Idrolisi di esteri Idrolisi di Esteri -Criteri generali · condizioni di reazione. Ampi screening...

Idrolisi di Esteri Idrolisi di Esteri --Criteri generaliCriteri generali

Esistono molte poche Esistono molte poche esterasiesterasi che possono essere utilizzate per che possono essere utilizzate per l’idrolisi di esteri. Tra queste particolarmente importanti sonol’idrolisi di esteri. Tra queste particolarmente importanti sono la la PLE PLE ((pigpig liverliver esteraseesterase) ) HLEHLE ((horsehorse liverliver esteraseesterase) e la ) e la ACEACE ((acetilcolineacetilcolineesteraseesterase) estratta dall’anguilla elettrica. Possono essere anche ) estratta dall’anguilla elettrica. Possono essere anche utilizzare le cellule microbiche, ma questo limita la variazioneutilizzare le cellule microbiche, ma questo limita la variazione delle delle condizioni di reazione. Ampi screening per individuare nuove condizioni di reazione. Ampi screening per individuare nuove esterasiesterasie per esprimerle in e per esprimerle in microorganismimicroorganismi ospiti sono in corsoospiti sono in corso

Fortunatamente per queste reazioni possono essere utilizzare ancFortunatamente per queste reazioni possono essere utilizzare anche le he le proteasiproteasi. Le più utilizzate sono la . Le più utilizzate sono la αα--chimotripsinachimotripsina e la e la subtilisinasubtilisina. . Vengono anche utilizzate, anche se in modo minore, la Vengono anche utilizzate, anche se in modo minore, la tripsinatripsina, , pepsinapepsina, , papainapapaina e la e la penicillina penicillina acilasiacilasiIn generale vengono idrolizzati gli esteri che mimano la configuIn generale vengono idrolizzati gli esteri che mimano la configurazione razione di un amminoacido Ldi un amminoacido L

Idrolisi di esteriIdrolisi di esteri

Substrato tipo per Substrato tipo per esterasiesterasi e e proteasiproteasiIdrolisi di esteriIdrolisi di esteri


Idrolisi di Esteri Idrolisi di Esteri ––Regole generaliRegole generali

Per entrambi i tipi di esteri lo stereocentro deve essere collegPer entrambi i tipi di esteri lo stereocentro deve essere collegato ato il più possibile vicino al centro reattivo per assicurare un il più possibile vicino al centro reattivo per assicurare un riconoscimento chirale massimo.riconoscimento chirale massimo.I gruppi RI gruppi R11 e Re R22 possono essere gruppi arilici o alchilici o sistemi possono essere gruppi arilici o alchilici o sistemi ciclici, ma la loro differenziazione ciclici, ma la loro differenziazione stericasterica deve essere deve essere massimizzata. massimizzata. Non devono essere presenti gruppi carichi o polari (COOH, CONHNon devono essere presenti gruppi carichi o polari (COOH, CONH22, , NHNH22) che sono fortemente idratati in ambiente acquoso. Per cui ) che sono fortemente idratati in ambiente acquoso. Per cui devono essere opportunamente protetti.devono essere opportunamente protetti.Per i substrati di tipo I la funzione alcolica RPer i substrati di tipo I la funzione alcolica R33 deve essere la più deve essere la più piccola possibile (Me, piccola possibile (Me, EtEt). Questo vale anche per quelli di tipo II ). Questo vale anche per quelli di tipo II (acetati o (acetati o propionatipropionati). ). In tutti i casi deve essere presente un protone legato allo In tutti i casi deve essere presente un protone legato allo stereocentro.stereocentro.


PigPig liverliver esteraseesterase (PLE)(PLE)

PLE è l’PLE è l’esterasiesterasi più versatile. E’ un enzima complesso ed è formato da più versatile. E’ un enzima complesso ed è formato da almeno cinque isoalmeno cinque iso--enzimi, che sono associati come enzimi, che sono associati come trimeritrimeri di tre di tre singole proteine. Per il loro uso come singole proteine. Per il loro uso come biocatalizzatoribiocatalizzatori possono possono comunque considerarsi come una singola proteina perché tutte comunque considerarsi come una singola proteina perché tutte mostrano reattività simili.mostrano reattività simili.IL ruolo biologico della PLE è quello di idrolizzare i vari esteIL ruolo biologico della PLE è quello di idrolizzare i vari esteri ri presenti nella dieta del maiale, e questo spiega l’eccezionale presenti nella dieta del maiale, e questo spiega l’eccezionale tolleranza ai substrati. tolleranza ai substrati. Per gli scopi pratici può essere utilizzato anche l’estratto cruPer gli scopi pratici può essere utilizzato anche l’estratto crudo, non do, non necessariamente l’enzima isolato. necessariamente l’enzima isolato. Le altre Le altre esterasiesterasi di fegato (pollo, criceto, cavallo, coniglio) si sono di fegato (pollo, criceto, cavallo, coniglio) si sono rivelate meno efficaci.rivelate meno efficaci.

Idrolisi in condizioni blande con PLEIdrolisi in condizioni blande con PLE Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)

Le condizioni blande consentono di idrolizzare composti labili oLe condizioni blande consentono di idrolizzare composti labili oaltamente altamente funzionalizzatifunzionalizzati che non resisterebbero alle condizioni che non resisterebbero alle condizioni idrolitiche acide o basiche idrolitiche acide o basiche

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi regio e stereoselettive con PLEIdrolisi regio e stereoselettive con PLE

Solo Solo monomono--acidoacido transtrans

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)AsimmetrizzazioniAsimmetrizzazioni di di diesteridiesteri

L’aumentato L’aumentato ingombro ingombro stericosterico del del gruppo R forza il gruppo R forza il substrato ad entrare substrato ad entrare nel sito attivo nel sito attivo dell’enzima con la dell’enzima con la funzione funzione entiotopicaentiotopica..Si ottiene opposta Si ottiene opposta selettivitàselettività

Centro Centro prostereogenicoprostereogenico in in αα

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)AsimmetrizzazioneAsimmetrizzazione di esteri di esteri glutariciglutarici 33--sostituitisostituiti

