del sedimento : previa colorazione con May-Grunwald-Giemsa per lo

studio delle caratteristiche morfologiche e strutturali.

LCR: caratteri chimico-fisici e cellulariEziologia

Parametro(valore fisiologico)

Batterica ViraleFungina, Tubercolare,

Leptospira

Pressione(<170 mm CSF)

> 300 mm 200 mm 300 mm

WBC (<5 mononucleari)

> 1000 < 1000 < 500

%PMN’s (0)

> 80% 1-50% 1-50%(0)

> 80% 1-50% 1-50%

Glucosio(45-85 mg/dL)

< 45 45-85 < 45

Proteine(20-30 mg/dL)

> 200 < 200 > 200

Lattato(mg/dl)

> 30

Gram + - -

Citologia - - +

Aspetto(limpido)

purulento limpido limpido/smerigliato

Meningite battericadiagnosi microbiologica

Meningite batterica vs viraleCaratteristiche macroscopiche del LCRASPETTO:Limpidezza : limpido (“acqua di roccia”), opalescente, torbidoColore : incolore, xantocromico (giallo-arancio: ricco di proteine), eritrocromico (contaminazione, lesione subaracnoidea)

Sulla base dell’aspetto del liquor, le meningiti sono classificate in:� meningiti a liquor limpido (opalescente ma mai purulento, smerigliato per pleiocitosi). Eziologia prevalentemente virale, smerigliato per pleiocitosi). Eziologia prevalentemente virale, ma anche batterica o protozoaria:

↓ glicorrachia (tubercolare, Brucella, Salmonella, Leptospira, Listeria)↑glicorrachia (o normale): virale, Rickettsiae, Chlamydia, Toxoplasma, Trypanosoma

� meningiti a liquor torbido (purulento, fuoriesce ad alta pressione). Indicativo di eziologia batterica:

↑ protidorrachia, ↑ neutrofili, ↓ glicorrachia): batteri, miceti/muffe (Candida, Mucor), protozoi (Naegleria, Acanthamoeba)

Meningite battericadiagnosi microbiologica� Aspetto:

- grado di torbidità, ed eventuale presenza di coagulo (coagulo “a ragnatela” nella meningite tubercolare)

- colore surnatante, a seguito di centrifugazione� Esame microscopico :

– totale: leucociti (GB) + eritrociti (GR)– differenziazione leucociti polimorfonucleati (PMN) vs leucociti mononucleati, – differenziazione leucociti polimorfonucleati (PMN) vs leucociti mononucleati,

eseguita su conteggio > di 5x106 GB/l.– conteggio totale GR (eseguita su due campioni, in caso di sospetta emorragia)– Colorazione

• Gram (diplococchi Gram- : N. meningitidis; diplococchi Gram+: S. pneumoniae; coccobacilli Gram-: H. influenzae)

• blu di metilene (morfologia)• inchiostro di china (C. neoformans)• Ziehl-Nielsen (micobatteri)

� Esame colturale, sul sedimento, per ricerca di:– N. meningitidis, H. influenzae,S. pneumoniae, stafilococchi, – ricerche particolari: miceti (C. neoformans), M. tuberculosis, amebe

Meningite battericadiagnosi microbiologica� Ricerca di antigeni battericiCostosi e di controversa affidabilità, tali tests dovrebbero essere utilizzati su LCR SOLO in caso di

conteggi anomali di cellule (immunodeficienza con deficit GB), di esame negativo al Gram e quando LCR e le emocolture permangono negative per oltre 48 ore (pregressa antibiotico-terapia).

Il Clinico deve essere informato che sebbene una positività al lattice possa indicare la presenza di un agente infettivo, un risultato negativo non può considerarsi “finale”. a) Tests al lattice: consentono la diagnosi eziologia in quanto i batteri che comunemente causano meningite presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica che possono essere meningite presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica che possono essere rilevati dal latex test. Vengono ricercati gli antigeni solubili polisaccaridici specifici di:

– Streptococcus pneumoniae;– Haemophilus Influenzae di tipo b;– Neisseria meningitidis (gruppi A, B, C, Y/W135);– Esherichia coli (gruppo K1);– Streptococcus agalactiae (streptococco beta-emolitico di gruppo B).

b) Test immunocromatografico: utile per la ricerca dell’antigene solubile di S. pneumoniae nel liquor o nelle urine.

� Amplificazione genica (PCR) su sangue e liquor: utilizzata per la ricerca diretta di batteri (Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes ) e virus.

Meningitediagnosi di laboratorio: ricerca diretta

PCR amplification of 419bp of protein b gene of M. tuberculosis on 1.5% agarose gel. Lane 1: 100bp DNA marker, lane 2: Positive control, lane 3,4,5: Positive CSF samples and lane 5: Negative control. (Sharma et al, Neurol India 2010)

Colonie di N. meningitidis su agar cioccolato (le colonie appaiono viola al test dell’ossidasi)

Costi e tempi delle analisi liquorali

Test Tempo Costo (euro)Glucosio <1 h 4Proteine <1 h 2WBC+diff. <1 h 27Gram 2 h 8Coltura 5 gg 20Coltura 5 gg 20Latex test <1 h 130

• ASPETTO: aspetto del LCR ed (eventuale) presenza di coaguli• MICROSCOPIA• Conteggio cellulare

– numero di GR (x106 per litro) e– numero di PMN e linfociti (x 106 per litro), oppure– numero di PMN e linfociti (% conteggio totale dei GB, riferito a x 106)

Esame LCRrefertazione

– numero di PMN e linfociti (% conteggio totale dei GB, riferito a x 10 )– in alcuni casi può essere opportuno fare riferimento al citocentrifugato per la

differenziazione delle cellule mononucleate e delle altre cellule

• Colorazione Gram– descrizione del(dei) microrganismo(i) osservato(i)– inchiostro d’India o nigrosin– descrizione dei funghi dotati o meno di capsula– microscopia per specie Mycobacterium e parassiti

• COLTURALE– descrizione microrganismi isolati, oppure– indicazione di assenza di crescita– risultati delle prove supplementari

Meningite a LCR “limpido”diagnosi microbiologica

Meningiti fungine

• Rare e di difficile diagnosi• Cryptococcus neoformans (causa più frequente), Coccidioides immitis

(Messico, America meridionale)• Invade il sangue e raggiunge il cervello soprattutto nell’ospite con immunità

cellulo-mediata compromessa (AIDS; immunosoppressi)• Quadro liquorale: pleiocitosi linfocitaria, aumento quoziente albumina• Identificazione mediante colorazione della capsula (India ink): solo per C.

neoformans• Isolamento colturale• E’ raccomandabile l’utilizzo di volumi maggiori di liquor (almeno 4 ml) per

l’allestimento del vetrino e per la coltura• Ricerca di antigeni + ricerca anticorpale nel LCR per monitorare l’efficacia

della terapia:– aumentati livelli di Abs specifici + ridotta presenza di antigeni = terapia efficace

• Ricerca di materiale genico: PCR, non ancora standardizzata

Round capsulated fungal organisms

Lymphocytic infiltrate around

C. neoformans su agar sangue: colonie didimensioni piccole/medie, con aspetto mucoide dovuto alla produzione di una capsula polisaccaridica.

Meningite criptococcica: sedimento liquorale colorato con inchiostro di China

Meningite da protozoi

• Le amebe (Naegleria, Acantameba) possono moltiplicarsi in acque stagnanti nei Paesi tropicali (scarichi fognari).

• Se inalate, raggiungono le meningi attraverso il nervo olfattivo e la lamina cribrosa etmoidea

• Diagnosi: osservazione microscopica per evidenziare caratteristica motilità ameboidemotilità ameboide

Meningite amebica: sedimento liquoralecon trofozoiti di Naegleria fowleri

Meningite viraleRhabdovirus

• Rabdovirus: virus a RNA, singolo filamento• Infezione virale contratta dal morso di un animale

(cani, volpi, sciacalli) rabbico• Virus migra dal sito di inoculo verso il cervello

tramite vie nervosetramite vie nervose• Periodo di incubazione variabile (4-13 settimane

nell’uomo)• Malattia zoonotica fatale:

febbre, confusione, ansietà, encefalti, morte

Meningite viraleRhabdovirus: diagnosi di laboratorio

• Campioni clinici: strisci corneali, biopsie cerebrali, biopsie cutanee

• Ricerca di antigeni virali in IF o tramite PCR

• Rilievo microscopico di cellule neuronali cerebrali contenenti i corpi del Negri cerebrali contenenti i corpi del Negri (inclusioni intracitoplasmatiche)

Cervello rabbico: colorazione IF (in alto); campione negativo (in basso)Cervello rabbico: colorazione

ematossilina-eosina. Indicati, i Corpi del Negri.

Diagnosi microbiologica di meningiteEsami microbiologici effettuabili

Sospetto clinico Esame effetuabile Campione biologico Note

Meningite batterica Esame diretto e colturale per batteri

Liquor (almeno 1 ml)Trasportare immediatamenteMantenimento: RT < 2 h

Inviare anche emocoltura (1 flacone x aerobi + 1 flacone x anaerobi)

Ricerca antigeni batterici mediante test di agglutinazione

Liquor (0.5-1 ml)Trasportare immediatamenteMantenimento: 4°C < 12 h

Lo stesso test può essere eseguito anche su sangue od urine

Ricerca antigene S. pneumoniae(immunocromatografia)

Liquor (0.5 ml)Mantenimento: RT <24 h, oppure 4°C < 1 settimana

Lo stesso test è eseguibile anche in caso di sospetta polmonite pneumococcica

Ricerca di DNA batterico mediante PCR

Liquor (almeno 1 ml)Mantenimento: RT < 2 h oppure 4°C <24 h

Meningite fungina Esame diretto e colturale per miceti (lieviti e muffe)

Liquor (almeno 3-4 ml)Trasportare immediatamenteMantenimento: RT < 2 h

Inviare anche emocoltura (1 flacone x aerobi + 1 flacone x anaerobi)

Maggiore quantità di liquor per eseguire esame diretto e colturale per miceti

Ricerca antigeni C. neoformans(test al lattice)

Liquor (almeno 0.5 ml)Mantenimento: 4°C < 12 h

Meningite tubercolare Esame diretto e colturale per M. tuberculosis

Liquor (almeno 3 ml)Mantenimento: RT <2 h, oppure 4°C < 1 settimana

Maggiore quantità di liquor per esame colturale

Ricerca di M. tuberculosismediante amplificazione

Liquor (almeno 2 ml)Mantenimento: RT <2 h, oppure 4°C < 1 settimana

2 ml sono sufficienti per ricerca DNA

Diagnosi microbiologica di meningiteEsami microbiologici effettuabili

Sospetto clinico Esame effettuabile Campione biologic o Note

Meningite virale Ricerca DNA virus erpetici (CMV, ENV, VZV, HSV1, HSV2) mediante PCR

Liquor (almeno 1 ml)Mantenimento: <2h a RT, oppure <24h a +4°C

1 ml di liquor è sufficiente per la ricerca molecolare di virus erpetici e poliomavirus

Ricerca DNA poliomavirus (JCV, BKV) mediante PCR

Liquor (almeno 1 ml)Mantenimento: <2h a RT, oppure <24h a +4°C

1 ml di liquor è sufficiente per la ricerca molecolare di virus erpetici e poliomavirus

Ricerca anticorpi anti-virus neurotropi (Morbillo, Varicella,

Liquor (almeno 1 ml)Mantenimento: <2h a RT, oppure

Inviare anche un campione di sieroneurotropi (Morbillo, Varicella,

Parotite, CMV, EBV, HSV1, HSV2)Mantenimento: <2h a RT, oppure <24h a +4°C

siero

Esame colturale per HSV1, HSV2, CMV

Liquor (almeno 1 ml)Mantenimento: <24h a +4°C