IL MODELLO DELL’OPERON

La regolazione genica nei procarioti

�  I microrganismi presentano sorprendenti capacità di adattamento a diverse condizioni ambientali

�  Questa capacità di adattarsi, e quindi di crescere, risiede nella capacità di esprimere velocemente i geni necessari a far fronte a specifici stimoli ambientali �  VANTAGGIO: risparmio energetico, quindi una

crescita più veloce e migliore utilizzo delle risorse disponibili

GENI

COSTITUTIVI sono sempre espressi nella cellula, geni essenziali per la cellula (ad esempio rRNA, tRNA, proteine ribosomali, RNA polimerasi, ecc)

REGOLATI la loro attività è controllata in risposta alla necessità

Per regolare l’espressione genica

1.  Devono riconoscere le condizioni ambientali nelle quali attivare o reprimere l’espressione di specifici geni

2.  Devono essere in grado di attivare o reprimere l’espressione cordinata di specifici geni o gruppi di geni

DNA mRNA proteina

trascrizione traduzione

A che livello può agire la regolazione nei procarioti?

controllo della trascrizione

controllo della stabilità dei

trascritti

controllo della traduzione

controllo della stabilità della

proteina

controllo dell’attività

proteica

Controllo delle proteine per l’utilizzo di zuccheri

�  I batteri possono utilizzare diversi zuccheri come fonte di carbonio e di energia

�  (glucosio, lattosio, arabinosio, xylosio, ecc.)

�  Le proteine necessarie per il metabolismo dello zucchero comprendono �  quelle che favoriscono l’ingresso dello zucchero

nella cellula

�  quelle che catalizzano i passaggi di degradazione dello zucchero

Regolazione del catabolismo del lattosio in E. coli

�  Il metabolismo del lattosio è stato studiato in dettaglio negli anni 1950 da François Jacob e Jacques Monod

�  La loro descrizione del sistema di controllo della trascrizione è stata una scoperta di enorme valore scientifico che è valso loro il premio Nobel nel 1965

�  E. coli può crescere in un terreno minimo contenente glucosio �  I geni del metabolismo del glucosio sono costitutivi,

la glicolisi è un processo fondamentale

�  Se al terreno minimo viene aggiunto lattosio, al posto del glucosio, E. coli sintetizza gli enzimi utili per metabolizzare questo zucchero

Enzimi indotti dal lattosio

�  β-galattosidasi (gene lacZ) �  che scinde il lattosio in galattosio e glucosio

�  catalizza l’isomerizzazione del lattosio in allolattosio

�  Lattosio permeasi (gene lacY) �  per promuovere il passaggio del lattosio all’interno

della cellula

�  la β-galattoside transacetilasi (gene lacA) �  trasferisce un gruppo acetilico ai β-galattosidi, ma la

sua funzione è ancora poco chiara

QUESTI GENI SONO DETTI GENI STRUTTURALI

Jocob e Monod studiarono le mutazioni che alterano il metabolismo del lattosio

�  Mutazioni nei 3 geni strutturali (lacZ, lacY e lacA) �  le mutazioni nei geni lacZ−, lacY−, lacA− furono

mappate con tecniche classiche �  I tre geni sono strettamente concatenati e l’ordine

lacZ−lacY−lacA �  I tre geni sono trascritti in un unico mRNA detto

policistronico o poligenico

�  Mutazioni che influenzavano la regolazione di tutti e 3 i geni strutturali �  Mutanti costitutivi

�  i geni strutturali sono sempre espressi, sia in presenza che in assenza di lattosio

�  Mutanti che bloccano l’espressione dei geni strutturali anche quando è presente il lattosio

Mappatura dei mutanti costitutivi

Sono state identificate due classi:

1a classe: mappava in una regione piccola a monte del gene lacZ che chiamarono operatore (lacO)

2a classe: mappava a monte dell’operatore in

un gene che chiamarono lacI, che codifica per il repressore

Struttura della regione genomica

Essi coniarono il termine di OPERONE per indicare un cluster di geni che svolgono funzioni correlate e che sono regolati in

modo coordinato

Come potrebbe essere regolata la trascrizione di geni inducibili?