Centro Centro prostereogenicoprostereogenico in in ββ

La presenza di una funzione La presenza di una funzione ossidrilicaossidrilica porta ad ottenere porta ad ottenere stereoselezioni più elevatestereoselezioni più elevate

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)AsimmetrizzazioneAsimmetrizzazione di di diesteridiesteri meso aciclici meso aciclici (esteri dell’acido (esteri dell’acido succinicosuccinico e e glutaricoglutarico))

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)

Influenza della dimensione del ciclo sulla stereoselezione e selInfluenza della dimensione del ciclo sulla stereoselezione e selezione ezione della funzione da idrolizzare.della funzione da idrolizzare.L’estere L’estere dietilicodietilico del del cicloesanocicloesano viene idrolizzato lentamente e con viene idrolizzato lentamente e con basse stereoselezioni: importanza dell’alcol utilizzatobasse stereoselezioni: importanza dell’alcol utilizzato

AsimmetrizzazioneAsimmetrizzazione di di diesteridiesteri meso ciclicimeso ciclici


Composti utilizzati per le Composti utilizzati per le sintesi di composti sintesi di composti bioattivibioattivi..

I derivati I derivati esoeso sono substrati sono substrati migliori degli migliori degli endoendo

La sostituzione del residuo La sostituzione del residuo organico influenza organico influenza sensibilmente la sensibilmente la stereoselezione. Anche stereoselezione. Anche l’alcol utilizzato ha l’alcol utilizzato ha notevole importanzanotevole importanza

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)AsimmetrizzazioneAsimmetrizzazione di di diesteridiesteri meso ciclicimeso ciclici((CiclopentanoloCiclopentanolo--monoesteremonoestere, building block per la sintesi di , building block per la sintesi di prostaglandineprostaglandine))

Forte influenza della Forte influenza della natura dell’estere natura dell’estere utilizzato. eeutilizzato. eeMAXMAX=86%=86%

L’L’acetilcolinaacetilcolina esterasiesterasi ((ACEACE) è più ) è più selettiva e ha stereoselezione selettiva e ha stereoselezione opposta al PLE.opposta al PLE.

Con l’ACE si osserva anche una Con l’ACE si osserva anche una forte influenza delle dimensioni del forte influenza delle dimensioni del ciclo con inversione di selettività ciclo con inversione di selettività per cicli più grandi.per cicli più grandi.Selettività simili sono state Selettività simili sono state ottenute anche con delle lipasi ottenute anche con delle lipasi ((Candida Candida antarcticaantarctica e e porcine porcine pancreas pancreas lipaselipase))

Idrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)AsimmetrizzazioneAsimmetrizzazione di di diesteridiesteri meso ciclici azotatimeso ciclici azotati

Il cis-diacetato (ee=92%) è un substrato migliore del cis-dicarbossilato (ee=75%), le stereoselezioni sono opposte

Il Il ciscis--diacetatodiacetato (ee=92%) è un substrato migliore del (ee=92%) è un substrato migliore del ciscis--dicarbossilato (ee=75%), le stereoselezioni sono oppostedicarbossilato (ee=75%), le stereoselezioni sono opposte


Risoluzione cinetica di Risoluzione cinetica di diesteridiesteri acicliciaciclici

Sono compatibili anche composti organometalliciSono compatibili anche composti organometallici

Risoluzione cinetica di Risoluzione cinetica di diesteridiesteri ciclicicicliciIdrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)

NN--acetilaminoacetilamino ciclopentanociclopentano carbossilatocarbossilato::

sintesi di analoghi sintesi di analoghi carbociclicicarbociclici di di nucleosidinucleosidiad attività antiad attività anti--viralevirale

sintesi di prodotti naturalisintesi di prodotti naturali

Risoluzione cinetica di Risoluzione cinetica di diacetatidiacetati ciclicicicliciIdrolisi di esteri (PLE)Idrolisi di esteri (PLE)

Forte influenza delle dimensioni del ciclo con inversione di selForte influenza delle dimensioni del ciclo con inversione di selettività per ettività per cicli più grandicicli più grandi

KK11>k>k33 kk44>k>k33

Utilizzo di Utilizzo di esterasiesterasi microbichemicrobicheIdrolisi di esteriIdrolisi di esteri

Sono stati anche utilizzate cellule intere di batteri e funghi Sono stati anche utilizzate cellule intere di batteri e funghi alternativamente agli enzimi isolati.alternativamente agli enzimi isolati.BacillusBacillus subtilissubtilis, , BrevibacteriumBrevibacterium ammoniagenesammoniagenes, , BacillusBacillus coagulanscoagulans, , PichiaPichiamisomiso, , RhizopusRhizopus nigricansnigricans

Le condizioni di reazione sono più complesse ma in alcuni casi lLe condizioni di reazione sono più complesse ma in alcuni casi le e stereoselezioni sono miglioristereoselezioni sono migliori

La protezione della funzione carbossilica terminale come estere La protezione della funzione carbossilica terminale come estere terzterz--butilicobutilicone previene l’idrolisine previene l’idrolisi

Per evitare problemi derivanti dal metabolismo degli organismi nPer evitare problemi derivanti dal metabolismo degli organismi nelle elle fermentazioni sono state utilizzare fermentazioni sono state utilizzare restingresting cellscells di di Baker’Baker’s s yeastyeast

Un esempio interessante riguarda la risoluzione dell’acetato delUn esempio interessante riguarda la risoluzione dell’acetato delpantolattonepantolattone, un precursore dell’acido , un precursore dell’acido pantenoicopantenoico, costituente di , costituente di una vitamina del gruppo B una vitamina del gruppo B

RestingResting cellscells di di Baker’Baker’s s yeastyeastIdrolisi di esteriIdrolisi di esteri

Risoluzione del 1Risoluzione del 1--alchinalchin--33--il acetato con il acetato con restingresting cellscells di di Baker’Baker’s s yeastyeast


UlitizzoUlitizzo sintetico di 1sintetico di 1--alchinalchin--33--olioli Idrolisi di esteriIdrolisi di esteri

L’importanza dei derivati degli acidi L’importanza dei derivati degli acidi arilpropioniciarilpropionici come come antiinfiammatoriantiinfiammatori e prodotti e prodotti agrochimiciagrochimici ha portato ad effettuare ha portato ad effettuare un intenso programma di screening che ha permesso di isolare unaun intenso programma di screening che ha permesso di isolare unanuove nuove esterasiesterasi dal dal BacillusBacillus SibtilisSibtilis, , lala carbossilcarbossil esterasiesterasi NP.NP.

