Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono...

Il sistema maggiore di

istocompatibilità: struttura e

tipizzazione HLA

Prof. Amedeo Amedei

Dipartimento Medicina Interna

[email protected]

Scuola

1

Major Histocompatibility Complex

Gruppo di geni polimorfici costituito da 30 unità (ad oggi): cromosoma 6 (uomo), 17 ( topo).

Proteine Tradotte: Proteine del MHC espresse sulla membrana cellulare, 21 Idrossilasi,

Frazioni del complemento C4B,C4A,BF e C2, Proteina chaperone HSP70 , proteine della

famiglia del TNF.

Due principali classi MHC: la classe I (MHC-I: tre copie per ogni cromosoma) e la classe II

(MHC-II: sei copie per ogni cromosoma). Essi sono responsabili di situazioni fisiologiche, e

talvolta patologiche, nettamente differenti nell'ambito dell'organismo.

I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, quelli

che derivano dall' MHC-II sono attivi nei fenomeni di cooperazione cellulare che si verificano

nell'ambito della risposta immunitaria.

Nell'uomo l'MHC prende il nome di Human leukocyte antigen (HLA).

2

http://it.wikipedia.org/wiki/Gene

http://it.wikipedia.org/wiki/Polimorfismo_(biologia)

http://it.wikipedia.org/w/index.php?title=21_idrossilasi&action=edit&redlink=1

http://it.wikipedia.org/wiki/Complemento

http://it.wikipedia.org/wiki/Chaperone

http://it.wikipedia.org/w/index.php?title=HSP70&action=edit&redlink=1

http://it.wikipedia.org/wiki/TNF

http://it.wikipedia.org/wiki/MHC-I

http://it.wikipedia.org/wiki/MHC-II

http://it.wikipedia.org/wiki/Fisiologia

http://it.wikipedia.org/wiki/Patologia

http://it.wikipedia.org/wiki/Organismo

http://it.wikipedia.org/wiki/Risposta_immunitaria


Le molecole di Classe I vengono espresse pressoché su tutte le cellule nucleate (in cellule

prive di nucleo, come i globuli rossi, poco espressi) e sono formate da un polipeptide

transmembrana di 44.000 dalton, codificato dall'MHC, associato alla β2-microglobulina, una

molecola invariante di 15.000 dalton codificata dal cromosoma 15.

Le molecole HLA di Classe II sono presenti solo su alcune cellule immunocompetenti: APC

(antigen presenting cell), quali cellule dentritiche, linfociti B e macrofagi. Inoltre la loro

presenza, anche su queste cellule, non è costante, ma soggetta a modulazione, a seconda

dello stato di attivazione della cellula. Questa espressione viene modulata dalla presenza o

meno di alcune interleuchine.

Le molecole di Classe II sono proteine di membrana eterodimeriche, formate cioè da una

catena α (che varia fra i 33.000 e i 34.000 dalton), e da una catena β (fra i 28.000 e i 29.000

dalton), entrambe codificate dall'MHC. C'è poi una terza catena, detta invariante, che non

attraversa la membrana cellulare.3

http://it.wikipedia.org/wiki/Unit%C3%A0_di_massa_atomica

http://it.wikipedia.org/wiki/Interleuchine


Sia le molecole di classe I che quelle di classe II fungono da bersaglio per i linfociti T, che

regolano la risposta immunitaria. Affinché un antigene venga legato su una molecola di

membrana MHC dev'essere processato ( processo al termine del quale si legherà ad una

molecola MHC classe I o II).

Processazione in fase citosolica (comune per proteine di derivazione virale) l'Ag si

legherà ad MHC I implicando l'attivazione dei linfociti T "citotossici" o "CD8+", effettori

diretti delle risposta immunitaria specifica cellulo-mediata, che lisano le cellule che li

hanno attivati.

Processazione esclusivamente in vescicole endosomiali (tipico per proteine di

derivazione batterica), L'Ag si legherà ad una molecola MHC II ed attivazione dei

linfociti T "helper" o "CD4+". Questi svolgono la propria attività producendo citochine

che contribuiranno all'attivazione di linfociti B(linea Th2) o all'attività citotossica dei

linfociti T CD8+ o dei fagociti mononucleati ( lineaTh1).

4

http://it.wikipedia.org/wiki/Risposta_immunitaria

Sistema HLAInsieme di geni localizzati sul cromosoma 6 (6p21.3)

Parte della regione genetica MHC (Major Histocompatibility Complex)

MHC = 4 x 106 paia di basi (0,1 % genoma nucleare):

HLA classe I

HLA classe II

HLA classe III (complemento, ormoni, altri geni indefiniti)

1/3 della porzione

Struttura Molecolare dei geni: simile per i geni di classe I e II

sequenza di introni (non codificanti e di regolazione) ed esoni (codificanti)

Piccole differenze che rispecchiano differenze strutturali 5

HLA Classe I

3 loci funzionanti: HLA-A, HLA-B, HLA-C

Glicoproteine altamente polimorfe espresse sulla membrana cellulare

Classe I : geni codificano per la catena a dell’eterodimero a/b

b = b2-microglobulina (cromosoma 15), fondamentale per l’espressione del complesso

Sruttura: 4 regioni extracellulari: 3 a (a1,a2, a3) 1 b2-microglobulina

Catena a = aa idrofobici (ancoraggio) + regione intracitoplasmatica

Elevato Polimorfismo: 50-100 alleli (topo – uomo)

Esigenza Tipizzazione (impossibile trovare due individui uguali)6

HLA Classe I

Meccanismi alla base della eterogenicità:

Sostituzioni di singoli nucleotidi

Ricombinazioni Reciproche

Conversioni Geniche

Espressione:Tutte le cellule nucleate (no eritrociti)

Eccezioni: cell. Nervose, spermatozoi, cell.ossee

Differenza di concentrazione

Fibroblasti

Cell. Nervose

Cell. Muscolari

APC

Bassi Livelli Alti Livelli

Funzione HLA Classe I:

Presentazione Peptidi ai T CD8

Domini a1 ed a2 7

HLA Classe II

Espressione: numero limitato di cellule

Cell. Epiteliali del Timo

APC

Precursori Mieloidi ed Eritroidi

Struttura : catena a + catena b (legame no covalente)

Nell’uomo = 3 Famiglie di geni e proteine: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP

Caratteristica = Elevato Polimorfismo

Geni per le classi degli eterodimeri a/b : DR = DRb1, DRb2, DRa

DQ = DQb e DQa

DP = DPb e DPa

Dopo stimolazione con INF-g

Trasformazione neoplastica

Cell. Endoteliali

Cell. Gastriche

Linfociti T

8

HLA Classe II

Ruolo: presentazione peptidi ai linfociti T helper

Le differenti molecole di classe II = responsabili varietà individuale della risp. Imm. Ag

Regolazione della risposta immune: cell. epiteliali del Timo = tolleranza del self

Restrizione del fenomeno citotossico per i linfociti T CD4+ citotossici

9


•Regione genomica conservatapresente in tutti vertebrati

Negli anfibi

(xenopus) sono

presenti geni di

classe I,II e III in

stretto linkage tra

loro, il che

suggerisce l’ipotesi

che questa regione

possa essere

presente da più di

370 milioni di anni

MHC

Human Leukocyte Antigen

HLA

10

http://kidslink.bo.cnr.it/aldomoro/aldomoro/alimenta/tabvert.nvm

http://kidslink.bo.cnr.it/aldomoro/aldomoro/alimenta/tabvert.nvm

The biological importance of HLA

Nature had certainly not maintained a polymorphism such as that of HLA only to frustrate transplant

surgeons.