REGOLAZIONE Vie CATBOLICHE o di degradazione (lac)

INDUCIBILI

Vie ANABOLICHE o di biosintesi (trp)

REPRIMIBILI

GENE REGOLATORE

ATTIVATORI REPRESSORI

legano una regione regolativa in base alla presenza di MOLECOLE EFFETTRICI

INDUTTORI CO-REPRESSORI

Influenzano la struttura tridimensionale dei regolatori

SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE POSITIVA

INDUTTORE ASSENTE INDUTTORE PRESENTE

INDUTTORE

SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE POSITIVA

SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE NEGATIVA

operatore

INDUTTORE

SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE NEGATIVA

Per meglio definire il ruolo di ciascun componente dell’operone

Jacob e Monod si servirono di ceppi parzialmente diploidi

Utilizzarono ceppi F’ che portavano alcuni geni dell’operone sul fattore di fertilità F

�  Poterono definire quali mutazioni sono dominanti e quali recessive

�  Formulare ipotesi circa il ruolo svolto da ciascuna regione dell’operone

Diploide parziale per mutazioni lacOc

lacI+ P O+ Z− Y+

CELLULA BATTERICA

CROMOSOMA BATTERICO PLASMIDE F’

lacI+ P O+ Z- Y+

F’ lacI+ P Oc Z+ Y− GENOTIPO:

SENZA INDUTTORE CON INDUTTORE

β-galattosidasi + +

permeasi −

(sintesi della forma mutata)

+

�  Il gene Lac Z è espresso in modo costitutivo

�  Il gene Lac Y è soggetto a controllo inducibile

SI PUO’ DEDURRE CHE UNA MUTAZIONE lacOc ALTERA SOLO I GENI A VALLE SULLA STESSA MOLECOLA DI DNA

QUESTO TIPO DI MUTAZIONI SONO DETTE CIS-DOMINANTI

L’operatore NON CODIFICA PER UN PRODOTTO DIFFUSIBILE altrimenti uno dei due alleli controllerebbe tutti i geni per

l’utilizzo del lattosio

lacI+ P O+ Z− Y+ F’ lacI+ P Oc Z+ Y−

Diploide parziale per mutazioni lacI−

lacI+ P O+ Z− Y+

CELLULA BATTERICA

CROMOSOMA BATTERICO PLASMIDE F’

lacI+ P O+ Z− Y+

F’ lacI− P O+ Z+ Y− GENOTIPO:

lacI+ P O+ Z− Y+

F’ lacI− P O+ Z+ Y− SENZA INDUTTORE

β-galattosidasi −

permeasi −

�  L’espressione di entrambi i geni è inducibile

�  lacI+ nella cellula è dominante su lacI−

DATO CHE I GENI lacI SI TROVANO SU MOLECOLE DIVERSE DI DNA (configurazione in trans)

LA MUTAZIONE lacI+ E’ DETTA TRANS-DOMINANTE SU lacI−

Jacob e Monod ipotizzarono quindi che il gene lacI codificasse

per un REPRESSORE DIFFUSIBILE nella cellula

IL MODELLO DI REGOLAZIONE NEGATIVO PROPOSTO DA JACOB E MONOD

IN ASSENZA DI LATTOSIO

IN PRESENZA DI LATTOSIO

Il modello spiega i mutanti trovati? I MUTANTI lacOc IN ASSENZA DI LATTOSIO

I MUTANTI COSTITUTIVI lacI-

Il modello proposto per i diploidi parziali lacI+ P O+ Z- Y+ A+

F’ lacI+ P Oc Z+ Y- A+

IN ASSENZA DI LATTOSIO

GENOTIPO

SENZA INDUTTORE

β-galattosidasi +

permeasi − (sintesi della

forma mutata)

lacI+ P O+ Z- Y+ A+

F’ lacI+ P Oc Z+ Y- A+ GENOTIPO IN PRESENZA DI LATTOSIO

CON INDUTTORE

β-galattosidasi +

permeasi +

lacI+ P O+ Z− Y+ A+

F’ lacI− P O+ Z+ Y− A+ IN ASSENZA DI LATTOSIO GENOTIPO

Il secondo diploide parziale analizzato

SENZA INDUTTORE

β-galattosidasi −

permeasi −

lacI+ P O+ Z− Y+ A+

F’ lacI− P O+ Z+ Y− A+

IN PRESENZA DI LATTOSIO

GENOTIPO

CON INDUTTORE

β-galattosidasi +

permeasi +

I mutanti di regolazione identificati GENE MUTAZIONE FENOTIPO

lacI lacI- sintesi costitutiva dei 3 enzimi

lacO lacOc sintesi costitutiva dei 3 enzimi

lacI lacIs nessuna sintesi anche in presenza di lattosio

lacP lacP- nessuna sintesi anche in presenza di lattosio

La mutazione lacIs (superrepressore)