Sintesi di derivati di acidi aril Sintesi di derivati di acidi aril propionicipropionici Idrolisi di esteriIdrolisi di esteri

Sintesi di derivati di acidi aril Sintesi di derivati di acidi aril propionicipropionici

La presenza di un ossigeno legato allo stereocentro porta ad La presenza di un ossigeno legato allo stereocentro porta ad un’inversione della selettività di idrolisi un’inversione della selettività di idrolisi (questo non viene messo in evidenza con l’assegnazione della (questo non viene messo in evidenza con l’assegnazione della configurazione assoluta degli configurazione assoluta degli stereocentristereocentri, l’ossigeno ha priorità , l’ossigeno ha priorità maggiore rispetto al carbonio)maggiore rispetto al carbonio)


Utilizzo di Utilizzo di proteasiproteasi come come esterasiesterasi: : αα--cchimotripsinahimotripsinaIdrolisi di esteriIdrolisi di esteri

L’utilizzo di L’utilizzo di proteasiproteasi per l’idrolisi di esteri non naturali è stata per l’idrolisi di esteri non naturali è stata applicata con successo già dal 1976 utilizzando principalmente lapplicata con successo già dal 1976 utilizzando principalmente laapapaina papaina e l’e l’ αα--cchimotripsinahimotripsina. Perché il processo sia altamente . Perché il processo sia altamente selettivo è necessaria la contemporanea presenza di un sostituenselettivo è necessaria la contemporanea presenza di un sostituente te polare e uno polare e uno idrofobicoidrofobico sullo stereocentro in sullo stereocentro in αα alla funzione alla funzione estereaesterea (analogamente a quanto avviene negli amminoacidi).(analogamente a quanto avviene negli amminoacidi).


Idrolisi Idrolisi regioselettiveregioselettive: : αα--cchimotripsinahimotripsina vsvs papainapapaina

La La papainapapaina è una delle poche è una delle poche proteasiproteasi utilizzate in sintesi organica utilizzate in sintesi organica di origine vegetale (la papaia). Altre di origine vegetale (la papaia). Altre proteasiproteasi vengono isolate dai vengono isolate dai fichi (fichi (ficinaficina) e dall’ananas () e dall’ananas (bromelainabromelaina).).


Idrolisi Idrolisi regioselettiveregioselettive: : subtilisinasubtilisina

La selettività è completa, nella miscela di reazione non si è La selettività è completa, nella miscela di reazione non si è osservata la presenza di altri osservata la presenza di altri regioisomeriregioisomeri

è chirale?è chirale?


Idrolisi Idrolisi chemochemo e stereoselettive: e stereoselettive: penicillina penicillina acilasiacilasi

La penicillina La penicillina acilasiacilasi è altamente selettiva è altamente selettiva nell’idrolisi di un gruppo nell’idrolisi di un gruppo fenilacetofenilaceto del del substrato naturale, la penicillina G.substrato naturale, la penicillina G.

Per cui gioca un ruolo importante nella chimica della rimozione Per cui gioca un ruolo importante nella chimica della rimozione selettiva di gruppi protettori (idrolisi selettiva di selettiva di gruppi protettori (idrolisi selettiva di fenilacetatifenilacetati vsvsacetatiacetati




Idrolisi stereoselettive: Idrolisi stereoselettive: AspergillusAspergillus oryzaeoryzae proteasiproteasi

Una Una proteasiproteasi derivante dall’derivante dall’AspergillusAspergillus oryzaeoryzae, utilizzato , utilizzato principalmente per la lavorazione del formaggio, ha mostrato principalmente per la lavorazione del formaggio, ha mostrato elevate reattività e selettività nella risoluzione di substrati elevate reattività e selettività nella risoluzione di substrati particolarmente ingombrati, particolarmente ingombrati, carbossilaticarbossilati αα,,αα,,αα--trisostituititrisostituiti, , sustratisustrati per i quali le altre per i quali le altre proteasiproteasi non mostrano particolari non mostrano particolari reattivitreattivitàà e selettivite selettivitàà

Acido di Acido di MosherMosher: agente : agente derivatizzantederivatizzante chiralechirale

Chiral Chiral DerivatingDerivating AgentsAgents ((CDAsCDAs))

(±)H

XHL2L3

X=O, NH

+

CF3

MeOPh Cl

O

H

XL2

L3OMePh

CF3

O H

XL3

L2CF3

PhOMe

O

+

CF3

MeOPh OH

O

Analisi dei prodotti via NMR:Analisi dei prodotti via NMR:

CF3

MeOPh OH

O--OMeOMe 11H NMR; H NMR; --CFCF33

1919F NMRF NMR

Risoluzione dinamica con Risoluzione dinamica con proteasiproteasi da da StreptomycesStreptomyces griseusgriseus

Sintesi del Sintesi del KetorolacKetorolac, un agente , un agente antianti--infiammatorioinfiammatorio

A A pHpH = 9 il substrato = 9 il substrato racemizzaracemizzamentre non mentre non racemizzaracemizza l’acido l’acido corrispondente. Perché?corrispondente. Perché?

N

OOEt

O

H

N

OOEt

O

N

OOEt

O

Ottimizzazione della selettivitàOttimizzazione della selettività

Per ottimizzare reazioni enzimatiche che procedono con selettiviPer ottimizzare reazioni enzimatiche che procedono con selettività non tà non particolarmente elevate (E=3particolarmente elevate (E=3--20) possiamo agire sulle tre componenti 20) possiamo agire sulle tre componenti principali:principali:

((biobio)catalizzatore )catalizzatore substrato substrato mezzo di reazionemezzo di reazione

La possibilità di scegliere un La possibilità di scegliere un biocatalizzatorebiocatalizzatore migliore è strettamente migliore è strettamente legata alla loro disponibilità. Per esempio vi sono poche legata alla loro disponibilità. Per esempio vi sono poche esterasiesterasimentramentra la scelta di lipasi è molto più vasta. la scelta di lipasi è molto più vasta. Eventualmente si può modificare l’enzima, per esempio mediante Eventualmente si può modificare l’enzima, per esempio mediante directeddirected evolutionevolution..


