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E. Giordano 16/09/2010

Bressanone GNB 2010 1

COSTITUENTI MOLECOLARI DELLO CHASSIS CELLULARE

Emanuele GIORDANO

II Facoltà di IngegneriaDipartimento di Biochimica “G. Moruzzi” Laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare Università di Bologna – Campus di Cesena

GRUPPO NAZIONALE DI BIOINGEGNERIA

XXIX Scuola AnnualeBIOLOGIA SINTETICABressanone 13 - 17 settembre 2010

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Espressione genica nei batteri e negli eucarioti

Batterio Eucariote

Nei batteri, l’mRNA sintetizzato dallaRNA polimerasi non deve subire unamaturazione prima di essere tradottodai ribosomi. Inoltre, dato che non c’èuna membrana nucleare, la traduzionedell’mRNA può avere inizio mentre latrascrizione è ancora in corso,determinando l’accoppiamento dellatrascrizione e della traduzione.

Negli eucarioti, il trascritto primario di RNAè una molecola di mRNA precursore (pre-mRNA), che viene processato nel nucleoattraverso (*) l’aggiunta di un cappuccioall’estremità 5’ e di una coda di poli(A)all’estremità 3’, e la rimozione degli introni.La traduzione può avvenire solo quandol’mRNA maturo sia stato trasportato nelcitoplasma.

DNA

Nucleo

RNA precursore

Maturazione*

mRNA

polipeptide

citoplasmaribosoma

RNA polimerasi

RNA polimerasi

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Il flusso dell’informazione contenuta nel DNA

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La trascrizione è il processo di copia in forma di RNA di

una specifica sequenza di

interesse (gene) in un filamento del duplex di DNA.

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In breve, le caratteristiche della

molecola di RNA sono:

•singolo filamento;

•ribosio (non desossiribosio);

•uracile (non timina).

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Esistono quattro tipi principali di molecole di RNA, ciascuna codificata da ungene specifico, ma solo uno di essi viene tradotto:

mRNA (RNA messaggero) , che codifica per la sequenza di amminoacidi diun polipeptide. Gli mRNA sono i trascritti dei geni che codificano perproteine. La traduzione di un mRNA produce un polipeptide.

rRNA (RNA ribosomiale) che, insieme alle proteine ribosomiali, costituisce iribosomi – le strutture nelle quali viene tradotto l’mRNA.

tRNA (RNA di transferimento) , che porta gli amminoacidi al ribosomadurante la traduzione.

snRNA ( small nuclear RNA; piccolo RNA nucleare) che, insieme aproteine, forma complessi che vengono usati nella maturazione degli RNAeucariotici per produrre mRNA funzionali.

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• Diversamente dal DNA, l’mRNA è una molecola instabile, destinata aun utilizzo temporaneo.

• Le dinamiche della sua sintesi/degradazione determinano lapresenza/assenza nella cellula del prodotto attivo di ogni specificogene.

• Il numero di copie di mRNA trascritte (e l’efficienza della lorosuccessiva traduzione) determina l’abbondanza di tale prodotto.

• La regolazione della trascrizione del DNA è una fase dell’espressionegenica.

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L’espressione genica

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Promotore, sequenza che codifica per l’RNA e regione del terminatore di ungene. Il promotore si trova a monte della sequenza codificante, il terminatore avalle. La sequenza codificante inizia con il nucleotide +1.

Gene

Promotore Sequenza codificante per l’RNA Terminatore

Sito di inizio della trascrizione

Sito di terminazione della trascrizione

DNAFilamento non-stampo

Filamento stampo

A monte del gene

A valle del gene

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Il processo di trascrizione.

La doppia elica del DNA viene denaturata dall’RNA polimerasi nei procarioti, (e da altre proteine negli eucarioti).

L’RNA polimerasi catalizza quindi la sintesi di una catena di RNA a singolo filamento, a partire dal punto di “inizio della trascrizione”.

La catena di RNA viene sintetizzata in direzione 5’-3’, utilizzando solo un filamento del DNA come stampo che ne stabilisce la sequenza di basi.


