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Luciana Ropolo Torino,10 giugno 2013

IL CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEGLI ALIMENTI: CAMPIONAMENTO,INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO, FLUSSI INFORMATIVI e GESTIONE DELLE NC

I CONTROLLI SULLE ACQUE

ll controllo ufficiale delle acque per il consumo umano viene effettuato in base al Decreto Legislativo

2 febbraio 2001, n.31.Dall’entrata in vigore del decreto, le ASL eseguono

ogni anno oltre 20.000 campionamenti sui quali i laboratori di Arpa effettuano i controlli

Acque potabili

Il controllo delle acque è un processo che si articola in:

programmazionepreparazione verbali e materialianalisi in campoprelievotrasporto campioni

accettazione campionianalisi microbiologicheanalisi chimicheanalisi fisiche

calcolo incertezza di misuraespressione risultatovalutazione conformitàredazione rapporto di prova

FASI POST ANALITICHE

FASI PREANALITICHE(campionamento)

FASI ANALITICHE

CAMPIONAMENTO: procedura definita secondo cui una parte di sostanza, materiale o prodotto, è prelevata per fornire un campione rappresentativo della totalità…. Le procedure di campionamento dovrebbero descrivere i criteri di selezione, il piano di campionamento, di ritiro e di preparazione di uno o più campioni a partire da una sostanza, da un materiale o da un prodotto per ottenere l’informazione richiesta (UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005)

PRELIEVO: fase del campionamento in cui le modalitàoperative sono descritte nel dettaglio da norme, procedure di campionamento etc e il cui svolgimento non comporta discrezionalitàda parte dell’operatore che la esegue.

Rapporti ISTISAN 07/5MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO E CONSERVAZIONEDEI CAMPIONI

0. Generalità e definizioniL’insieme dei procedimenti e delle operazioni che intercorrono tra il momento del prelievo del campione e lo svolgimento di un’analisi microbiologica rappresenta una delle fasi più delicate dell’intero procedimento analitico. I risultati analitici, e in particolare quelli microbiologici, infatti,devono permettere di stabilire le caratteristiche della matrice analizzata nelle condizioni in cui essa si trova nel momento in cui viene effettuato il prelievo.La fase pre-analitica, raccolta del campione,trasporto e sua conservazione, incide in misura non trascurabile sull’incertezza totale del risultato dell’analisi, diventando quindi strumento indispensabile per ottenere risultati analitici attendibili e affidabili.


Campioni rappresentativi possono essere ricavati solo sulla base di piani di campionamento che prevedano:�obiettivi del prelievo,�individuazione delle stazioni di prelievo, �tempi e frequenze con cui debbono essere raccolti i campioni,�le modalità di manipolazione e conservazione dei campioni,�gli eventuali parametri da determinare in situ e

�i criteri di valutazione e gestione dei dati.


ProgrammazioneNell’ambito della collaborazione ASL/Arpa Piemonte per la costruzionedell’anagrafica comune dei punti di prelievo per la matrice “acque potabili”, l’Assessorato Tutela della Salute e Sanità ha attivato il sito http://sian.reteunitaria.piemonte.it con il nuovo programma per la gestione dei dati delle acque potabili in ambiente web.Con D.D. n. 201 del 15/03/2011 sono state approvate le ”Linee Guida per la gestione dei dati del Sistema informativo regionale in materia di acque destinate al consumo umano”. •Anagrafica condivisa tra Asl e Arpa•Possibilità di accesso al portale agli operatori di entrambi i servizi•Archivio dati•Programmazione attività


Preparazione verbali

Nel sito http://sian.reteunitaria.piemonte.it si trovano i modelli di verbale:

�Verbale per prelievi fiscali�Scheda di campionamento per campioni non fiscali�Verbale per prelievi a pagamento�Scheda di campionamento per prelievi di acqua superficiale da potabilizzare


Preparazione verbali

Uniformare la tipologia:1° campione sempre conoscitivo, 2° campione fiscale (in caso di non

conformità del 1°) e nei casi in cui la legge obbliga la fiscalità sempre.

Necessità di piena corrispondenza tra n° bottiglie consegnate e n° bottiglie inserite su programma; volume idoneo.

Sul verbale di prelievo va riportata ogni notizia utile alla interpretazione dei risultati delle analisi (ad esempio dati riguardanti gli eventuali trattamenti di potabilizzazione in corso, la concentrazione del cloro libero in rete al punto di prelievo, la data dell'ultima disinfezione o pulizia effettuata in caso di controllo su vasche di raccolta, ecc.).

Etichette : utilizzo esclusivo di quelle stampabili dal programma in quanto legate al verbale; utilizzo di un’etichetta per ogni bottiglia

Preparazione materiale :


Preparazione materialeAnalisi microbiologiche:Bottiglie sterili volume circa 500 mlin plastica monouso (verificare data scadenza sterilizzazione)o in vetro pirex (utilizzo entro 3 mesi dalla sterilizzazione)con tiosolfato di sodio 10% nella quantità di 0,1 mL per ogni 100 mL di capacitàdella bottiglia in grado di neutralizzare fino a 5 mg/L di cloro residuo libero e combinato. Analisi chimiche:Bottiglie in vetro o plastica secondo le indicazioni del laboratorio

Materiale vario: termometro, flambatore, disinfettante, contenitori refrigerati……

È a carico del committente l’approvvigionamento dei materiali per il prelievo ed il trasporto dei campioni, salvo accordi locali o particolari esigenze analitiche (Accordo Arpa-Sanità prot. 15289 del 16/4/2010).


Analisi in campo

Misurazione T° acqua

Misurazione cloro libero


Prelievo� Istantaneo (raccolta di un unico campione in un’unica soluzione, in punti

rappresentativi e in un tempo breve)� Evitare qualsiasi contaminazione e alterazione della qualità del campione

da esaminare.� Non sciacquare mai, all’atto del prelievo, le bottiglie/contenitori utilizzati per

prelevare campioni per analisi microbiologiche. Il risciacquo oltre ad esporre i recipienti a possibili contaminazioni, asporterebbe il sodio tiosolfato eventualmente presente.

� È opportuno disinfettare il rubinetto esternamente e internamente rimovendo, se presenti, tubi di plastica e gomma.

� Prima del campionamento flambare i rubinetti metallici e/o disinfettare con una soluzione di sodio ipoclorito o analoghi disinfettanti: possono essere utilizzate soluzioni al 10% di sodio ipoclorito commerciale o di sodio dicloroisocianurato.


Prelievo�Eseguire il prelievo dopo avere fatto scorrere dal rubinetto l’acqua

per 1-3 minuti evitando di modificare la portata del flusso durante laraccolta del campione.

�All’atto del prelievo, aprire la bottiglia sterile avendo cura di non toccare la parte interna del tappo che andrà a contatto con il campione prelevato, né l’interno del collo della bottiglia e provvedere all’immediata chiusura della stessa subito dopo il prelievo, avendo cura di non riempirla completamente al fine di consentire una efficace omogeneizzazione del campione, in laboratorio, al momento dell’analisi.

�Per i campioni destinati all’analisi chimica i contenitori devono essere sufficientemente risciacquati con la stessa acqua da prelevare


Trasporto campioni

� Durante il trasporto e la conservazione di campioni di acqua per l’analisi microbiologica è necessario mantenere la rappresentatività del campione da analizzare e quindi prevenire il decadimento o la ricrescita dei microrganismi presenti.

� Per quanto possibile, si devono quindi limitare alterazioni che sono spesso inevitabili in un’aliquota ridotta di acqua mantenuta in un contenitore chiuso.

� Le alterazioni cui possono andare incontro campioni di acqua prelevati possono avere origine, non solo dalla condizione di spazio confinato in cui si ritrovano, ma anche da fattori fisici-chimici biologici (composizione chimica dell’acqua, pH, azoto proteico, qualità e quantità della flora batterica presente, fenomeni di fagocitosi, ecc.) e dalla inosservanza dei tempi e/o delle modalità di trasporto.

� Il campione deve essere protetto sia dalla luce (ultravioletta e visibile) sia dalle alte temperature e deve essere trasportato in laboratorio in idonee condizioni igieniche.


Trasporto campioni� Durante il trasporto le bottiglie devono essere collocate nel contenitore in

modo da impedire il loro rovesciamento e, fra esse devono essere collocati idonei sistemi di separazione per evitare rotture

� Tutti i campioni, dall’atto del prelievo sino all’arrivo in laboratorio, vanno conservati ad una temperatura inferiore a 10 °C

� Consigliabile l’uso di frigoriferi portatili a batteria con termocoppie registranti la temperatura

� Tuttavia, è almeno necessario usare contenitori termoisolanti che contengano piastre eutettiche, evitando comunque il congelamento del campione

� Inserire sempre nel contenitore di trasporto un boccetto testimone” (provetta contenente acqua o altro liquido idoneo ) sul quale viene effettuata la misurazione della temperatura da parte dell’ufficio accettazione campioni dell’Arpa.


Trasporto campioniNonostante la necessità di mantenere la temperatura dei campioni di acqua nell’intervallo di valori consigliati, qualora le condizioni ambientali e quelle intrinseche del campione non lo consentano, si raccomanda di verificare che la temperatura di conservazione del campione non superi mai quella rilevata all’atto del prelievo.

Fermo restando che il tempo che intercorre tra prelievo e analisi dei campioni, indipendentemente dalla loro natura, deve essere il più breve possibile, nel caso di acque destinate al consumo umano, corre l’obbligo di non superare le 24 ore.

FASI ANALITICHE

Accettazione campioniAl momento dell’accettazione, vengono verificati da parte delle strutture che ritirano i campioni gli elementi relativi al campionamento ed al trasporto riportati nel verbale.

Qualora la temperatura rilevata risulti al di fuori dei criteri di accettabilità, o qualora non sia presente il boccetto testimone, il campione viene comunque accettato e sottoposto a prova; nel rapporto di prova vengono riportati in nota gli esiti negativi delle verifiche qualora possano aver avuto influenza sui risultati di prova e la dichiarazione finale di conformità viene effettuata solo limitatamente agli esiti delle prove non condizionate da tali situazioni.

FASI ANALITICHE

Analisi microbiologicheLa matrice acqua costituisce un elemento di relativa facile manipolazione a livello analitico, ma le sue caratteristiche chimico-fisiche-microbiologiche, specifiche per ogni tipologia, possono costituire fonte di instabilità quali-quantitativa dei suoi costituenti.

La variazione casuale dovuta alla distribuzione non uniforme delle particelle tra campioni paralleli, persino nelle sospensioni perfettamente miscelate, è una caratteristica dei metodi microbiologici.

La variazione casuale di base è inevitabile e non ha niente a che fare con le competenze tecniche o l’apparecchiatura. Essa segue una legge matematica nota, la distribuzione di Poisson.

FASI ANALITICHE

Analisi microbiologicheIl tempo di sopravvivenza dei microrganismi nelle acque può essere condizionato, oltre che dal loro stato di vitalità, anche dall’adesione a materiale particolato.Infatti, l’acqua, e quella disinfettata in particolare, rappresenta una matrice non favorevole alla sopravvivenza delle forme microbiche. Cellule batteriche sottoposte a condizioni di stress ambientale possono comunque sopravvivere e permanere a stadi diversi di vitalità, ma piùspesso, pur restando metabolicamente attive, possono perdere la capacità di moltiplicarsi in condizioni standard di laboratorio, rimanendo quindi vitali ma diventando non coltivabili.


Calcolo incertezza di misuraParametro associato al risultato di una misurazione che caratterizza la dispersione dei valori ragionevolmente attribuibili al misurando

Concettualmente….

L’incertezza di misura può essere intesa come la stima dell’intervallo di valori entro cui cade il valore vero di una misura.Il valore di una caratteristica numerica è sempre incertoLa conoscenza dell’ampiezza di tale incertezza è indispensabile per utilizzare al meglio i risultati delle misure


Valutazione conformità (dati chimici)

conforme

non conforme

Limite di legge

Procedura Tecnica U.RP.T077:Linee guida per individuazione conformità/non conformità in relazione ad incertezza di misura e limiti normativiArpa Piemonte adotta il criterio cautelativo “in dubio pro reo” , tramite il quale la non conformità viene espressa solo quando vi è la certezza oltre ogni ragionevole dubbio del superamento del valore di riferimento.


Valutazione conformità (dati microbiologici)

L’incertezza di misura viene associata al risultato per valori ≥10 U.F.C.Arpa Piemonte adotta il criterio cautelativo per la salute pubblica , tramite il quale la non conformità viene espressa quando viene superato il limite di legge, indipendentemente dall’incertezza.

i

ii

iv

iiiLimite di legge

non conforme

conforme

FASI ANALITICHE

Analisi microbiologiche

FASI ANALITICHE

Analisi microbiologiche

L’incertezza casuale aumenta rapidamente con la riduzione della conta delle colonie.Nell’intervallo di conteggio sotto a 10 circa, che è di considerevole interesse per la salute pubblica, le singole misurazioni sono cosìimprecise che possono essere a malapena caratterizzate come migliori che semiquantitative.


Espressione risultati microbiologici <10 U.F.C.Nel caso di numero di colonie tra 4 e 9 , la precisione diminuisce quindi il risultato calcolato con la formula, viene espresso come “ UFC stimate/volume di campione” senza associare il valore dell’incertezza di misura.Nel caso di numero di colonie da 1 a 3 , la precisione è così bassa che il risultato dovrebbe essere riportato senza un dato numerico, ma con l’espressione: “ microrganismi presenti nel volume analizzato” ; in base ad accordi con il cliente, anche in questo caso si può esprimere il dato numerico come“ UFC stimate/volume di campione”, senzaassociare il valore dell’incertezza di misura.Se non vengono rilevate colonie il risultato è espresso come 0 UFC/volume di campione o <1 UFC/volume di campione a seconda di quanto previsto dalla legislazione di riferimento.


Redazione rapporto di provaIl rapporto di prova è il documento con il quale i risultati delle analisi sono trasmessi al committente; esso riporta, tra l’altro, tutte le indicazioni identificative del campione e l’eventuale accreditamento.

Nel rapporto di prova i risultati sono riportati con un numero di cifre significative compatibile con il metodo adottato, con le relative unità di misura e corredati dell’incertezza di misura se significativa per la valutazione di conformità e/o se richiesta dal Committente.

Il rapporto di prova è accompagnato, di norma, da una “dichiarazione di conformità/non conformità ” specifica dell’ambito di competenza (chimico, fisico, biologico), che rappresenta una verifica di conformità/non conformità dei dati prodotti in relazione ai requisiti di legge in caso di normativa specifica o a valori guida concordati, e che specifica i parametri non regolamentari . In questi ultimi casi e qualora ritenuto necessario, può essere emesso un “parere tecnico ”, che esprime il giudizio dell’analista in merito alle analisi effettuate.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

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