Modificazione del substratoModificazione del substrato

E’ la cosa più agevole, specie per un chimico organico.E’ la cosa più agevole, specie per un chimico organico.Si può agire principalmente sulla struttura Si può agire principalmente sulla struttura tridimensionale del substrato e secondariamente sugli tridimensionale del substrato e secondariamente sugli effetti elettronici.effetti elettronici.

Questo può essere fatto agevolmente utilizzando Questo può essere fatto agevolmente utilizzando differenti differenti gruppi protettorigruppi protettori che modificano che modificano temporaneamente la natura del substrato e poi possono temporaneamente la natura del substrato e poi possono essere rimossiessere rimossi

Ottimizzazione della selettivitàOttimizzazione della selettivitàOttimizzazione della idrolisi catalizzata da PLE Ottimizzazione della idrolisi catalizzata da PLE

modificazione del substratomodificazione del substrato

Si sintetizzano una serie di ammidi che influenzano fortemente iSi sintetizzano una serie di ammidi che influenzano fortemente il l livello di stereoselezione e l’induzione del processolivello di stereoselezione e l’induzione del processo

Ottimizzazione del processo Ottimizzazione del processo modificazione del substratomodificazione del substrato


Si può anche modificare la struttura del substrato rendendolo Si può anche modificare la struttura del substrato rendendolo temporaneamente più rigido e ricco di elettroni temporaneamente più rigido e ricco di elettroni ΠΠ

Riduzione con Riduzione con RaneyRaney--NickelNickel

Reazioni di Reazioni di desolforizzazionedesolforizzazione mediate da mediate da RaneyRaney NickelNickel

RaneyRaney NickelNickel

(Vedere anche riduzione doppi legami)(Vedere anche riduzione doppi legami)

Quale Quale èè il prodotto atteso dalla reazione dei prodotti il prodotto atteso dalla reazione dei prodotti seguenti e seguenti e RaneyRaney Nickel? Nickel?


Medium Medium EngineeringEngineering –– Variazione del mezzo di reazioneVariazione del mezzo di reazione

CoCo--solventisolventi: MeOH, : MeOH, tt--BuOHBuOH, acetone, , acetone, diossanodiossano, , MeCNMeCN, DMF, DMSO, DMF, DMSO

Aumento della selettivitàAumento della selettivitàRiduzione delle velocità di reazioneRiduzione delle velocità di reazioneDisattivazione dell’enzima ad elevate concentrazioni di Disattivazione dell’enzima ad elevate concentrazioni di coco--solventesolventeMeccanismo di azione del Meccanismo di azione del coco--solventesolvente non chiaritonon chiaritoDifficili previsione del risultati (trial & error)Difficili previsione del risultati (trial & error)

Aggiunte Aggiunte coco--solventesolvente: 10: 10--50%50%

Studi effettuati principalmente su PLEStudi effettuati principalmente su PLE

Ottimizzazione della selettivitàOttimizzazione della selettivitàOttimizzazione della idrolisi catalizzata da PLE Ottimizzazione della idrolisi catalizzata da PLE modificazione del mezzo di reazione uso di modificazione del mezzo di reazione uso di coco--solventesolvente



Effetto del Effetto del pHpH

Le reazioni catalizzate da Le reazioni catalizzate da idrolasiidrolasi vengono condotte vengono condotte generalmente in soluzioni acquose e a valori di generalmente in soluzioni acquose e a valori di pHpHottimale per l’enzima. ottimale per l’enzima. Variazioni di Variazioni di pHpH possono portare a variazioni possono portare a variazioni conformazionaliconformazionali dell’enzima, E’ la cosa più agevole, dell’enzima, E’ la cosa più agevole, specie per un chimico organico.specie per un chimico organico.Si può agire principalmente sulla struttura Si può agire principalmente sulla struttura tridimensionale del substrato e, in maniera minore, sugli tridimensionale del substrato e, in maniera minore, sugli effetti elettronicieffetti elettronici


Effetto della temperaturaEffetto della temperatura

Generalmente si crede che gli enzimi, analogamente agli altri Generalmente si crede che gli enzimi, analogamente agli altri catalizzatori esibiscono selettività più elevate a basse catalizzatori esibiscono selettività più elevate a basse temperature. Questa risulta vero solamente nel caso delle temperature. Questa risulta vero solamente nel caso delle idrolasiidrolasie delle e delle deidrogenasideidrogenasi..Solo recentemente è stato proposta una spiegazione razionale Solo recentemente è stato proposta una spiegazione razionale dell’effetto della temperatura sulla stereoselezione e si basa sdell’effetto della temperatura sulla stereoselezione e si basa sulla ulla ‘‘Temperatura di Temperatura di Racemizzazione’Racemizzazione’..

La Temperatura di La Temperatura di RacemizzazioneRacemizzazione (T(Tracrac) è la temperatura alla ) è la temperatura alla quale una reazione enzimatica procede senza alcuna quale una reazione enzimatica procede senza alcuna stereoselezione, il che equivale a dire che l’energia di attivazstereoselezione, il che equivale a dire che l’energia di attivazione ione dei due processi che portano a stereoselezioni opposte è uguale.dei due processi che portano a stereoselezioni opposte è uguale.

La Temperatura di La Temperatura di RacemizzazioneRacemizzazione (T(Tracrac) è la temperatura alla ) è la temperatura alla quale una reazione enzimatica procede senza alcuna quale una reazione enzimatica procede senza alcuna stereoselezione, il che equivale a dire che l’energia di attivazstereoselezione, il che equivale a dire che l’energia di attivazione ione dei due processi che portano a stereoselezioni opposte è uguale.dei due processi che portano a stereoselezioni opposte è uguale.

