III Convegno SCAN 31 maggio 2005

IDENTIFICAZIONE DI AUTOANTIGENI ENDOTELIALI IN LES CON MANIFESTAZIONI

PSICHIATRICHE

Elena Ortona

III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Autoimmunità• L'autoriconoscimento è un fenomeno fisiologico essenziale

nell'omeostasi dell'immunita' e nel controllo delle risposte immunitarie.

• La risposta autoimmunitaria rappresenta un fenomeno secondario e privo di un rilevante significato patogenetico; es. transitoria comparsa in circolo di autoanticorpi in soggetti con infarto del miocardio, di autoanticorpi antimuscolo liscio nella gran parte delle virosi acute; di anticorpi antinucleari nell'epatite indotta da virus di tipo A o B, e di anticorpi anticute negli ustionati gravi.

• La denominazione " malattia autoimmune ", riguarda solo quei casi in cui le alterazioni strutturali e funzionali sono causate da risposte immunitarie rivolte verso costituenti propri dell'organismo.Il prototipo delle malattie autoimmuni cosi' definite viene considerato il " Lupus Eritematoso Sistemico " (LES).

III Convegno SCAN 31 maggio 2005

III Convegno SCAN 31 maggio 2005

Autoanticorpi associati con il LES

Autoanticorpo

Frequenza(%)

Specificità diagnostica

ANA 95-98 Di screening ma non specifici

Anti-dsDNA

50-60 Alta. A titolo elevato nel LES con coinvolgimento renale e cerebrale

Anti-RNP 5-10 Abbastanza alta. Nel LES con F.Raynaud ed interessamento polmonare

Anti-Sm 15-20 Alta. Nel LES con coinvolgimento renale e cerebrale

Anti-SSA/Ro

Circa 30 Bassa. Fotosensibilità, LES cutaneo sub-acuto, Lupus neonatale, Lupus associato a deficit di

complemento

Anti-SSB/La

Circa 10 Bassa.Nel Lupus neonatale in associazione con anti-SSA/Ro o nel LES con “Sicca Sindrome”

Anti-Ku 5-10 Alta

Anti-PCNA

3-4 Alta

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Il LES è una malattia cronica autoimmune sistemica con un ampio spettro di manifestazioni cliniche

Lupus eritematoso sistemico

1. ARTRITE

2. GLOMERULONEFRITE

3. MANIFESTAZIONI CUTANEE

4. PLEURITE E PERICARDITE

5. ALTERAZIONI EMATICHE

6. MANIFESTAZIONI NEUROPSICHIATRICHE

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Manifestazioni psichiatriche nel LES

Reazioni psicologiche alla malattia cronica

Aspetti legati all'effetto collaterale di alcuni farmaci assunti (cortisone in particolare)

Eventuali aspetti riguardanti la personalita' premorbosa del paziente

• Manifestazioni neuropsichiatriche dovute a danni organici propri del Lupus Eritematoso Sistemico (NEURO-LES)

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Acute confusional stateGuillain-Barrè syndrome

Anxiety disorderAseptic meningitis

Cerebrovascular diseaseCognitive dysfunction

Demyelinating syndromeHeadache

Mononeuropathy  

 

Transverse myelopathyMood disorder

Movement disorderMyasthenia gravis

Autonomic neuropathyPlexopathy

PolyneuropathyPsychosis

Seizure disorders

Sindromi neuropsichiatriche definite dal ACR Research Committee

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Fattori patogenetici primari associati a LES con manifestazioni

neuropsichiatriche  

Alterazioni vascolariVasculopatie non infiammatorie

VasculitiTrombosiCitochine

Interleuchine 2, 6, 8 e 10Interferon

AutoanticorpiAnticorpi anti-neuroni

Anticorpi anti-proteina P ribosomaleAnticorpi anti-fosfolipidi

AECA

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►La sintesi degli autoanticorpi avviene in periferia e il passaggio nel CSF avviene a causa del danneggiamento della barriera emato-encefalica, per vasculopatie e microinfarti.

►La sintesi degli autoanticorpi avviene direttamente nel sistema nervoso. Le cellule B o le plasmacellule possono attraversare la barriera emato-encefalica a livello parenchimatico e secernere anticorpi a livello intratecale (aumento dell’espressione di molecole di adesione).

Presenza di autoanticorpi nel CSFDUE IPOTESI

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Meccanismi patogenetici degli autoanticorpi coinvolti nelle manifestazioni

neuropsichiatriche

• Anticorpi anti-cellule endoteliali aumentano la permeabilità del microcircolo

• Autoanticorpi cross-reattivi con recettori neuronali

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Cross-reazioni tra anticorpi anti-DNA e il recettore NMDA

Recentemente è stato dimostrato che:• un subset di anticorpi anti-DNA in pazienti con

NPSLE cross-reagiscono con recettori NMDA• Tali anticorpi possono causare morte neuronale

attraverso un meccanismo eccitotossico• Gli anticorpi sono stati trovati anche nel CSF di

pazienti con NPSLE.