RNA polimerasi

Promotore Ibrido DNA-RNA

Direzione della trascrizione

Filamento non-stampo

Filamento

stampo

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Nei batteri è presente solo un tipo di RNA polimerasi (DNA-dipendente), quindi tutte le classi di geni (geni che codificano perproteine, geni per i tRNA, e geni per gli rRNA) vengono trascritte daquesto enzima. L’inizio della trascrizione di un gene richiede unaforma di RNA polimerasi chiamata oloenzima (o enzima completo).L’oloenzima è formato dal nucleo enzimatico dell’RNA polimerasi,costituito da due polipeptidi a, un polipeptide b e uno b’, legato a unaltro polipeptide chiamato fattore sigma (σ). Il fattore sigma assicurache l’RNA polimerasi si leghi in maniera stabile solo ai promotori.


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Nella maggior parte dei promotori dei geni di E. coli sono presenti duesequenze di DNA fondamentali per specificare l’inizio dellatrascrizione. Queste sequenze si trovano generalmente in posizione–35 e –10, cioè 35 e 10 coppie di basi a monte rispetto al punto diinizio della trascrizione, indicato con +1. La sequenza di consenso(cioè la sequenza che si trova con frequenza maggiore in ciascunaposizione) per la regione –35 (la box –35) è 5’-TTGACA-3’. Lasequenza consenso per la regione –10 (chiamata anche Pribnow box)è 5’-TATAAT-3’.


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L’RNA polimerasi inizia direttamente la trascrizione [non necessitadella presenza di un innesco (primer)] e polimerizza i nucleotidi indirezione 5’ 3’. Ciò vale qualsiasi sia il filamento stampo nel duplexa DNA: l’RNA polimerasi puo adoperare come stampo l’uno o l’altrodei filamenti.

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La reazione chimica catalizzata dall’RNA polimerasi e coinvolta nella sintesi di RNA utilizzando come stampo il filamento di DNA.

Catena di RNA in allungamento Filamento di DNA stampo

Formazione del legame fosfodiesterico

Ribonucleoside trifosfatoin ingresso

Direzione di allungamento

(5’-3’)della catena

RNA polimerasi

Allungamento della catena

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L’azione dell’RNA polimerasi di E. coli nelle fasi di inizio della trascrizione.

Nella fase di inizio, l’oloenzima dell’RNA polimerasi riconosce dapprima la regione –35 del promotore e quindi lo lega interamente.

Promotore Sequenza codificanteRNA

polimerasiComplesso del

promotore chiuso

Fattore σ

Mentre la fase di inizio procede, l’RNA polimerasi si lega più strettamente al promotore a livello della regione –10; lo srotolamentolocalizzato del DNA in quella regione accompagna l’evento. A questo punto, l’RNA polimerasi è orientata nel modo corretto periniziare la trascrizione in posizione +1.

-35 -10

Nucleotide d’inizio

Complesso del

promotore aperto

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L’azione dell’RNA polimerasi di E. coli nella fase di allungamento della trascrizione.

Dopo la polimerizzazione di otto/nove nucleotidi, il fattore sigma si dissocia dal nucleo enzimatico.

Mentre l’RNA polimerasi allunga la nuova catena di RNA, l’enzimasrotola il DNA a valle, mantenendo una bolla di trascrizione asingolo filamento che comprende circa 25 paia di basi. Circa 9 basidel nuovo RNA sono legate al DNA a singolo filamento nella bolla ditrascrizione, e il rimanente esce dall’enzima sotto forma di filamentosingolo.


Ibrido DNA-RNA

Filamento stampo

Fattore σ rilasciato

Promotore Sequenza codificante

RNA in allungamento

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Promotore, sequenza che codifica per l’RNA e regione del terminatore di ungene. Il promotore si trova a monte della sequenza codificante, il terminatore avalle. La sequenza codificante inizia con il nucleotide +1.

Gene

Promotore Sequenza codificante per l’RNA Terminatore


Sito di terminazione della trascrizione

DNAFilamento non-stampo

Filamento stampo

A monte del gene

A valle del gene

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Sequenza di un terminatore (tipo I)

Simmetria bipartita

Stampo(DNA)

Trascritto(RNA)

Il trascritto si ripiega formando la forcina di

terminazione

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Negli eucarioti, la trascrizione dei geni per i quattro tipi principali di RNA è effettuata da tre RNA polimerasi differenti.

L’RNA polimerasi I , localizzata nel nucleolo, catalizza la sintesi di tre degli RNA che si trovano nei ribosomi: le molecole di rRNA 28S, 18S, e 5,8S. (I valori S indicano il coefficiente di sedimentazione delle molecole di rRNA durante la centrifugazione, e danno un’indicazione molto approssimativa del peso molecolare.)