A temperature maggiori di TA temperature maggiori di Tracrac la reazione la reazione èè controllata principalmente dal controllata principalmente dal fattore fattore entropicoentropico ((∆∆∆∆SS‡‡) e un aumento di temperatura porter) e un aumento di temperatura porteràà ad un ad un aumento di stereoselezione.aumento di stereoselezione.

Passando da temperature inferiori a temperature maggiori della TPassando da temperature inferiori a temperature maggiori della Tracrac si si potrpotràà osservare unosservare un’’inversione della stereoselezione del processo. Questo inversione della stereoselezione del processo. Questo avviene nel caso di una avviene nel caso di una deidrogenasideidrogenasi di un organismo di un organismo termofilotermofilo((ThermoanaerobiumThermoanaerobium brockiibrockii))

La variazione di La variazione di ∆∆∆∆GG‡‡ con la temperatura può dipendere solo dal fattore per con la temperatura può dipendere solo dal fattore per cui:cui:

A temperature inferiori a TA temperature inferiori a Tracrac, il contributo , il contributo entropicoentropico èè basso e la basso e la selettivitselettivitàà dipende principalmente dalla dipende principalmente dalla ∆∆∆∆HH‡‡. Per cui aumentando la . Per cui aumentando la temperatura la selettivittemperatura la selettivitàà ((∆∆∆∆GG‡‡) diminuisce.) diminuisce.

Modelli di EnzimiModelli di Enzimi

Per evitare un approccio trial & error, sono stati sviluppati dePer evitare un approccio trial & error, sono stati sviluppati dei i modelli astratti che possono aiutare il ricercatore nella sceltamodelli astratti che possono aiutare il ricercatore nella scelta e e ottimizzazione del substrato.ottimizzazione del substrato.

MolecularMolecular ModellingModelling::

Sistemi di calcolo di Sistemi di calcolo di molecularmolecular modellingmodelling possono aiutare nella possono aiutare nella comprensione dei fattori che determinano la stereoselezione del comprensione dei fattori che determinano la stereoselezione del processo.processo.

La struttura ai raggi X di un enzima fornisce unLa struttura ai raggi X di un enzima fornisce un’’accurata accurata descrizione della struttura delldescrizione della struttura dell’’enzima anche se in condizioni enzima anche se in condizioni statiche. Però, poichstatiche. Però, poichéé il riconoscimento chirale emerge nella il riconoscimento chirale emerge nella formazione del complesso substratoformazione del complesso substrato--enzima, un processo dinamico,il enzima, un processo dinamico,il tentativo di predire la tentativo di predire la stereoselezonestereoselezone sulla base dei dati ottenuti sulla base dei dati ottenuti da strutture ai raggi x da strutture ai raggi x èè azzardato. azzardato.

Sono note le strutture di solo alcuni dei Sono note le strutture di solo alcuni dei biocatalizzatoribiocatalizzatori quali quali αα--chimotripsinachimotripsina, la , la subtilisinasubtilisina e alcune lipasi.e alcune lipasi.

Nota la struttura Nota la struttura tridimesionaletridimesionale di un enzima, si può cercare di di un enzima, si può cercare di predirrepredirre la selettivitla selettivitàà e il decorso e il decorso stereochimicostereochimico mediante:mediante:

Costruzione del complesso substratoCostruzione del complesso substrato--enzima negli stati di transizione enzima negli stati di transizione diastereoisomericidiastereoisomerici attraverso conti di dinamica molecolare. Il attraverso conti di dinamica molecolare. Il ∆∆∆∆GG‡‡

viene determinati via calcoli viene determinati via calcoli force force fieldfield fornendo risultati fornendo risultati semiquantitativi della attesa selettivitsemiquantitativi della attesa selettivitàà..

Se non si hanno informazione sullo stato di transizione, si può Se non si hanno informazione sullo stato di transizione, si può cercare cercare la migliore interazione del substrato nel sito attivo. Questo sila migliore interazione del substrato nel sito attivo. Questo si fa fa simulando il sistema dopo riscaldamento e raffreddando lentamentsimulando il sistema dopo riscaldamento e raffreddando lentamente. e. Si determinano cosSi determinano cosìì i due minimi di energia per i due complessi i due minimi di energia per i due complessi diastereoisomericidiastereoisomerici..

Se Se èè nota la sequenza degli nota la sequenza degli amminoammino acidi si può stimare attraverso acidi si può stimare attraverso calcoli la struttura tridimensionale in analogia con altri enzimcalcoli la struttura tridimensionale in analogia con altri enzimi con che i con che hanno un elevato numero di sequenze hanno un elevato numero di sequenze omologheomologhe (almeno 60%)(almeno 60%)

Modelli del SubstratoModelli del Substrato

Modello del Substrato per la PLEModello del Substrato per la PLE

Si costruiscono quando non si hanno informazioni sullSi costruiscono quando non si hanno informazioni sull’’enzimaenzima

Modelli del Sito AttivoModelli del Sito Attivo

Si fanno delle Si fanno delle mappaturemappature con differenti substrati. Picon differenti substrati. Piùù substrati si substrati si utilizzano piutilizzano piùù affidabile diventa il modelloaffidabile diventa il modello

Modello del Sito Attivo per la PLE Modello del Sito Attivo per la PLE (ottenuto con più di 100 substrati)(ottenuto con più di 100 substrati)

H = siti H = siti idrofobiciidrofobici, P= siti polari, P= siti polariIl gruppo Il gruppo estereoestereo si deve posizionare nelle vicinanze della si deve posizionare nelle vicinanze della serinaserina

LipasiLipasiLe lipasi sono enzimi che idrolizzano Le lipasi sono enzimi che idrolizzano trigliceriditrigliceridi nei corrispondenti nei corrispondenti acidi grassi e acidi grassi e glicerologlicerolo. . Giocano un importante ruolo nelle biotecnologie poichGiocano un importante ruolo nelle biotecnologie poichéé vengono vengono utilizzati in processi alimentari e per la preparazione di interutilizzati in processi alimentari e per la preparazione di intermedi medi chirali. Pichirali. Piùù del 35% delle del 35% delle biobio--trasformazionitrasformazioni vengono effettuate con vengono effettuate con lipasi e per questo le lipasi sono gli enzimi pilipasi e per questo le lipasi sono gli enzimi piùù studiati. studiati.

Sono state clonate piSono state clonate piùù di 30 lipasi e sono state risolte le strutture di di 30 lipasi e sono state risolte le strutture di 12 lipasi. 12 lipasi.

Il meccanismo con cui idrolizzano funzioni Il meccanismo con cui idrolizzano funzioni estereeesteree è differente da è differente da quello delle quello delle esterasiesterasi

LipasiLipasi

Differente interazione fisico chimica con il substrato: l’enzimaDifferente interazione fisico chimica con il substrato: l’enzima non mostra non mostra attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma monomericamonomerica..

LipasiLipasi

Lipasi e Lipasi e EsterasiEsterasi: cinetiche: cinetiche

Differente interazione fisico chimica con il substrato: l’enzimaDifferente interazione fisico chimica con il substrato: l’enzima non mostra non mostra attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma monomericamonomerica. . Quando la concentrazione aumenta tanto da formare una seconda faQuando la concentrazione aumenta tanto da formare una seconda fase se ((lipofilicalipofilica), si ottiene un brusco innalzamento della reattività. ), si ottiene un brusco innalzamento della reattività.

Attivazione all’interfaccia:Attivazione all’interfaccia:origina dal fatto che il origina dal fatto che il sistema diventa attivo solo sistema diventa attivo solo quanto la concentrazione quanto la concentrazione del substrato raggiunge la del substrato raggiunge la CMC (concentrazione CMC (concentrazione micellaremicellare critica)critica)

Attivazione all’interfaccia:Attivazione all’interfaccia: la spiegazione a livello molecolare del la spiegazione a livello molecolare del fenomeno è stato visto derivare da un fenomeno è stato visto derivare da un riarrangiamentoriarrangiamentodell’enzima: l’enzima in fase acquosa è inattivo poiché una sua dell’enzima: l’enzima in fase acquosa è inattivo poiché una sua parte copre il sito attivo [parte copre il sito attivo [EnzEnz].].

a contatto con la a contatto con la fasefase--bifasicabifasica un piccolo un piccolo peptidepeptide in in αα--elica si elica si allontana e allontana e scopre il sito attivo e la lipasi si scopre il sito attivo e la lipasi si riarrangiariarrangia nella forma nella forma attiva [attiva [EnzEnz]]‡‡..Per cui idrolisi catalizzare da lipasi devono essere condotte inPer cui idrolisi catalizzare da lipasi devono essere condotte inmezzi mezzi bifasicibifasici. . Il substrato può essere usato come tale o dissolto in solventi Il substrato può essere usato come tale o dissolto in solventi organici organici immiscibiliimmiscibili con l’Hcon l’H22O (esano, etere etilico, toluene).O (esano, etere etilico, toluene).

Fenomeni di trasferimento di massa (per esempio agitazione) Fenomeni di trasferimento di massa (per esempio agitazione) influenzano notevolmente la reattività del sistema (rese in influenzano notevolmente la reattività del sistema (rese in prodotto) prodotto)

Per determinare l’attività di una lipasi si utilizzano Per determinare l’attività di una lipasi si utilizzano triacilglicerolitriacilgliceroliquali la quali la trioleinatrioleina e e tributilinatributilina mentre per le mentre per le esterasiesterasi si utilizza il si utilizza il pp--nitroacetatonitroacetato

OO

O

COCOCO

R

RR

lipasiOHOH

OH+ 3 R-COOH

H2C O

ONO2

esterasiH2C OH

ONO2HO+

CoCo--solventisolventi miscibili con l’acqua attivano le miscibili con l’acqua attivano le esterasiesterasi mentre mentre coco--solventisolventi immiscibiliimmiscibili attivano le lipasiattivano le lipasi

Le lipasi sono sono state maggiormente utilizzate in risoluzioniLe lipasi sono sono state maggiormente utilizzate in risoluzionipiuttosto che con composti meso, e con derivati di alcoli chiralpiuttosto che con composti meso, e con derivati di alcoli chirali, i, vista la natura dei substrati naturali vista la natura dei substrati naturali

In generali le stereoselezioni sono più elevate quando lo In generali le stereoselezioni sono più elevate quando lo stereocentro è vicino alla funzione carbossilica e in presenza dstereocentro è vicino alla funzione carbossilica e in presenza di un i un protone, (analogamente alle protone, (analogamente alle esterasiesterasi))

Criteri generaliCriteri generali

Per substrati di tipo III la catena RPer substrati di tipo III la catena R33 deve essere deve essere sufficientemente lunga (3,4 atomi di C) per conferire sufficientemente lunga (3,4 atomi di C) per conferire sufficiente sufficiente lipofilicitàlipofilicità al substrato. D’altro canto al substrato. D’altro canto catene troppo lunghe portano a substrati con punto di catene troppo lunghe portano a substrati con punto di ebollizionetroppoebollizionetroppo alto e alla formazione di schiume e alto e alla formazione di schiume e emulsioni. emulsioni. nn--ButanoatiButanoati sono normalmente gli esteri sono normalmente gli esteri prescelti prescelti

Usualmente vengono idrolizzati preferibilmente Usualmente vengono idrolizzati preferibilmente substrati con configurazione R allo stereocentro substrati con configurazione R allo stereocentro alcolico. Molte alcolico. Molte proteasiproteasi ((αα--chimistripsinachimistripsina, , subtilisinasubtilisina) mostrano stereoselezioni opposte.) mostrano stereoselezioni opposte.Nelle strutture risolte ai raggi x si Nelle strutture risolte ai raggi x si èè osservato osservato che la disposizione della triade catalitica che la disposizione della triade catalitica èèinvertita nelle due classi di idrolasi. Questa invertita nelle due classi di idrolasi. Questa potrebbe essere lpotrebbe essere l’’origine dellorigine dell’’opposta opposta stereoselezione.stereoselezione.

Funghi e batteri producono un elevato numero di lipasi. Poiché sFunghi e batteri producono un elevato numero di lipasi. Poiché sono ono enzimi extracellulari possono venire prodotti in elevate quantitenzimi extracellulari possono venire prodotti in elevate quantità su à su larga scala. larga scala. Spesso vengono prodotti due isoenzimi (A e B), che sono strettamSpesso vengono prodotti due isoenzimi (A e B), che sono strettamente ente correlati. Solitamente mostrano la stesso senso di stereoseleziocorrelati. Solitamente mostrano la stesso senso di stereoselezione, ma ne, ma in alcuni casi si notano diversi valori di stereoselezione. in alcuni casi si notano diversi valori di stereoselezione. Estratti di lipasi usualmente contengono entrambe le forme. La Estratti di lipasi usualmente contengono entrambe le forme. La loro loro attività dipende dal quantitativo di enzima presente nella prepaattività dipende dal quantitativo di enzima presente nella preparazione razione e anche dal fornitore.e anche dal fornitore.

Criteri generaliCriteri generali

Per substrati di tipo IV il residuo RPer substrati di tipo IV il residuo R33 dell’alcol deve dell’alcol deve essere essere preferenzialmentepreferenzialmente una catena alifatica lunga una catena alifatica lunga ((nn--butanolobutanolo). Per questi substrati si è osservata una ). Per questi substrati si è osservata una preferenza nell’idrolisi di esteri S.preferenza nell’idrolisi di esteri S.

Requisiti Requisiti StericiSterici per le Lipasiper le Lipasi

Le lipasi più utilizzate possono essere classificate sulla base Le lipasi più utilizzate possono essere classificate sulla base delle delle caratteristiche del substrato naturalecaratteristiche del substrato naturale

Lipasi di Pancreas Suino (PPL)Lipasi di Pancreas Suino (PPL)

E’ la lipasi più economica e quindi più utilizzata. L’estratto E’ la lipasi più economica e quindi più utilizzata. L’estratto crudo crudo contiene una serie di altre contiene una serie di altre idrolasiidrolasi oltre alla PPL (la forma oltre alla PPL (la forma parzialmente purificata è commerciale ad un prezzo molto più altparzialmente purificata è commerciale ad un prezzo molto più alto).o).

L’estratto commerciale che contiene ca 5% di PPL viene chiamato L’estratto commerciale che contiene ca 5% di PPL viene chiamato pancreatina o steapsina. Contiene anche altre pancreatina o steapsina. Contiene anche altre idrolasiidrolasi ((αα--chimotripsinachimotripsina, , colesterolcolesterol esteraseesterase, , carbossipeptidasicarbossipeptidasi B, B, fosfolipasifosfolipasi) ) per cui la reattivitper cui la reattivitàà osservata può originare dalle diverse specie.osservata può originare dalle diverse specie.

PPL PPL èè particolarmente attiva nellparticolarmente attiva nell’’idrolisi di esteri primari mentre idrolisi di esteri primari mentre αα--chimotripsinachimotripsina e e colesterolcolesterol esteraseesterase sia con esteri di alcoli primari che sia con esteri di alcoli primari che secondari.secondari.

Idrolisi Idrolisi regioselettiveregioselettive con PPLcon PPLUno dei problemi principali nella chimica dei carboidrati riguarUno dei problemi principali nella chimica dei carboidrati riguarda la da la deprotezionedeprotezione selettiva di alcoli secondariselettiva di alcoli secondari

Idrolisi Idrolisi regioselettiveregioselettive possono essere ottenute insieme a risoluzioni cinetichepossono essere ottenute insieme a risoluzioni cinetiche

PPL e PPL e αα--chimotripsinachimotripsinamostrano stereoselezioni mostrano stereoselezioni opposteopposte

Idrolisi asimmetrica di derivati Idrolisi asimmetrica di derivati mesomeso con PPLcon PPLRisultati complementare con l’idrolisi catalizzata da PLERisultati complementare con l’idrolisi catalizzata da PLE

EeEe maggiori con modificazioni del substrato maggiori con modificazioni del substrato ––sintesi di sintesi di prostaglandineprostaglandine carbaciclichecarbacicliche –– trattamento della trombositrattamento della trombosi

Idrolisi asimmetrica di Idrolisi asimmetrica di gliceroligliceroli con PPLcon PPL1,31,3--propandioli propandioli achiraliachirali come substrato (fattori stereocome substrato (fattori stereo--elettronici)elettronici)

Migliori risultati con sistemi Migliori risultati con sistemi bifasicibifasici

Risoluzione di acetati Risoluzione di acetati biciclicibicicliciReattività delle diverse Reattività delle diverse idrolasiidrolasi contenute nel PPLcontenute nel PPL

L’elevata selettività è dovuta ad una nuova L’elevata selettività è dovuta ad una nuova idrolasiidrolasi isolata dal estratto di PPLisolata dal estratto di PPL

Idrolisi stereoselettiva di Idrolisi stereoselettiva di lattonilattoni con PPLcon PPLInfluenza del sostituente sulla selettivitàInfluenza del sostituente sulla selettività

Il Il lattonelattone e e idrossiidrossi acido si separano agevolmente a acido si separano agevolmente a pHpH basico. basico. Acidificando si recupera il secondo Acidificando si recupera il secondo enantiomeroenantiomero come come lattonelattone

Risoluzione dinamica di Risoluzione dinamica di ossazoloniossazoloni con PPLcon PPLRisoluzione di Risoluzione di NN--acilacil amminoammino acidiacidi

Risoluzione di Risoluzione di epossialcoliepossialcoli con PPLcon PPLComplementare all’epossidazione di SharplessComplementare all’epossidazione di Sharpless

Addizioni Addizioni elettrofileelettrofile

Elementi chiave:Elementi chiave: EE--N N è un reagente polareè un reagente polareEE++ è un è un elettrofiloelettrofiloNN-- è un nucleofiloè un nucleofilo

Interazione di un Interazione di un elettrofiloelettrofilo con il sistema con il sistema ΠΠ

Reazione dell’intermedio Reazione dell’intermedio elettrofiloelettrofilo con un nucleofilocon un nucleofilo

Reazioni del Reazioni del cicloesenecicloesene con reagenti polaricon reagenti polari

Addizioni di acidi Addizioni di acidi alogenidricialogenidrici HX (X= Cl, HX (X= Cl, BrBr, I), I)

Processo analogo alla SProcesso analogo alla SNN11

Quale è il prodotto atteso nella seguente reazione?Quale è il prodotto atteso nella seguente reazione?