(Ceppellini, 1967)

12

•Legame del peptide alle molecole di MHC di classe II all’interno di particolari vescicole

•Espressione del complesso MHC-peptide sulla superficie cellulare

•Riconoscimento del complesso da parte dei linfociti TH

•Processamento dell’Ag in specifici compartimenti cellulari con generazione di frammenti peptidici

•Endocitosi dal compartimento extracellulare all’interno delle APC

Processamento e presentazione dell’Ag: tappe principali

14

Presentazione dell’antigene in associazione a molecole MHC di classe I

15

HLA

16

Le molecole di classe I sono il risultato dell’assemblaggio di una catena pesante a codificata dai geni MHC e da una catena leggera, la b2-microglobulina il cui gene è situato sul cromosoma 15.

La catena pesante è suddivisa in tre porzioni (dominii) di cui la 1° e la 2°

sono polimorfiche.

Molecole HLA

Struttura terziaria

17

dominio a1 dominio a2 dominio a3

Posizione nella sequenza

le posizioni da ~60 a 83; da 92 a ~120 e da ~ 145 a 165.

Queste aree sono anche chiamate regioni ipervariabili (HVR - in analogia con la terminologia delle immunoglobuline).

La variabilità è massima in tre regioni dei primi due dominii:

18

http://www.icampus.ucl.ac.be/FARM2190/document/jcrenauld-04/04-07-HLA/ecran14.gif

http://www.icampus.ucl.ac.be/FARM2190/document/jcrenauld-04/04-07-HLA/ecran14.gif

Le molecole di classe II, sostanzialmente simili a quelle di classe I, sono costituite da una catena a e una catena b codificate da geni della regione MHC.Entrambe le catene hanno due dominii e partecipano, con il primo, alla formazione della tasca ABC:la diversità è situata nel dominio-b1, dell’esone 2,

Catena a

Catena b

Struttura terziaria

19

Base Molecolare dei tipi e delle varianti MHC

POLIMORFISMO

Presenza ad in singolo locus genetico di varianti (alleli) con

frequenza >1% in una popolazione.

I geni MHC presentano il massimo grado di polimorfismo noto

I tipi e le varianti delle molecole MHC di un individuo non variano nel corso

della sua vita.

La diversità delle molecole MHC esiste soprattutto a livello di popolazione.

Ciò è in netto contrasto con la diversità dei recettori dei linfociti T e B e delle

immunoglobuline che si riscontra nell’individuo stesso.

POLIGENIA

Molti geni MHC di classe I e di classe II codificano per tipi

differenti di molecole MHC con un range di specificità di

legame per il peptide da presentare

Monogenia : un gene è responsabile da solo per la presenza di un

carattere (p.e. gene del daltonismo nell’uomo):

Poligenia : per determinare un carattere specifico servono diversi

geni che si possono trovare anche su diversi cromosomi

POLIGENIA ADDITIVA: Quando ogni gene, preso

singolarmente, avrebbe un effetto piuttosto limitato, ma in grado

di cumularsi con l'azione modesta, ma simile, degli altri Poligéni.

POLIGENIA COMPLEMENTARE: (geni modificatori) Quando

l'azione dei poligéni non si somma, ma contribuisce parzialmente

alla formazione di un carattere complesso.

20

HLAPosizione: braccio corto cromosoma 6 (6p21.3), a circa 6.000 Kb dal centromero una parte della regione MHC, che si estende

per circa 4 milioni di paia di basi (pb), circa 0.1 % del genoma nucleare

MHC = 2/3 geni HLA I e II, 1/3 HLA classe III (fattori complemento, ormoni, shock protein …)

Disposizione (a partire dal centromero):

21

HLA

Regione HLA: circa 4.000kb, 3 serie di loci

che codificano per 3 tipi di molecole diverse

Classe I, II e III.

22

Mappa dettagliata della regione HLA

24

HLA map 2005

25

Codominanza• La codominanza è un evento genetico che si riscontra quando due alleli si manifestano entrambi

in modo completo, e quindi entrambi sono riconoscibili negli eterozigoti, dal punto di vista del fenotipo.

• La codominanza si manifesta negli individui diploidi o poliploidi. Un individuo diploide (come l'uomo) è dotato di un doppio assetto cromosomico, i due cromosomi di una stessa coppia cromosomica porteranno due alleli (uno per ogni cromosoma) per uno stesso gene. Gli alleli possono essere uguali e dominanti (omozigote dominante), uguali e recessivi (omozigote recessivo) o diversi (eterozigote). Nell'eterozigote un allele (dominante) può prevalere sull'altro (recessivo) ed il fenotipo è determinato solo da un allele (quello dominante). In alcuni casi la dominanza può non essere completa ed in altri casi si può manifestare la codominanza: entrambi gli alleli si manifestano nel fenotipo.

• Un esempio è il sistema sanguigno A,B,0, che è costituito da 3 alleli (IA,IB,I0), la cui combinazione determina 4 fenotipi (gruppi sanguigni): tipo A (IAIA o IAI0 ), B (IBIB o IB I0), 0 (I0 I0) ed AB (IA IB), IA IB sono dominanti su I0 e codominanti fra loro. Ogni allele specifica per un antigene (gli individui A avranno l'antigene A, i B l'antigene B, gli 0 nessun antigene e gli AB entrambi) che verrà riconosciuto da un anticorpo (tenendo presente che generalmente un individuo non produce anticorpi contro se stesso). Così un individuo A avrà l'antigene A, se il suo sangue viene trasferito in un individuo B, questo riconoscerà l'antigene come estraneo e svilupperà una azione immunitaria. I globuli rossi verranno agglutinati portando ad insufficienza nell'azione di alcuni organi ed anche la morte. Gli individui AB esprimono entrambi gli antigeni (codominanza) e quindi non sviluppano anticorpi, per questo sono detti accettori universali. Gli individui 0 non esprimono alcun antigene e quindi sono detti donatori universali. 26

http://it.wikipedia.org/wiki/Alleli

http://it.wikipedia.org/wiki/Eterozigoti

http://it.wikipedia.org/wiki/Fenotipo

http://it.wikipedia.org/wiki/Diploide

http://it.wikipedia.org/wiki/Uomo

http://it.wikipedia.org/wiki/Cromosomi

http://it.wikipedia.org/wiki/Omozigote

genetica HLA

A1 A2

A3A1 A2A3 A1 A11 A2 A11

alleli codominanti

Es. locus A

X

A11A3

27

genetica HLA

A1B8DR3

A2B12DR7

A11B13DR5

A3B7DR2

i geni MHC tendono ad essere ereditati en bloc (aplotipi)

A1B8DR3

A3B7DR2

A2B12DR7

A3B7DR2

A1B8DR3

A11B13DR5

A2B12DR7

A11B13DR5

X25% identità

28

l’entità del polimorfismogenetica HLA

Se consideriamo solo i loci ABC, sono possibili:

* v. “linkage disequilibrium”

Gli alleli HLA hanno mediamente bassa frequenza nella popolazione, tranne alcune eccezioni, e sono assai numerosi.

266HLA C

830HLA B

489HLA A

489 x 830 x 266 = 107.961.420 teoriche* combinazioni alleliche!

Estrema variabilità inter-individuale

30

A B C DRB1 attesi

Alleli 489 X 830 X 266 X 463 = 49.986.137.460

NUMERO TEORICO

COMBINAZIONI ATTESE

31

5 10 15 20 25

A*01010101 - ----TCC CAC TCC ATG AGG TAT TTC TTC ACA TCC GTG TCC CGG CCC GGC CGC GGG GAG CCC CGC TTC ATC GCC GTG GGC

A*02010101 --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- - -- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- ---

30 35 40 45 50

A*01010101 TAC GTG GAC GAC ACG CAG TTC GTG CGG TTC GAC AGC GAC GCC GCG AGC CAG AAG ATG GAG CCG CGG GCG CCG TGG A*02010101 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -G- --- --- --- --- --- --- ---

55 60 65 70 75

A*01010101 ATA GAG CAG GAG GGG CCG GAG TAT TGG GAC CAG GAG ACA CGG AAT ATG AAG GCC CAC TCA CAG ACT GAC CGA GCG

A*02010101 --- --- --- --- --T --- --- --- --- --- GG- --- --- --- --A G-- --- --- --- --- --- --- C-- --- -T-

80 85 90 95 100

A*01010101 AAC CTG GGG ACC CTG CGC GGC TAC TAC AAC CAG AGC GAG GAC G|GT TCT CAC ACC ATC CAG ATA ATG TAT GGC TGC -----A*02010101 G-- --- -- - --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -C- -|- - --- --- --- G-- --- -GG --- --- --- ---

1. in molteplici variazioni nucleotidiche nella sequenza

§ primi 100 codoni

§

Il polimorfismo e la specificità antigenica consiste:

(cui corrispondono sostituzioni aminoacidiche)

33

•Tipo di incrocio = “Assortative mating”: Positive assortative mating or Negative assortative mating

Il polimorfismo, anche nella regione HLA, è il risultato di eventi casuali (mutazioni, conversione genica, ecc.).

Il suo mantenimento a livelli così elevati è il risultato dell’azione di forze selettive nel corso dell’evoluzione, tra cui sopratutto:

• Pressione selettiva da parte di agenti patogeni = “Pathogen-driven balancing selection” (PDBS) → + probabile.Pathogen-driven selection and worldwide HLA class I diversity (Curr Biol. 2005 June 7; 15(11): 1022–1027)

come si mantiene il polimorfismogenetica HLA

34

Molecole MHC differenti sono in grado di legare diversi tipi di peptidi antigenici; pertanto gli eterozigoti per MHC presentano una grande varietà di peptidi patogeni in confronto a soggetti omozigoti.

1) vantaggio dell’eterozigote

Maggiore resistenza ad agenti patogeni

Vantaggio riproduttivo (fitness)

Con incremento degli eterozigoti rispetto agli altri genotipi

35

2) selezione frequenza–dipendente

La selezione si ritiene che abbia favorito i genotipi MHC rari in quanto i patogeni avrebbero maggiore probabilità di sviluppare meccanismi atti a evitare l’immunità MHC-dipendente sostenuta da genotipi comuni.

Maggiore resistenza ad agenti patogeni

Vantaggio riproduttivo (fitness)

la frequenza di alleli rari tende ad aumentare mentre la frequenza degli alleli comuni tende a diminuire (polimorfismo dinamico).

36

Evolution of pathogens to evade MHC-mediated

antigen presentation

In south east China & Papua New Guinea up to 60% of

individuals express HLA-A11

HLA-A11 binds an important peptide of Epstein Barr Virus

Many EBV isolates from these areas have mutated this peptide

so that it can not bind to HLA-A11 MHC molecules

Suggests that selective pressures may operate on MHC polymorphism

Replacement substitutions occur at a higher

frequency than silent substitution

Evolution of the MHC to eliminate pathogens

In west Africa where malaria is endemic HLA-B53 is commonly

associated with recovery from a potentially lethal form of malaria

37

unioni preferenziali basate su una maggiore diversità per geni MHC rispetto ad unioni casuali.

In questo caso l’MHC viene utilizzato per agire contro una identità genetica per loci altamente polimorfici al fine di conservare l’eterozigosi.

-tipo di incrocio = “assortative mating”:

38

Applicazioni della Tipizzazione

Tissutale

Pazienti candidati al trapianto di midollo osseo o organi solidi

HLA di urgenza (possibile donatore in punto di morte)

Riconoscimento di paternità

Associazione tra HLA e malattie

Ricerca Biomedica39

HLA e trapianti:

Alla ricerca del donatore istocompatibile

40

Trapianto del midollo osseo e delle cellule

staminali

• Compatibilità HLA essenziale (per i trapianti solidi importante ma non imprescindibile)

• Persone HLA identiche: coppia formata da fratelli (uguali anche nelle zone non caratterizzate) o non consaguinei (fenotipi uguali ma non aplotipi)

• Preferenza donatore :1) gemello monozigote, 2) fratello HLA genotipicamente identico (25%), 3)familiare HLA compatibile (3-4 %), 4) donatore non apparentato HLA fenotipicamente identico, 5) donatore non apparentato diverso per 1 o + caratteristiche HLA, 6) familiare aploidentico.

• 70% dei TMO non donatore fra i familiari

• La frequenza genica è differente da popolazione a popopolazione

• Linkage disequilibrium (associazioni negative e positive)

• Aplotipi ancestrali (1/3 in alcune popolazioni caucasiche)

• 6.500.000 (3.500.000 tipizzati anche per DR) 80 % almeno un volontario HLA-ABDR, con anche compatibilità DRB1* (50%)

• Oggi tipizzazione ad alta risoluzione anche per gli alleli DRB,DQB1* e DPB1*

41

Ricerca di donatore non consaguineo

• Il paziente tipizzato: HLA classe I ed i loci DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5* e DQB1*

• Standard IBMDR (Italian Bone Marrow Donor Registry ): compatibile quando fenotipicamente identico almeno per HLA-AB e gli alleli DRB1* (in diverse occasioni: anche differenze per una caratteristica HLA di classe I)

42

HLA e malattie

46

HLA & Malattie

Alcune malattie sono associate alla presenza di un determinato HLA

Definire una frequenza significativamente elevata rispetto alla popolazione sana

RR = Frequenza Atg HLA negli affetti

Frequenza Atg HLA nei sani

RR > 1 = Associazione positiva

RR < 1 = Associazione negativa

RR = 1 = No Associazione

Malattie a patogenesi immunitaria con caratt. a comune:

eziologia multifattoriale

familiarità (comp. ered. polig.) 47

HLA & Malattie

48

HLA-B27

Spondilite anchilosante

50

HLA come fattore di rischio nelle

malattie autoimmunitarie

Modello 1

alcune molecole HLA presentano meglio peptidi patogeni

simili a peptidi “self” alle cellule T

il risultato sarà una risposta autoimmunitaria

Modello 2

alcune molecole HLA sono più o meno efficienti nella

presentazione di peptidi “self” alle cellule T

il risultato sarà una mancata selezione negativa e

conseguente risposta autoimmunitaria

52

Diabete di tipo I• Nei giovani diabetici gli antigeni DR3 e/o DR4 sono presenti nel 97% dei casi

(contro il 60% della popolazione); il genotipo DR3/DR4 ricorre nel 30% dei casi (contro il 6% della popolazione). Nella nostra etnia il DR4 sembra conferire maggiore rischio rispetto al DR3. La presenza di entrambi fa aumentare il rischio di quasi 10 volte (sempre nei confronti della popolazione).

• Sono particolarmente a rischio i fratelli HLA identici di un giovane diabetico: si ammalano di diabete nel 58% dei casi. Sono a rischio anche i fratelli HLA aploidentici che ammalano nel 37% dei casi

• Per i soggetti HLA DR3 e/o DR4 è auspicabile la tipizzazione degli alleli DQ

• La presenza di una acido aspartico alla posizione 57 dell'HLA DQb si è dimostrata fortemente protettiva per l'insorgenza del diabete. D'altra parte, la presenza nella stessa posizione degli aa Alanina, Valina o Serina, predispone allo sviluppo del diabete. Un analogo discorso può essere fatto in alcuni soggetti per l'arginina alla posizione 52 dell'HLA DQa

• E' possibile che queste regioni HLA siano implicate nel legame di peptidi importanti per l'inizio della reazione autoimmune contro il pancreas. Secondo calcoli matematici però, l'HLA è in grado di spiegare solo il 35 % circa della suscettibilità genetica.

54

Celiachia

• Condizione necessaria per sviluppare la celiachia è infatti la presenza sulla membrana delle cellule immunocompetenti di una molecola HLA di classe II (codificata dagli alleli a 0501 e b 0201), in grado di legare con alta affinità peptidi di gliadina e di presentarli agli specifici linfociti T.

• Quando la tipizzazione HLA veniva effettuata con tecniche sierologiche questa configurazione prendeva il nome di DQ2.

• In realtà non sempre al fenotipo DQ2 (identificato per via sierologica) corrisponde la presenza dell'eterodimero caratteristico della celiachia. L'eterodimero "celiaco" è sempre presente quando al DQ2 si associa il DR3 (aplotipo DQ2-DR3) e in soggetti con aplotipo DQ2-DR7/DR5. Nel primo caso, l'analisi di linkage ci mostra che sullo stesso cromosoma sono presenti sia i geni della catena a, A0501, che quelli della b, B0201, (configurazione in cis). Nel secondo caso i due geni si trovano su cromosomi diversi (in trans): sul cromosoma che esprime la specificità sierologia DR7 è presente la sequenza B 0201 per la catena b mentre sul cromosoma che esprime DR5 la sequenza A 0501 per la catena a.

• In una minoranza dei celiaci (8%) la predisposizione è legata al DQ8 associato al DR53, ugualmente dotato di alta affinità per la gliadina.

• Per quanto necessario, l'HLA non è però sufficiente a far sì che si sviluppi la malattia. Solo una piccola parte dei soggetti con gli HLA descritti (presenti quasi nel 40% della popolazione) hanno la celiachia.

• L'assenza degli HLA tipici ha comunque un elevato valore predittivo negativo nella diagnosi di celiachia.

57

Celiachia

• Alcune molecole HLA sono state selezionate dall'evoluzione per la loro capacità di legare e presentare proteine appartenenti ai patogeni più comuni

• Tra questi HLA, probabilmente è anche il DQ2, tipico del soggetto celiaco,

(presente complessivamente in circa il 30% della popolazione)

• Semplificando, possiamo ipotizzare che nell'era pre-agricola l'utilità dell'HLA DQ2 nella risposta alle infezioni (allora comuni) sia stata di gran lunga più importante della sua dannosità dovuta al riconoscimento del glutine (che in quell'epoca era quasi assente dall'alimentazione umana). Per questo motivo questo HLA sarebbe stato trasmesso così frequentemente dai nostri antenati.

58

http://www.pediatria.univ.trieste.it/archi/CD/Multifatt/CD_HLA.htm

HLA e Ricerca

• Determinazione dei peptidi immunodominanti

• Immunoterapia

64

Immunodominanza

• Peptidi più immunogeni di altri

• Programmi specifici in grado di predire quali peptidi di una singola proteina sono più immunodominanti

• http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html

• http://www.imtech.res.in/raghava/propred/

65

http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html

ESAT-6:

mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatateln

nalq


HLA A1 - 9 mers

Max. score that could've been reached using this molecule type 50

Rank Start position Sequence % of max. score Score

1 61 ATELNNALQ 40 % 20

2 0 MTEQQWNFA 36 % 18

3 42 WGGSGSEAY 34 % 17

4 46 GSEAYQGVQ 32 % 16

5 21 VTSIHSLLD 30 % 15

6 27 LLDEGKQSL 26 % 13

7 28 LDEGKQSLT 26 % 13

8 9 GIEAAASAI 20 % 10

9 22 TSIHSLLDE 20 % 10

10 56 KWDATATEL 20 % 10

11 14 ASAIQGNVT 18 % 9

12 29 DEGKQSLTK 16 % 866


http://www.imtech.res.in/raghava/propred/

ESAT-6:

mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqk

wdatatelnnalq

DRB1_0101:

MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSE

AYQGVQQKWDATATELNNALQ

DRB1_0307:

MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEA

YQGVQQKWDATATELNNALQ

67

HLA ed IMMUNOTERAPIA

Cancro gastrico

68

ADENOCARCINOMA GASTRICO

SUDDIVISO FENOTIPICAMENTE IN:

• Carcinoma di “tipo intestinale”

(+ frequente, prevalenza uomini > 50 anni)

• Carcinoma di “tipo diffuso”

(- frequente, uomini/donne: 45 anni) 69

Carcinogenesi

70

Trattamenti

(Consolidati)

Asportazione del tumore primitivo e

dell’intera rete linfatica di drenaggio

Rimozione chirurgica + Chemioterapia

Rimozione chirurgica + Radioterapia

Tasso di sopravivenza 5 anni: 15-35 %

87 % recidive loco-regionali 71

Trattamenti (Innovativi)

Inibitori dell’ EGFR

Agenti Anti-angiogenesi

Promotori dell’apoptosi

Immunoterapia Specifica (Pub med: 749 citazioni/119

rev.)72

Immunoterapia

73

Antigeni Tumore-Associati

CDX1- CDX2

ITF (Intestinal-Trefoil Factor)

MAGE-1

MAGE-2

MAGE-3

c-ErB-1

c-ErB-2

Sart (1/2/3)

lck

Her-2/neu74

Scopo

Livello locale (isolamento e caratterizzazione fenotipica/

funzionale dei linfociti intratumorali)

Livello periferico (isolamento e caratterizzazione

fenotipica/ funzionale dei linfociti dal sangue periferico)

Verificare risposta T specifica per antigeni (peptidi) tumorali in pazienti con adenocarcinoma gastrico

75

MESSA IN COLTURA DEL TESSUTO

NEOPLASTICOPRELIEVO

FRAMMENTAZIONE

LAVAGGI

TERRENO DI COLTURA (rIL-2)

(7gg RPMI 1640 + 50U IL-2)

LINEE CELLULARI T ATTIVATI

CLONAZIONE

AD ALTA EFFICIENZA

SPECIFICITA’

PRODUZIONE CITOCHINE

FUNZIONI CITOTOSSICHE 76

Peptidi Usati (GCAA)

• SART: Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cells

• Cyp: Peptidylprolyl isomerase B (cyclophilin B)

• lck: lymphocyte-specific protein tyrosine kinase

• ART: adenocarcinoma antigen

• EIF4BP: elF-binding protein

• ppMAPkkk: partial putative mitogen-activated protein kinase kinase kinase

• WHSC2: Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 2 protein

• UBE2V: ubiquitin-conjugating enzyme variant Kua

• HNRPL: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L

Amedei A .Cancer Immunol Immunother. 2009

14

16

77

Pazienti

Età media: 68 anni

Asportazione del tumore primario

No chemioterapia

No immunosoppressione, Autoimmunità

No Infezioni

Amedei A .Cancer Immunol Immunother. 2009

Aplotipo Pazienti

5: HLA- A02/24

8: HLA-A02

7: HLA-A24

8

78

Linfociti T GCAA-specifici infiltrano il tessuto neoplastico

Cloni T CD4+: 65/437 (15 %)

Cloni T CD8+: 59/316 (18 %)

30: peptidi HLA-A24

35: peptidi HLA-A02

29: peptidi HLA-A24

30: peptidi HLA-A02

Pazienti

Controlli

Cloni T CD4+: 0/282

Cloni T CD8+: 0/12080

Repertorio delle GCAA-specificità dei cloni T

40

31

81

Clonicità dei linfociti T GCAA-specifici

Batteria di 24

anticorpi

monoclonali

(TCR Vß

Repertoire Kit,

Beckman

Coulter): Vß1,

Vß2, Vß3, Vß4,

Vß5.1, Vß5.2,

Vß5.3, Vß7.1,

Vß7.2, Vß8,

Vß9, Vß11,

Vß12,Vß13.1,

Vß13.2,Vß13.6

Vß14, Vß16,

Vß17, Vß18,

Vß20, Vß21.3,

Vß22 Vß23.

82

Effetto sulla proliferazione dei cloni GCAA-specifici

degli Ab-HLA-I/II

38/65 (58%) = HLA class I-ristretti Circa 1 clone CD4+ per paziente83

Riferimenti Bibliografici

84

Profilo Th1 dei cloni T TIL-derivati

Stimolazione: 48 Ag(10mg/ml) +

5 x 105 APC autologhe irradiate

17% CD4+ = Th0

25% CD8+ = Th0

85

Citotossicità (perforina-mediata) indotta dalla

stimolazione con GCAA-peptidi

Cell.Effettrice/Cell. Bersaglio = 10/1

CD4+= 50 Th1 + 11/15 Th0

94%

CD8+= 44 Tc1 + 15 Tc0

100%

I blasti T coltivati con le EBV-B

autologhe, caricate con Ag-specifico e

marcate Cr51 8 h 37 C°

86

Attività pro-apoptotica (Fas-FasL) dei cloni

TIL-derivatiBlasti stimolati (PMA10 ng/ml + Iono. 1mmol/ml) in presenza di cellule Jurkat Fas+ marcate Cr51 18 h 37 C°

CD4+ = 50/ 65 (77%)

CD8+ = 50/ 59 (85%)87

Linfociti T GCAA-specifici nel sangue

periferico dei pazienti con AG

PBMC (3x 105) coltivati per 5 gg in presenza di terreno e terreno + GCAA antigene (10mg/ml)

14/ 20 (70%) PBMC pazienti proliferavano in presenza dei peptidi GCAA

4 (HLA-02+/HLA-A24+) : proliferavano a peptidi di ambedue le classi

6 (HLA-02+/HLA-A24-) : proliferavano a peptidi HLA-A02-ristretti

4 (HLA-02-/HLA-A24+) : proliferavano a peptidi HLA-A24-ristretti

6 pazienti + 15 controlli : non proliferavano a nessun peptide

89

Linee T GCAA-Indotte da PBMC dei

pazienti con Adenocarcinoma gastrico

5 gg di stimolo con il peptide GCAA

7 gg con terreno + rIL-2

10 gg = valutazione intracitoplasmatica CKS

Stimolo (6 h) = Pep (10mg/ml) + a-CD28 (1mg/ml) + a-CD49d (1mg/ml)

16/20 pazienti (80%) = linee GCAA-indotte

4 pazienti = no linee GCAA-indotte

6 pazienti = no proliferazione PBMC

3 pazienti (1.BB, 7.CS, 16.MG) = no

cloni TIL-deriv

90

Profilo Th1 nelle linee GCAA-Indotte ed

ottenute da PBMC

Media : 11 %

Media : 15 %

91

Conclusioni (i)Maggioranza dei cloni T (CD4+/CD8+) TIL-derivati e GCAA-peptidi-specifici

mostra profilo citochinico Th1/Tc1

Artefatto della coltura in vitro (rIL-2) ?: studi precedenti mostrano predominanza di

cloni T Th0 isolati da pazienti con gastrite cronica o Th2 se isolati da pazienti con

Asma allergico.

92

Conclusioni (I)Simili percentuali di cloni T GCAA-peptide-specifici ottenuti dai CD8+ (18 %) e

CD4+ (15%) ottenuti dai TIL della neoplasia gastrica

Repertorio vario delle specificità dei cloni T peptide-specifici ottenuti dai TIL;

Predominanza SART3 (24 cloni) e lck (32)

93

Conclusioni (i)15% dei pazienti impossibile isolare ed espandere linfociti T GCAA-peptide-specifici

No risposta ? Risposta debole (no rilevabile) ?

100 % cloni CD8+ e 94% cloni CD4+ presentano armamentario citotossicità

(usando E-BVB autologhe + peptidi dei GCAA)

81% cloni TIL – derivati sono capaci di indurre apoptosi Fas-FasL

(usando Jurkat cells + mitogeno)

94

Conclusioni (i)

I cloni T derivati dai TIL isolati dal tessuto dell’Adenocarcinoma gastrico

mostrano

citotossicità specifica per i peptidi degli antigeni tumorali

Importante requisito per rendere efficace l’immunoterapia del

Cancro Gastrico

95

Conclusioni (iI)Linfociti T specifici per i peptidi GCAA evidenziati nel sangue periferico del 70 %

Dei pazienti (14/20) con adenocarcinoma gastrico (proliferazione PBMC)

Numero troppo basso di linfociti T tumore-specifici in

circolo (metodica non sensibile)

Confinamento dei linfociti T

tumore-specifici

3/6 pazienti: 1.BB, 7.CS, 16.MG no isolamento linfociti T peptide-specifici

96

Conclusioni (iI)16/ 20 pazienti indotte linee GCAA-specifiche

Molti linfociti evidenziano IFN-g intracitoplas. (Th1) ma poca/nulla IL-4 (Th0)

Sti

mo

lazio

ne

pe

pti

de

-

sp

ec

ific

a

1.BB, 7.CS, 16.MG no induzione linee T peptide-specifiche

Ipotesi: Incapaci di montare risposta contro cellule della neoplasia gastrica97

Linfociti T GCAA-specifici Th1 e con spiccata attività citotossica

Inefficaci nel bloccare la crescita tumorale

98

Condizioni In Vivo differenti dalle condizioni di attivazione in vitro

dei linfociti T Tumore-specifici

Inattivazione della risposta immune specifica

Escape tumorale Produzione di fattori bloccanti (cks, etc)

Arruolamento di linfociti T regolatori

99

Immunoterapia del cancro gastrico :

Illusione o possibilità terapeutica?

A volte il vincitore

è semplicemente chi

non ha mai mollato

Jim Morrison

Non importa, se stai procedendo molto lentamente;

ciò che importa è che tu non ti sia fermato.

Confucio

Possibilità Terapeutica:

Inizio di un cammino ancora lungo

100

Tipizzazione HLA

(Tissutale)

Tecnica

SierologicaTecnica Biologia

Molecolare

PCR – SSP

PCR – SSO

PCR - RFLP

Test di Linfotossicità Complemento Dipendente

101

Test di Linfotossicità Complemento

DipendenteAntigeni caratterizzati tramite utilizzo di Alloanticorpi naturali che fissandosi

Agli antigeni HLA che sono presenti sulle cell. bersaglio attivano il complemento

Disporre di una serie di antisieri in grado di riconoscere le diverse specificità HLA

Antisieri monoclonali o alloantisieri

Metodica:Estrazione dei linfociti: una provetta per classe: 4 ml (Classe I) 2 ml (Classe II)

100 ml di biglie immunogenetiche (ant. Specifici per B e T)

Centrifugazione: I linfociti T e B si dispongono a rosetta attorno alle biglie

Portaprovette con magnete; T e B si legano alla parete

Sospensione dei linfociti in PBS

Semina in piastre tipizzanti: 144 pozzi (classe I) e 72 (classe II) contenenti antisieri

Incubazione 40/60 min

Dispensazione del Complemento di coniglio (incubazione 60 min)

Dispensazione di Fluoroquence

Lettura al microscopio a fluorescenza

102

Test di Linfotossicità Complemento

Dipendente

103

Tecnica di Biologia Molecolare

PCR - SSPUso di coppie di primers sequenza specifica: riconoscono in modo specifico un allele

PCR contemporanee ( 96 totali) ciascuna caratt. da una diversa coppia di primers

Primers: stessa lunghezza e temp. di allineamento = unico programma

coppia di primers aspecifici = controllo positivo

primer mix

Molto precisa ma si adatta poco alla grande mole

Fasi: Estrazione del DNA

Amplificazione con primers sequenza-specifici

Rivelazione su gel di Agarosio

Lettura

104

PCR – SSP

Risultati

105

PCR – SSP

Risultati

106

PCR – SSP

Risultati

107


PCR - SSO

Principio: Oligonucleotidi sequenza specifici che si comportano come sonde

che indicano la presenza o l’assenza della seq. caratt, di un allele o gruppo di alleli

Ottimo metodo per la tipizzazione molecolare a bassa risoluzione di

un grande numero di campioni (diagnostica di routine)

Fasi: Estrazione del DNA

Amplificazione con primers oligonucleotidi-sequenza-specifici

Rivelazione su striscia di nylon

Lettura

108


PCR – RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Principio: polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione ottenuti

dalla digestione con enzimi di restrizione di un amplificato di DNA

Metodica : 2 passaggi

Amplificazione specifiche regioni Caratterizzazione Allelica con digestione

Tempo di esecuzione: 10-24 h

Tecnica obsoleta: in passato per tipizzare DP e DQ

109

La presentazione dell’antigene

Corso per tecnici di laboratorioAnno Accademico 2016-2017

Prof. Amedeo Amedei

110

Antigeni ed immunogeni

Antigenicità: descrive la capacità dell’antigene a legarsi ad unrecettore, ovvero di essere riconosciuto dal sistemaimmunitario.

Immunogenicità: descrive la capacità di un antigene distimolare una risposta immune

Un antigene può non essere necessariamente un immunogeno

111

I tre dogmi della presentazione convenzionale dell’antigene

1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione (processing)

2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecoledi istocompatibilità di classe I o II (presentazione)

3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associatoalla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigenicitosolici è associato alla molecola CD8 (costimolo)

112

I tre dogmi della presentazione convenzionale

dell’antigene

1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione (processing)


3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associatoalla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigenicitosolici è associato alla molecola CD8 (costimolo)

Presentazione MHC-dipendente113

Altre modalità di riconoscimento dell’antigene

(presentazione non convenzionale)

1. Riconoscimento dei superantigeni

2. Presentazione MHC-indipendente

3. Presentazione attraverso la molecola CD1

4. Cross-presentazione

114

I tre dogmi della presentazione dell’antigene

1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione(processing)


3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associatoalla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigenicitosolici è associato alla molecola CD8

115

APC e risposta T cellulare

TAntigene solubile

+ = Nessuna risposta immune

sangue

116


APC Th

TAntigene solubile


Antigene presentato

= Risposta immunitaria specifica

sangue

117


APC Th

TAntigene solubile


Antigene presentato


sangue

proliferazione 118


APC Th

TAntigene solubile


Antigene presentato


sangue

proliferazione 119

Processazione e presentazione degli Ag extracellulari e citosolici

Linfociti CD4 Linfociti CD8

Si NoAPCEndocitosi+

T

sangue

Atg solubile

120



No SiAPC+

T

sangue

Transfezione

Plasmide

121



No SiAPC

T

sangue

Shock osmotico

122


APC

Risposta CD4 Risposta CD8

Si No

No Si

No Si

Trasfezione

APC

Endocitosi

APC

Shock osmotico

+

+

+

I linfociti CD4 riconoscono antigeni solubili mentre le cellule CD8 riconoscono antigeni presenti nel citosol cellulare

123


APC


Si No

No Si

No Si

Trasfezione

APC

Endocitosi

APC

Shock osmotico

+

+

+

I linfociti CD4 riconoscono antigeni solubili presentati in associazione con le molecole di MHC classe II

124


La molecola CD4 si lega all’MHC classe II (costimolo)

The immunologicalsynapsis

125


La molecola CD4 si lega all’MHC classe II (costimolo)126


APC


Si No

No Si

No Si

Trasfezione

APC

Endocitosi

APC

Shock osmotico

+

+

+

I linfociti CD8 riconoscono antigeni citosolici presentati in associazione con le molecole di MHC classe I

127


La molecola CD8 si lega all’ MHC classe I (costimolo)

The immunologicalsynapsis

MHCClass I

CD8

128


La molecola CD8 si lega all’ MHC classe I (costimolo)129

Significato del processing

130

Significato del processing

131

MHC class I-dependent presentation

132

Evidence of MHC-Class I restriction in

virus presentation

MHCa

MHCb

MHCa

MHCb

Virus X

Virus X

133


virus presentation

MHCa MHCa

Virus X

sangue sangue

MHCa

cellule infette

cellule infette

Virus X

134


virus presentation

MHCa MHCa

Virus X

sangue sangue

MHCa

cellule infette

cellule infette

Virus X

135


virus presentation MHCb MHCb

Virus X

MHCb sangue sangue

cellule infette

cellule infette

Virus X

136



Virus X

MHCb sangue sangue

cellule infette

cellule infette

Virus X

137


virus presentation

138


virus presentation

MHCa MHCa

Virus X

sangue sangue

cellule infette

cellule infette

Virus X

MHCb

139



Virus X

sangue sangue

cellule infette

cellule infette

Virus XMHCa

140


virus presentation

141


virus presentation

142

MHC class I-dependent

presentation

1° phase processing

143

La struttura del proteasoma

The proteasome is part of the ubiquitin-dependent degradation process of cytoplasmic proteins. The 26S proteasome is a multicatalytic protease that is found in the cytosol, perinuclear regions and nucleus of eukaryotic cells.

Ubiquitination favors a more efficient peptide presentation

144

Struttura del proteasoma

The 20S proteasome (2,100 kDa)as an assembly of two outer (α)and two inner (β) heptameric rings.It forms a cylindrical structurewhere proteolysis occurs (β rings) hydrolysis of proteins at theCOOH- terminus of hydrophobic,basic and acidic residues(chymotrypsin-like, trypsin-likeand peptidylglutamyl-peptidehydrolytic activities).This prevents the indiscriminatedegradation of intracellularproteins.

28 sub-units(20S proteasome)

145


The 20S proteasome could be responsible for the degradation of oxidatively damaged proteins, which occurs in an ATP- and ubiquitin-independent manner.

The PA28 (11S) regulatory (REG) complex (180 kDa) opens the channel through the complex, via an ATP-independent process and mediates the degradation of non-ubiquitinated short peptides 146


The outer rings comprise sevendifferent α subunits, withoutcatalytic activity, serving as ananchor for the multisubunitATPase-containing PA700 (19S)regulator (700 kDa) and formingthe 26S proteasome.

7 sub-units

7 sub-units

constitutively or inducibly expressed, and assembled selectively to form complexes with distinct proteolytic characteristics, adapting to altered physiological conditions

+

147



26S proteasome

7 sub-units

7 sub-units

+

148



26S proteasome

7 sub-units

7 sub-units

+

8-10AA149

Assemblaggio del proteasoma

LMP2

LMP7

MECL-1

low-molecular mass polypeptides

multicatalytic endopeptidase complex-like-1

150

Assemblaggio del proteasoma

LMP2

LMP7

MECL-1

IFNs+

+

+

151

Proteasoma: genes and DRIPs

152

http://bmb.oxfordjournals.org/content/71/1/93/F2.large.jpg



presentation

2° phase Peptide transport

153

Alternative for production of adequate peptides

154

The cellular chaperons The molecular chaperones are a diverse set of protein families requiredfor the correct folding, transport and degradation of other proteins invivo. The chaperonins are large, double-ring oligomeric proteins thatact as containers.

bacterial chaperonin GroEL The eukaryotic chaperoninTCP1 ring complex (TRiC) isstructurally related to GroEL,but has greater similarity tothe chaperonins of archaea(thermosomes). TRiC has tworings of eight differentsubunits, which also haveequatorial ATPase domains andapical substrate-bindingdomains. It takes peptidesfrom proteasome to ER.

155


presentation

3° phase Peptide entry in ER

156

Function of

Transporters associated with antigen

processing (TAP 1 and 2)

157

TAP 1 and 2: structure and genes

158

TAP 1 and 2: structure and genes

Up-regulation of TAP transcription

IFN-alfa

159



Scoperta delle molecole TAP

160


161


NON PRESENTA

ATP-binding cassette

162

ABC proteins

Series of membrane transporters(both importers or exporters) whichutilize the energy of ATP hydrolysisto transport various substratesacross cellular membranes. They arepresent both in prokariotic andeukariotic organisms.

They can transport ions, amino acids, peptides, sugars,toxins, drugs, lipids, polysaccharides, nucleotides.

All are constituted by 4 domains (2 hydrophobic transmembrane domains

and 2 ATP-binding domains) 163

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Btucd.jpg

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Btucd.jpg


PRESENTA

164

Biology of TAPs

14 3 2

1

165

Biology of TAPs

14 3 2

2/3

166

Biology of TAPs

14 3 2

4

167


PRESENTA

Peptides are necessary for correct and stable expression of MHC class I molecules 168

The reduction in class I MHC expression is due to TAP2 deficiency.

169

http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/103/5/1770/F1.large.jpg

http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/103/5/1770/F1.large.jpg

TAP deficiency

Intracellular FACSstaining of TAP1 and TAP2proteins in two TAP1-deficient patients, theirmother, an unrelatedhealthy control patient,and the TAP competentand incompetent B-lymphoblast lines T0 andT2 respectively. Meanfluorescence intensitiesand the isotype controlbackground staining aredisplayed (y-axis counts).Lymphocyte gated analysis(x-axis FL1-H)

Isotype control

Anti-TAP1

Anti-TAP2170

TAP deficiency

Congenital HLA class Ideficiency is a rare diseasefrequently resulting inchronic inflammation of therespiratory tract, and/orskin granulomas. A possiblefurther manifestation istoxoplasmicretinochoroiditis (inabsence of HIV infection).

Isotype control

Anti-TAP1

Anti-TAP2171

http://bjo.bmj.com/content/89/12/1661/F1.large.jpg

http://bjo.bmj.com/content/89/12/1661/F1.large.jpg

TAPs and virus escape

The loading of peptide on MHC by TAPis targeted by several viruses.ICP47 from HHV-1 binds to the peptidebinding site of TAP, with 10-1000 foldhigher affinity than most peptides,thereby blocking the first step of thetranslocation pathway.HCMV US6 instead interacts with TAPfrom the RE luminal side and inhibits ATPbinding and peptide stimulated ATPhydrolysis.UL49.5 proteins have differentstrategies to inhibit TAP including blockof the binding of ATP to TAP.BNLF2a protein from Epstein-Barrvirus prevents the binding of peptidesand ATP to TAP.

172

Mechanisms of viral escape

BNLF2a proteinfrom Epstein-Barr virusprevents thebinding ofpeptides andATP to TAP

UL49.5 proteinshave differentstrategies toinhibit TAPincluding block ofthe binding ofATP to TAP.

HCMV US6insteadinteracts withTAP from theRE luminal sideand inhibitsATP binding andpeptidestimulated ATPhydrolysis.

ICP47 from HHV-1binds to the peptide binding site of TAP, with 10-1000 fold higher affinity than most peptides, thereby blocking the first step of the translocation pathway.

173


presentation

4° phase Association with MHC

174

MHC class I assembling

175

Correct folding of MHC class I molecules when in presence of presented peptides

1^ fase

176


Degen and Williams (1994) first discovered calnexin in association with MHC class I molecules synthesized by lymphoma cell lines.

Anti-Calnexin - ER membrane marker antibody

177


Calnexin is a 88 kDa chaperone protein foundin the ER.

a) Newly synthesized MHC class I alphachains bind to calnexin until two βmicroglobulins and possiby a peptide bindto the alpha chain. The heterodimer thendissociates from calnexin and continueson its pathway (Janeway et al, 1999).

b) In addition, calnexin binds with partiallyfolded immunoglobulin proteins and partialcomplexes of T cell receptor and retainsthem in the E.R. until they are completelyfolded (Janeway et al, 1999). 178


2^ fase

179


2^ fase

180

Calreticulin is a luminal protein (chaperonine), travels freely within theER lumen, interacts with its protein-folding intermediates and is vital inseveral cellular functions (cell-cell communication and recognition; immuneresponses and recognition; ion, solute, and metabolite fluxes; intracellularprocessing of metabolites).It binds monoglucosylated carbohydrate which is typically found on newly-synthesized proteins before they leave the ER. The C-terminal region ishighly acidic, binds Ca2+ and is involved in Ca2+ storage. Ca2+ binding tocalreticulin and, consequently, changes in the ER Ca2+ storage capacity,affect the protein’s chaperone function.

Calreticulina ed Epr57

181

Calreticulin is a luminal protein (chaperonine), travels freely within theER lumen, interacts with its protein-folding intermediates and is vital inseveral cellular functions (cell-cell communication and recognition; immuneresponses and recognition; ion, solute, and metabolite fluxes; intracellularprocessing of metabolites).It binds monoglucosylated carbohydrate which is typically found on newly-synthesized proteins before they leave the ER. The C-terminal region ishighly acidic, binds Ca2+ and is involved in Ca2+ storage. Ca2+ binding tocalreticulin and, consequently, changes in the ER Ca2+ storage capacity,affect the protein’s chaperone function.

Calreticulin deficiency is

embryonic lethal because it causes

lesions during cardiac

development

Calreticulina ed Epr57

182

Calreticulina ed Epr57ERp57 is a thioloxidereductase, memberof the PDI family ofproteins whichassociates with thesubstrates recognizedby both calreticulin andcalnexin.

ERp57 has been shown to catalyse the formation of nativedisulphide bonds in glycoproteins and to form a stableinteraction with the MHC class I loading complex via aninteraction with tapasin (THE EMBO JOURNAL (2007 ).

183


Tapasin serves as a 'bridge'protein for uniting thiscomplex to TAP.Garbi et. al. (2003) haveshown that mice who lacktapasin have a 100-foldreduction in TAP expressionand the final 50 amino acidsof tapasin that lead to astrong bond to TAPupregulates TAP1 and TAP2(Bangia et. al. 1999) 184

Tapasin-associated immunodeficiency

The loss of tapasin is associated with would seem to lead tosimilar phenotypes as loss of TAP (Yabe et. al. 2002).The disorder known as bare lymphocyte syndrome (BLS)where a reduced MHCI : peptide on the cell surface butcompletely normal TAP are observed.

Results and discussionS.M. was a 54-year-old woman suffering from aprimary chronic glomerulonephritis for 10years. She has been receiving hemodynamicdialysis for 5 years. She had a history ofherpes zoster and polyps of stomach and colon.Because kidney transplantation has beenconsidered, S.M. was subjected to serologicalHLA typing. Her class II antigens could betyped, but class I typing was not successful.

185

Several ways for viruses to escape

186


3-4^ fase

187

How peptides are generated in proteasome and fit inside the MHC groove

The MHC class I binding groove with antigenic peptide fitted into the pocket.

NEED TO BE

OF ADEQUATE LENGHT !188


189


ERAAP (the endoplasmic reticulum aminopeptidaseassociated with antigen processing) trims the extraN-terminal residues to generate final peptides ofthe correct length, which are bound by MHC class Imolecules

190


Article Nature Immunology. 2007. 8, 101 - 108

In the absence of aminopeptidase ERAAP, MHC class Imolecules present many unstable and highly immunogenicpeptidesGianna Elena Hammer, Federico Gonzalez, Edward James, Hector Nolla & Nilabh Shastri

Those peptides are generated by proteolysis,which begins in the cytoplasm and continues inthe endoplasmic reticulum by the uniqueaminopeptidase ERAAP. The overall extent towhich trimming by ERAAP modifies the peptidepool and the immunological consequences ofERAAP deficiency are unknown. Here we showthat the peptide-MHC repertoire of ERAAP-deficient mice was missing many peptides.Furthermore, ERAAP-deficient cells presentedmany unstable and structurally unique peptide-MHC complexes, which elicited potent CD8+ Tcell and B cell responses. Thus, ERAAP is a'quintessential editor' of the peptide-MHCrepertoire and, paradoxically, its absenceenhances immunogenicity.

No CD8Low IFN-gammaAutoimmunity

191


192

Source of cytosolic antigens

193

Source of cytosolic antigens

194

Proteasoma: genes and DRIPs

A relatively large percentage of nascent proteins never reacha functional state owing to errors in translation or folding.These defective ribosomal products (DRiPs) are rapidlyubiquitylated during translation and are degraded byproteasomes. DRiPs could therefore represent an importantsource of MHC class I peptides.

195

Il sistema maggiore di istocompatibilità: struttura e ... · I prodotti dei geni MHC-I sono...

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