L’RNA polimerasi II , localizzata nel nucleoplasma, sintetizza gli RNA messaggeri (mRNA) e alcuni piccoli RNA nucleari (snRNA).

L’RNA polimerasi III , che si trova anch’essa nel nucleoplasma, sintetizza: (1) gli RNA di trasferimento (tRNA); (2) l’rRNA 5S, una piccola molecola di rRNA presente in tutti i ribosomi; e (3) gli snRNA non sintetizzati dall’RNA polimerasi II.

Tutte le RNA polimerasi eucariotiche sono costituite da più subunità. Per esempio, l’RNA polimerasi II del lievito è formata da 12 subunità

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Negli eucarioti inoltre, il reclutamento

dell’RNA polimerasi richiede

l’assemblaggio coordinato e

sequenziale di numerosi fattori

trascrizionali.

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A seguito dell’interazione tra un fattore di trascrizione (TF) e la sua sequenza di consenso, il TF determina una distorsione della topologia del duplex che lo renderà accessibile al complesso trascrizionale.

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Negli eucarioti l’inizio della trascrizione

richiede la presenza di ulteriori, spesso

numerose, proteine attivatrici.

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Struttura generale dell’mRNA batterico e delle cellule eucariotiche.

Regione non-tradotta in 5’

Regione non-tradotta in 3’

Sequenza codificante

Sito di inizio della traduzione

Sito di fine della traduzione

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Successione delle fasi di maturazione dell’mRNA eucariotico (non tutte le fasi sono necessarie per tutti gli mRNA)


DNA

Pre-mRNA

mRNA

Polipeptide

Trascrizione da parte dell’RNA polimerasi II. Il cappuccio in 5’ viene aggiunto quando sonostati sintetizzati 20-30 nucleotidi del pre-mRNA.Aggiunta della coda di poli(A) in 3’.

CAP Esone Introne Esone Introne Esone Coda di poli(A)

Promotore

Splicing: rimozione degli introni

Traduzione (sintesi proteica)

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DNA

Pre-mRNA

mRNA

Polipeptide



Promotore



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DNA

Pre-mRNA

mRNA

Polipeptide



Promotore



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DNA

Pre-mRNA

mRNA

Polipeptide



Promotore



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Alanina Ala A Cisteina Cys C Acido aspartico Asp D Acido glutammico Glu E Fenilalanina Phe F Glicina Gly GIstidina His HIsoleucina Ile ILisina Lys KLeucina Leu LMetionina Met MAsparagina Asn NProlina Pro PGlutammina Gln QArginina Arg RSerina Ser STreonina Thr TValina Val VTriptofano Trp WTirosina Tyr Y

Elenco dei 20 amminoacidi che vengono utilizzati durante la sintesi proteica.

A sinistra il loro nome, a destra la simbologia corrispondente a 3 e 1 lettera.

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Il codice genetico è costituito da 64codoni. Una tripletta, codificanteper Met, è il segnale che indical’inizio del quadro di lettura dellasequenza di mRNA. Tre tripletteche non codificano per alcunamminoacido rappresentano ilsegnale di arresto. 60 rimanentitriplette completano la codifica deirestanti 19 amminoacidi. Come sinota quindi, alcuni di essi vengonospecificati da numerose (fino a 6)triplette distinte. Il codice èuniversale, cioè condiviso da tuttele specie viventi. Tuttavia non èaffatto detto che tutti i codoni peruno specifico amminoacidovengano utilizzati con la stessaprobabilità di occorrenza in ognispecie.

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I tRNA hanno il ruolo di far corrispondere alle triplette (codoni) dell’mRNA il corretto amminoacido, mediante la corrispondenza con il loro anticodone.

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La sintesi dei polipeptidiavviene nel ribosoma, unorganello che ogni cellulapossiede a migliaia.

Il ribosoma lega gli mRNA ene facilita l’interazione con itRNA per consentire la sintesidi una catena polipeptidica.

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Una caratteristica sequenzadella regione non-tradotta in 5’dell’mRNA (Shine-Dalgarno,RBS = ribosome binding site),posizionata 8-12 nucleotidiprima della tripletta (codone)di inizio AUG, indirizza ilcorretto legame della subunitàminore del ribosomaall’mRNA.

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La formazione del legame peptidico tra due amminoacidi viene catalizzata dall’attività peptidiltransferasica ribosomiale

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