Nei diploidi parziali (lacI+/lacIs) lacIs è TRANS-DOMINANTE bloccando la sintesi dei geni strutturali su entrambe le copie dell’operone

L’operone lattosio ha anche un sistema di regolazione positiva

�  Questo sistema di regolazione assicura che i geni dell’operone lattosio siano espressi ad alti livelli solo se i lattosio è l’unica fonte di carbonio e se non è presente anche il glucosio

�  Il glucosio è preferito perché può essere direttamente utilizzabile nella glicolisi per produrre energia

�  Gli altri zuccheri devono essere convertiti in glucosio prima di poter essere utilizzati �  queste conversioni richiedono energia

Il modello di regolazione positiva dell’operone lattosio di E.coli

CAP (Catabolite Activator Protein)

cAMP (AMPciclico)

La proteina regolatrice CAP “sente” la presenza di glucosio nella cellula legandosi al cAMP la cui concentrazione è inversamente correlata alla quantità di glucosio nella cellula

RNA polimerasi

Il legame del complesso CAP-cAMP al DNA favorisce il legame della RNA polimerasi al promotore

Il legame del cAMP alla proteina CAP aumenta l’affinità di questo complesso con un sito adiacente a lacP

CAP e cAMP mantengono gli operoni dell’arabinosio e del galattosio

Gli operoni sono molto comuni nei procarioti

Permettono di:

�  regolare contemporaneamente più geni coinvolti nello stesso metabolismo

�  mantenere i rapporti dei trascritti bilanciati

�  rispondere velocemente alle variazioni ambientali

Altri esempi di operoni:

�  triptofano

�  arabinosio

Operone reprimibile negativo

O P trpR trpD trpE trpC trpB trpB

L’operone triptofano

L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpR

Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione

repressore inattivo triptofano

repressore attivo

P262

Acido Corismico->Triptofano

L’attenuazione della trascrizione

O P trpR trpD trpE trpC trpB trpB

L’operone triptofano

peptide leader (14AA) attenuatore

1 2 3 4

codoni trp

leader

162 nt

mRNA

Se deleta la sequenza leader determina incremento di espressione dell’operone trp Senza effetti sulla reprimibilita’ dell’operone.

L’attenuazione della trascrizione

O P trpR trpD trpE trpC trpB trpB

L’operone triptofano

peptide leader (14AA) Attenuatore Seq. palindroma ricca in G:C seguita da coppie A:T

1 2 3 4

codoni trp

leader

162 nt

mRNA

Secondo livello di regolazione -> attenuazione In presenza di tRNA trp carico di triptofano causa la terminazione prematura della trascrizione dell’operone-> trascritto tronco (140nt)

1 2 3 4

1 2 3 4

UUUUUUU

1

2 3

4

Attenuatore (terminatore della

trascrizione)

mRNA

MA…..Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, quest’ultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore TRASCRIZIONE ATTIVA

Trascrizione di questa sequenza e dei segnali di terminazione della seq attenuatore

RNA nascente che puo’ formare una struttura a forcina seguita da alcuni uracili

Avviene un cambiamento conformazionale nell’RNApolimerasi associata causando la terminazione della trascrizione

E la presenza del trp come influenza l’attenuazione?

Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi NB:Nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente

1 2 3 4 mRNA

peptide leader

AUG UGA

Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli l’appaiamento con il segmento 3

3 4

1 2 AUG UGA

PRESENZA TRIPTOFANO -> Forcina di Terminazione ->OPERONE TRP NON TRASCRITTO

Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi

1 2 3 4 mRNA

peptide leader

AUG UGA

Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento 3

2 3

4 1 AUG UGA

2 3

La polimerasi continua

2

3 4

La polimerasi termina la trascrizione

2

3 4

PRESENZA TRIPTOFANO -> ATTENUAZIONE ->OPERONE trp ATTENUATO

FORCINA DI TERMINAZIONE

ASSENZA TRIPTOFANO -> LOOP ->OPERONE trp NON ATTENUATO

Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica.

Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dell’attenuatore.

La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operano insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte.

Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi