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Corso di Immunologia

A.A. 2011-12

Antigeni

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• La differenza tra: immunogeno, antigene, aptene• I fattori che influenzano l’immunogenicità• La natura chimica degli immunogeni• La differenza tra le strutture di antigeni T-indipendenti e T-

dipendenti• Il concetto di coniugati aptene-carrier• La caratterizzazione dei determinanti antigenici• Il concetto di superantigeniKEYWORDS:• Immunogen, Antigen, Hapten, Epitope, Antigenic determinant,

Antibody, T-independent antigen, T-dependent antigen, Hapten-carrier conjugate, Native determinant, Haptenicdeterminant, Superantigen

Cosa dobbiamo conoscere al termine della lezione

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Definitions

• Immunogen - A substance that induces a specific immune response.• Antigen (Ag) - A substance that reacts with the products of a specific

immune response.

• Hapten - A substance that is non-immunogenic but which can reactwith the products of a specific immune response. Haptens are smallmolecules which could never induce an immune response whenadministered by themselves but which can when coupled to a carriermolecule. Free haptens, however, can react with products of the immune response after such products have been elicited. Haptens have the property of antigenicity but not immunogenicity.

• Epitope or Antigenic Determinant - That portion of an antigen thatcombines with the products of a specific immune response.

• Antibody (Ab) - A specific protein which is produced in response to animmunogen and which reacts with an antigen.

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Antigeni (1)

Il riconoscimento antigenico da parte di linfociti T e B e` un aspetto fondamentale

nell'induzione della RI. Nel riconoscimento bisogna considerare almeno 3

aspetti: 1) cosa viene riconosciuto, e 2) quale linfocita e 3) quale recettore

riconosce l'antigene.

Il nome "Antigene" deriva dal greco e significa: "qualcosa che genera una sostanza

contro….".

Possiamo definire come antigene (Ag) qualsiasi molecola che reagisce con

gli elementi del sistema immunitario, comprendendo sia sostanze esogene che

endogene (nel caso di patologie autoimmuni).

Secondo una definizione molto generale, un Ag:

· È in grado di indurre una risposta immunitaria (ovvero di provocare la

produzione di anticorpi o l'instaurarsi di una risposta cellulo-mediata)

· È in grado di reagire col sistema immunitario (S.I.)

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Antigeni (2)

Però, per essere più precisi, qualunque sostanza in grado di suscitare una risposta

immune si definisce IMMUNOGENICA, e viene detta IMMUNOGENO. Bisogna

quindi fare una netta distinzione operativa tra ANTIGENE e IMMUNOGENO:

l'antigene è quella sostanza in grado di legarsi ad uno specifico anticorpo

(oppure a un linfocita T): tutti gli antigeni sono potenzialmente in grado di

stimolare la produzione di anticorpi specifici, ma solo alcuni sono in grado di

farlo realmente , perché la maggior parte si comportano da APTENI, ovvero ci

riescono solo se legati ad una molecola (CARRIER) che li fa diventare

immunogeni .

Quindi, una molecola può essere antigenica (cioè può reagire con i

prodotti o componenti del S.I.) ma non essere immunogenica (cioè non

essere in grado DA SOLA di indurre una risposta immunitaria).

Quindi: "TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI ANTIGENI

SONO IMMUNOGENI".

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Antigeni (3)

EPITOPO o DETERMINANTE ANTIGENICO: parte di un antigene che entra in

contatto con il sito di legame di un Ac o col recettore per l’Ag delle cellule T. (Gli

epitopi sono praticamente le porzioni più importanti dell’antigene, capaci di

evocare la risposta immunitaria).

APTENE: molecola a basso peso molecolare (< 4 kD) in grado di agire come epitopo

ma che di per sé non è in grado di evocare una risposta anticorpale.

L’aptene è quindi una molecola antigenica ma non immunogena, a meno che non

sia legata ad un CARRIER; induce una risposta immunitaria solo nel caso in cui

il S.I. sia venuto precedentemente a contatto col complesso aptene–carrier.

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Antigeni (4)

Un antigene possiede normalmente piu` di un epitopo, quindi la risposta che

indurra` sara` policlonale, cioe` verranno attivati piu` cloni linfocitari. Vi

sono tuttavia alcune molecole antigeniche che posseggono uno o pochi

epitopi immunodominanti, e sono in grado quindi di indurre una risposta

monoclonale (se un solo clone viene attivato) od oligoclonale (quando

vengono attivati pochi cloni). All'interno di una molecola antigenica puo`

vigere una gerarchia nell'immunodominanza degli epitopi, con

conseguente attivazione preferenziale di alcuni cloni confronto ad altri.