Nature Medicine 7:1189 2001

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AECA e manifestazioni psichiatriche

No psychiatric groupN=34

NormalDonorsN=66

*P<10-4

p<0.0001

 

Box-and-whisker

120

100

80

60

40

20

0

AE

CA

BI

(%)

NPSLE SLE NHS

Conti et al. Arthritis Res Ther 2004

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RUOLO DEGLI ANTICORPI ANTI-CELLULE ENDOTELIALI (AECA)

GLI AECA SONO PRESENTI NEL SIERO DEI PAZIENTI CON PATOLOGIE AUTOIMMUNI CARATTERIZZATE DA UN DANNO VASCOLARE

EVIDENZE CLINICHE DIMOSTRANO CHE GLI AECA SONO COINVOLTI NELLA PATOGENESI DEL LES E SONO CORRELATI CON L’ATTIVITÀ DELLA MALATTIA

LE MOLECOLE BERSAGLIO DEGLI AECA SONO PER LA MAGGIOR PARTE SCONOSCIUTE

IN MODELLI SPERIMENTALI GLI AECA SONO IN GRADO DI ATTIVARE E DANNEGGIARE LE CELLULE ENDOTELIALI

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Gli AECA causano attivazione, lisi e

apoptosi delle cellule endoteliali

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Identificazione delle molecole bersaglio degli AECA

• Comprensione dei meccanismi patogenetici

• Utilizzo come marcatori diagnostici e/o prognostici di manifestazioni psichiatriche

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Identificazione di nuovi autoantigeni endoteliali mediante screening di librerie di espressione ed analisi proteomiche.

Caratterizzazione della risposta immunologica specifica e valutazione del loro uso nella diagnosi e nel monitoraggio.

Valutazione del ruolo patogenetico degli autoanticorpi specifici su linee cellulari e su modelli murini.

OBIETTIVI DEL PROGETTO DI RICERCA

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SCREENING DELLA LIBRERIA DI ESPRESSIONE HUAEC

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Espressione e purificazione della proteina ricombinante

La sequenza nucleotidica del cDNA clonato viene sequenziato con sequenziatore automatico.ABI Prism 310 Collection (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA)

Le sequenze vengono poi confrontate con le banche dati mediante Fasta e Blast

Il cDNA viene clonato nel vettore di espressione QIA express vector, pQE30. La proteina di fusione è espressa in Escherichia coli SG130009 e purificata per cromatografia di affinità con una

resina di NI-NTA specifica per la coda di 6 istidine

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NEDD5 C-T

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NEDD5 APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SEPTINE

• NEDD5 È UNA PROTEINA DEL CITOSCHELETRO ED APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SEPTINE, UNA FAMIGLIA DI PROTEINE MOLTO CONSERVATE E COINVOLTE IN DIVERSI PROCESSI CELLULARI

• NEDD5 È UNA PROTEINA DI 361 aa ED UN PESO MOLECOLARE DI 41,5 kDa. ESSA È CARATTERIZZATA DA TRE DOMINI FUNZIONALI:

• NEDD5 È ESPRESSA IN MODO PREDOMINANTE NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE DOVE E’ COINVOLTA NELLA REGOLAZIONE DELLA SECREZIONE. NEDD5 CONTRIBUISCE INOLTRE ALLA FORMAZIONE DELLE LESIONI NEUROFIBRILLARI NELLA MALATTIA DI ALZHEIMER.

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Caratterizzazione immunochimica di Nedd5

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Localizzazione di NEDD5 in cellule HEP-2 e in cellule endoteliali

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Apoptosi e AutoimmunitàLe malattie autoimmuni come il lupus sono caratterizzate da un difetto della regolazione dell’apoptosi e dall’accumulo di cellule apoptotiche.

Le modificazioni di proteine intracellulari durante l’apoptosi e la loro redistribuzione sulla superficie delle cellule apoptotiche portano all’induzione della risposta autoimmune.

Come fa una proteina intracellulare a diventare autoantigenica?

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DISTRIBUZIONE DI NEDD5 IN CELLULE ENDOTELIALI DURANTE L’APOPTOSI

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IgG anti-Nedd5 in pazienti con LES divisi in base alla presenza di manifestazioni psichiatriche

. * P= 0.04 ,# P= 0.034,° P= 0.003; ^ P=0.046; § P=0.007.

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ConclusioniNedd5 è un nuovo autoantigene nel LES.

L’espressione di Nedd5 sulla superficie di cellule endoteliali in apoptosi giustifica la reattività autoimmune di questa proteina intracellulare.

IgG anti-Nedd5 sono associate alla presenza di manifestazioni psichiatriche in pazienti con LES e possono essere un marcatore immunologico di tali manifestazioni.

Ulteriori studi chiariranno se questi autoanticorpi siano patogenetici.

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Prospettive futureIgG anti-Nedd5

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Immunoblotting di proteine di membrana di cellule endoteliali rivelate con IgG presenti nel liquor di 2

pazienti con lupus psichiatrico e di 2 soggetti senza

malattie autoimmuni 194

116

95

51

37

29

20

6

kDa

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• Paola Margutti• Federica Delunardo• Ettore Piro• Rachele Riganò• Elisabetta Profumo• Brigitta Buttari• Alessandra Siracusano

• Maurizio SoriceDipartimento Medicina Sperimentale e Patologia, Università “La Sapienza”, Roma.

• Fabrizio Conti • Guido Valesini

Dipartimento di Clinica e Terapia Medica Applicata, Cattedra di Reumatologia, Università “La Sapienza”, Roma.

• Ada Francia• Simona Pontecorvo

III Cattedra Neurologica, Università “La Sapienza”, Roma.