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Antigeni (7)

Attraverso prove di sostituzione aminoacidica e cross-reattività Landsteiner ha

stabilito l’importanza di alcune caratteristiche:

· POSIZIONE degli aminoacidi con cui reagisce l’Ac

· GRANDEZZA

· CARICA

· STEREOISOMERIA (stereoisomeri diversi danno risposte diverse )

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Caratteristiche antigeni (1)

CARATTERISTICHE CHE DEVE AVERE UNA PROTEINA AFFINCHE’ FUNZIONI

DA ANTIGENE:

· Peso molecolare (superiore a 5.000Da). Infatti, più una proteina è grande e complessa, più verrà spezzettata e frammentata (come vedremo, le molecole MHC hanno preferenza a legare e presentare frammenti peptidici, e non proteine intere).

· Complessità chimica

· Solubilità (necessaria per il trasporto)

· Estraneità (infatti l’Ag deve differenziarsi il più possibile dalla forma delle proteine self, altrimenti si ha l’instaurarsi di patologie autoimmuni)

· Dose di somministrazione: sotto certe dosi, molte proteine non sono in grado di provocare una risposta immune. A dosi molto alte, d’altra parte, la risposta immunitaria è inibita. In alcuni casi, dosi troppo alte o troppo basse possono indurre stati irresponsivi noti come "Tolleranza acquisita da bassa o alta dose". Le Risposte Secondarie in genere necessitano di una dose più bassa di Ag, come conseguenza dell’instaurarsi della Memoria Immunologica.

· Via di somministrazione: di solito la Via Sottocutanea è la più potente.

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Caratteristiche epitopi (1)

1. I determinanti antigenici devono essere accessibil i agli anticorpi (Ac)

Nel 1960 SELA & ARNON studiarono l’immunogenicità di diverse catene

laterali aminoacidiche legate ad uno scheletro polilisinico (il S.I. non

reagisce contro polimeri di molecole identiche ripetute): se il

determinante antigenico delle catene (dato da residui di ac. Glutammico

o tirosina legati a polialanina ) risulta inaccessibile agli Ac non si ha

risposta immunitaria, risposta che compare invece in seguito allo

smascheramento degli epitopi (aumentando ad esempio la distanza fra

catene)

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Caratteristiche epitopi (2)

2. I determinanti antigenici possono essere continui o discontinui

Negli anni ’60 A. Tassi fece degli studi su mioglobina di balena e trovò che in

questa molecola di 153 a.a. erano presenti 5 regioni in grado di provocare

una risposta anche dopo la frammentazione della molecola e che tali

regioni risultavano essere su zone esposte e flessibili. Questi tipi di

determinanti antigenici sono detti continui (o lineari) poiché dati da a.a.

disposti in modo lineare, cioè uno dopo l’altro nella sequenza primaria

della proteina. Esistono però altri tipi di determinanti, la cui esistenza è

stata dimostrata successivamente utillizzando molecole di lisozima, detti

discontinui (o conformazionali) formati da a.a che erano discontinui nella

sequenza primaria, ma che diventano contigui nella struttura terziaria,

perché sono portati ad unirsi grazie al ripiegamento tridimensionale della

proteina. (ad es. 2 regioni legate da ponti disolfuro). Alla luce di ciò

possiamo probabilmente attribuire il successo degli esperimenti di Tassi

alla relativa semplicità strutturale della globina.

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Caratteristiche epitopi (3)

Gli epitopi lineari, in particolare, sono riconosciuti sia dai linfociti T che dai

linfociti B mentre quelli conformazionali solo dai linfociti B.

ATTENZIONE: gli epitopi lineari sono anche conformazionali, ma non è

vero il contrario; infatti l’immunogenicità di una porzione proteica

dipende da come essa è presentata (potenzialmente qualsiasi porzione

di una molecola può essere immunogena se presentata correttamente).

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Caratteristiche epitopi (4)3. I Determinanti Antigeni possiedono alcuni residui più importanti

di altri ( EPITOPI IMMUNO-DOMINANTI).

Durante l’ ipermutazione somatica gli Ac ad affinità maggiore sono quelli diretti contro epitopi dominanti (epitopi immunodominanti) mentre quelli meno affini contro epitopi più nascosti.

Nel corso di una risposta immunitaria si ha quindi una sorta di "Selezione Darwiniana" tra gli epitopi più importanti, verso i quali vengono prodotti Ac più "forti".

Da qui deduciamo che gli Ag hanno porzioni più o meno importanti e che gli epitopi immuno dominanti si trovano su porzioni idrofiliche degli Ag(perché piu’ facilmente raggiungibili dagli Ac) piuttosto che idrofobiche. Essendo questi epitopi quelli contro cui, con maggiore probabilità, reagiranno gli Ac, anche in individui diversi, sono solitamente utilizzati per la preparazione di vaccini.

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Caratteristiche epitopi (5)

4. Mobilità del sito antigenico:

L’antigene è dotato di una certa mobilità strutturale in modo da permettere

all’anticorpo di "incastrarsi" bene (ricordando un po’ un meccanismo

chiave-serratura, in cui però la chiave è fatta di gomma!).

Le forze in gioco nel legame Ag-Ac (non covalente):

• Ponti idrogeno

• Interazioni elettrostatiche

• Forze di Van der Waals

• Interazioni idrofobiche

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Factors Influencing ImmunogenicityContribution of the Immunogen

• Foreigness- The immune system normally discriminates between self

and non-self such that only foreign molecules are immunogenic.

• Size - There is not absolute size above which a substance will beimmunogenic. However, in general, the larger the molecule the more immunogenic it is likely to be.

Conformational determinants

Sequence determinants

• Chemical Composition– Primary Structure

– Secondary Structure

– Tertiary Structure

– Quarternary StructureIn general, the more complex the substance is chemically the more

immunogenic it will be . The antigenic determinants are created by the primary sequence of residues in the polymer and/or by the secondary, terti ary or quaternary structure of the

molecule.

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Factors Influencing ImmunogenicityContribution of the Immunogen

• Foreigness

• Size

• Chemical Composition

• Physical Form– Particulate > Soluble

– Denatured > Native

In general particulate antigens are more immunogenic than solubleones and denatured antigens more immunogenic than the native form.

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Factors Influencing ImmunogenicityContribution of the Immunogen

• Foreigness

• Size

• Chemical Composition

• Physical Form

• Degradability– Ag processing by Ag Presenting Cells (APC)

Antigens that are easily phagocytosed are generally more immunogenic. Thisis because for most antigens (T-dependent antigens, see below) the development of an immune response requires that the antigen bephagocytosed, processed and presented to helper T cells by an antigenpresenting cell (APC).

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Factors Influencing ImmunogenicityContribution of the Biological System

• Genetics– Species

– Individual• Responders vs Non-responders

Some substances are immunogenic in one species but not in another. Similarly, some substances are immunogenic in one individual but notin others (i.e. responders and non-responders). The species or individuals may lack or have altered genes that code for the receptorsfor antigen on B cells and T cells or they may not have the appropriate genes needed for the APC to present antigen to the helper T cells.

• Age - This can also influence immunogenicity. Usually the veryyoung and the very old have adiminished ability to mount and immune response in response to an immunogen.

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Factors Influencing ImmunogenicityMethod of Administration

• Dose - The dose of administration of an immunogen can influence itsimmunogenicity. There is a dose of antigen above or below which the immune response will not be optimal.

• Route– Subcutaneous > Intravenous > Intragastric

Generally the subcutaneous route is better than the intravenous or intragastricroutes. The route of antigen administration can also alter the nature of the response

• Adjuvant– Substances that enhance an immune response to an Ag

Substances that can enhance the immune response to an immunogen are calledadjuvants . The use of adjuvants, however, is often hampered by undesirableside effects such as fever and inflammation.

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Chemical Nature of Immunogens

• Proteins- The vast majority of immunogens are proteins. Thesemay be pure proteins or they may be glycoproteins or lipoproteins. In general, proteins are usually very good immunogens.

• Polysaccharides - Pure polysaccharides and lipopolysaccharides are good immunogens.

• Nucleic Acids - Nucleic acids are usually poorlyimmunogenic. However they may become immunogenic when single stranded or when complexed with proteins.

• Lipids - In general lipids are non-immunogenic, although they maybe haptens.

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Types of AntigensT-independent

• T-independent Antigens - T-independent antigens are

antigens which can directly stimulate the B cells to produce

antibody without the requirement for T cell help In general,

polysaccharides are T-independent antigens. The responses to

these antigens differ from the responses to other antigens.

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Properties of T-indipendent antigens

• Polymeric structure - These antigens are characterized by the

same antigenic determinant repeated many times.

• Polyclonal activation of B cells - Many of these antigens can

activate B cell clones specific for other antigens (polyclonal

activation ). T-independent antigens can be subdivided into

Type 1 and Type 2 based on their ability to polyclonally activate

B cells. Type 1 T-independent antigens are polyclonal activators

while Type 2 are not.

• Resistance to degradation - T-independent antigens are

generally more resistant to degradation and thus they persist for

longer periods of time and continue to stimulate the immune

system.

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Types of AntigensT-independent

• Polysaccharides• Properties

– Polymeric structure

– Polyclonal B cell activation

• Yes -Type 1 (TI-1)• No - Type 2 (TI-2)

– Resistance to degradation

• Examples– Pneumococcal polysaccharide, lipopolysaccharide

– Flagella

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Types of AntigensT-dependent

• T-dependent Antigens - T-dependent antigens are those that

do not directly stimulate the production of antibody without the

help of T cells. Proteins are T-dependent antigens. Structurally

these antigens are characterized by a few copies of many

different antigenic determinants

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Types of AntigensT-dependent

• Proteins• Structure

• Examples– Microbial

proteins

– Non-self or Altered-self proteins

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Hapten-carrier conjugates• Definition - Hapten-carrier conjugates are immunogenic molecules

to which haptens have been covalently attached. The immunogenicmolecule is called the carrier.

Native determinants

Haptenic determinants• Structure– native determinants

– haptenicdeterminants

The actual determinant created by the hapten consists of the hapten and a few of the adjacent residues, although the antibody produced to the determinant willalso react with free hapten. In such conjugates the type of carrier determineswhether the response will be T-independent or T-dependent.

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Riconoscimento dell’antigene (1)I linfociti T e B hanno il recettore per l'antigene strutturalmente correlato e

codificato da una famiglia di geni simili (supergene family ). Nonostante

questo, il loro meccanismo di riconoscimento antigenico varia

considerevolmente. Una prima differenza e` data dal fatto che il linfocita T

riconosce il determinante antigenico associato a molecole codificate dal

MHC sulla superficie di cellule accessorie, mentre il linfocita B riconosce

il solo determinante antigenico e non richiede strettamente la presenza di

una cellula accessoria. Inoltre, e` stato osservato che i linfociti T, a

differenza dei B, per riconoscere l'antigene su di una cellula accessoria

richiedono che l'antigene sia processato o degradato o, come piu`

recentemente dimostrato, sia almeno modificata la sua conformazione.

Una differenza che ne consegue e` che il linfocita T, a differenza del B,

non discrimina tra conformazioni native e denaturate dell'antigene.

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Riconoscimento dell’antigene (2)

I linfociti T, e piu` precisamente il loro recettore, riconoscono una sequenza

lineare di aminoacidi (circa 5-12 a.a. della struttura primaria di una

proteina) presenti in una struttura secondaria (alpha elica). Al contrario, i

linfociti B, o piu` propriamente il loro recettore immunoglobilinico, legano

sia sequenze di amminoacidi primarie o secondarie (sequenziali) che

sequenze terziarie (conformazionali).

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Riconoscimento dell’antigene (3)

Ulteriori analisi utilizzando peptidi sintetici hanno dimostrato che i linfociti T

riescono a discriminare differenze al livello anche di un solo

amminoacido. Per esempio, linfociti T regolatori specifici per il lisozima di

pollo riconoscono una modificazione di un singolo amminoacido in

posizione 3 della molecola. Inoltre, e` stato osservato che una sequenza

di 24 aminoacidi della parte carbossiterminale dell'emoagglutinina del

virus influenzale puo` attivare o indurre tolleranza a livello di cloni T

specifici (a seconda delle dosi): tuttavia, se un loop viene inserito nel

peptide, nascondendo cosi` alcuni aminoacidi, non e` piu` possibile

"tollerizzare" i cloni T in assenza di cellule accessorie: l`aggiunta di

cellule accessorie con conseguente processazione e distruzione del loop,

ripristina la possibilita` di indurre tolleranza.

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Riconoscimento dell’antigene (4)

Questa grande specificita` dei linfociti T di discriminare pochi aminoacidi

viene ulteriormente aumentata dall'associazione con le molecole MHC:

per esempio e` stato osservato che la sostituzione di un singolo

amminoacido sulla catena alpha di DR (una molecola di classe II umana)

altera il riconoscimento associativo. Cio` dimostra la fine specificita`

discriminativa del recettore del linfocita T e da` un'idea della variabilita`

del suo repertorio recettoriale.

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Antigenic DeterminantsRecognized by B cells and Ab

• Composition - Antigenic determinants recognized by B cellsand the antibodies secreted by B cells are created by the primarysequence of residues in the polymer (linear or sequence determinants) and/or by the secondary, tertiary or quaternary structure of the molecule(conformational determinants).

– Proteins, polysaccharides, nucleic acids

– Sequence (linear) determinants

– Conformational determinants

• Size - In general antigenic determinants are small and are limited toapproximately 4-8 residues. (amino acids and or sugars). The combining site of an antibody will accommodate an antigenicdeterminant of approximately 4-8 residues.

– 4-8 residues

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Antigenic DeterminantsRecognized by B cells and Ab

• Composition

• Size

• Number– Limited

– Located on the external surfaces of the Ag

Fe

Although, in theory, each 4-8 residues can constitute a separate antigenic determinant, in practice, the number of antigenic determinants per antigen is much lower than whatwould theoretically be possible. Usually the antigenic determinants are limited to thoseportions of the antigen that are accessible to antibodies as illustrated in the Figure (antigenic determinants are indicated in blu).

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Antigenic DeterminantsRecognized by T cells

• Composition -Antigenic determinants recognized by T cells are createdby the primary sequence of amino acids in proteins. T cells do not recognizepolysaccharide or nucleic acid antigens. This is why polysaccharides are generally T-independent antigens and proteins are generally T-dependentantigens. The determinants need not be located on the exposed surface of the antigen since recognition of the determinant by T cells requires that the antigenbe proteolytically degraded into smaller peptides. Free peptides are notrecognized by T cells, rather the peptides associate with molecules coded for bythe major histocompatibility complex (MHC) and it is the complex of MHC molecules + peptide that is recognized by T cells.

– Proteins

– Sequence determinants• Processed

• MHC presentation

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Antigenic DeterminantsRecognized by T cells

• Size -In general antigenic determinants are small and are limited toapproximately 8-15 amino acids.

– 8 -15 residues

• Number -Although, in theory, each 8-15 residues can constitutea separate antigenic determinant, in practice, the number of antigenicdeterminants per antigen is much less than what would theoretically bepossible. The antigenic determinants are limited to those portions of the antigen that can bind to MHC molecules. This is why there can bydifferences in the responses of different individuals.

– Limited to those that can bind to MHC

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Superantigeni

Alcuni antigeni microbici (tossine batteriche, proteine retrovirali) hanno la

caratteristica di attivare molti cloni mediante una medesima sequenza

amminoacidica. Tale sequenza non si lega a molecole MHC ed al

recettore T nel sito classico di legame (assenza di restrizione genetica

nella RI), ma si lega al TCR nella zona ipervariabile comune a diversi

TCR. In tal caso si parla di superantigeni.

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Superantigens

• Definition - When the immune system encounters a conventional T-

dependent antigen, only a small fraction (1 in 10 -105) of the T cell population is

able to recognize the antigen and become activated (monoclonal/oligoclonal

response). However, there are some antigens which polyclonally activate a large

fraction of the T cells (up to 25%). These antigens are called superantigens.

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Superantigens

Conventional Antigen

Monoclonal/OligoclonalT cell response

1:104 - 1:105

Superantigen

Polyclonal T cell response

1:4 - 1:10

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Superantigens

• Definition

• Examples– Staphylococcal enterotoxins - (food poisoning)

– Staphylococcal toxic shock toxin - (toxic shock syndrome)

– Staphylococcal exfoliating toxin - (scalded skinsyndrome)

– Streptococcal pyrogenic exotoxins - (shock)Although the bacterial superantigens are the best studied there are superantigens

associated with viruses and other microorganisms as well. The diseasesassociated with exposure to superantigens are, in part, due to hyper activation of the immune system and subsequent release of biologically active cytokines byactivated T cells.