Addizioni di acqua in ambiente acidoAddizioni di acqua in ambiente acido(con base coniugata non (con base coniugata non nucleofilanucleofila))

Una bassa concentrazione di un Una bassa concentrazione di un nucleofilo debole minimizza la nucleofilo debole minimizza la formazione del prodotto di formazione del prodotto di sostituzionesostituzione

CatalizzatoreCatalizzatore

Principio della reversibilità microscopicaPrincipio della reversibilità microscopica

Reazione di equilibrioReazione di equilibrio

Modificando le condizioni possiamo spostare l’equilibrio a Modificando le condizioni possiamo spostare l’equilibrio a destra o a sinistradestra o a sinistra

H

H

H

H

OH

H

H2SO4+ H2O

Proporre un meccanismo ragionevole per la seguente Proporre un meccanismo ragionevole per la seguente trasformazionetrasformazione

Addizione di Cloro e BromoAddizione di Cloro e Bromo

L’interazione del sistema L’interazione del sistema Π Π con la molecola di bromo crea un con la molecola di bromo crea un dipolo poiché c’è repulsione tra gli elettroni che circondano i dipolo poiché c’è repulsione tra gli elettroni che circondano i

nuclei di bromo ed il sistema nuclei di bromo ed il sistema Π Π

Addizione di Fluoro e IodioAddizione di Fluoro e Iodio

FF22 molto reattivo, rompe anche legami Cmolto reattivo, rompe anche legami C--H e CH e C--CC

II22 molto poco reattivo, l’equilibrio è spostato a molto poco reattivo, l’equilibrio è spostato a sinistra (legame Csinistra (legame C--I è debole)I è debole)

Reazione stereospecificaReazione stereospecifica

Reazione stereoselettivaReazione stereoselettiva

Si ottengono i due Si ottengono i due enantiomerienantiomeri 1:11:1Si ottiene un racemoSi ottiene un racemo

EsercizioEsercizio

Assumendo che un Assumendo che un alchenealchene lineare reagisca come lineare reagisca come il il cicloesenecicloesene, quale sarà il prodotto di reazione , quale sarà il prodotto di reazione

tra il tra il ciscis--22--butene e Clbutene e Cl22? ? E tra il E tra il transtrans--22--butene e Clbutene e Cl22??

Addizione di XAddizione di X22 in acquain acquaSintesi di Sintesi di AloidrineAloidrine

Proporre un meccanismo che renda conto della formazione dell’altro enantiomero, (1S,2S)-trans-2-

bromocicloesanolo.

Proporre un meccanismo per quetsa trasformazione: Quale è la stereochimica attesa del prodotto? E’ il prodotto chirale? E’ racemo?

Poiché lo iodio non addiziona ad un alchene per produrre un addotto stabile, può essere usato in un’addizione in cui è presente un nucleofilo diverso dallo ioduro. Questa caratteristica viene utilizzata nel processo di iodolattonizzazione, illustrato nell’equazione seguente

Reazione di addizione ad Reazione di addizione ad alchenialcheni acicliciaciclici

Con che meccanismo si forma il (2Con che meccanismo si forma il (2SS,3,3SS))--2,32,3--dibromobutano?dibromobutano?

Epossidazione stereospecifica di olefine con peracidiEpossidazione stereospecifica di olefine con peracidi

Magnesio Magnesio monoperossomonoperosso ftalatoftalato

Epossidazione stereoselettivaEpossidazione stereoselettiva

Con peracidi chirali: stereoselezioni molto basse (Con peracidi chirali: stereoselezioni molto basse (eeee < 10%)< 10%)

Epossidazione alcoli Epossidazione alcoli alliliciallilici

La presenza dell’ossidrile influenza la stereoselezione del procLa presenza dell’ossidrile influenza la stereoselezione del processoesso

Epossidazione alcoli Epossidazione alcoli alliliciallilici

Epossidazione alcoli Epossidazione alcoli allilicialliliciReagente di SharplessReagente di Sharpless

Meccanismo propostoMeccanismo proposto

Epossidazione degli alcoli Epossidazione degli alcoli alliliciallilici –– Reagente di SharplessReagente di SharplessReagente cataliticoReagente catalitico

Ti(IV)/(+)Ti(IV)/(+)--DET/DET/tt--BuOOHBuOOH, setacci molecolari, setacci molecolari

Epossidazione degli alcoli Epossidazione degli alcoli alliliciallilici –– Reagente di SharplessReagente di SharplessDoppia stereoselezioneDoppia stereoselezione

Epossidazione di Sharpless Epossidazione di Sharpless -- Risoluzione cineticaRisoluzione cinetica

Epossidazione di alcoli Epossidazione di alcoli alliliciallilici racemi con il reagente di racemi con il reagente di ShaplessShapless(Ti(IV)(Ti(IV)--DETDET--terzterz--ButilButil idroperossidoidroperossido))

s= relative rates= relative rate

Candida sp. LipasiCandida sp. LipasiSono disponibili diverse lipasi da lieviti tipo Candida.Sono disponibili diverse lipasi da lieviti tipo Candida.

I più utilizzati sono quelli di I più utilizzati sono quelli di Candida Candida lipoliticalipolitica, C. antartica e C. rugosa, C. antartica e C. rugosa..

Lipasi di Candida rugosaLipasi di Candida rugosaSono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari ciclicSono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari ciclicii

+ veloce+ veloce

Modello del Substrato per Lipasi di C. RugosaModello del Substrato per Lipasi di C. Rugosa

L’estratto di CRL occasionalmente manifesta scarsa selettività cL’estratto di CRL occasionalmente manifesta scarsa selettività con esteri on esteri αα--sostituiti. Questo è attribuibile alla presenza di due forme sostituiti. Questo è attribuibile alla presenza di due forme isomericheisomerichedell’enzima che operano con differenti selettività anche se hanndell’enzima che operano con differenti selettività anche se hanno la o la stessa stessa enantiopreferenzaenantiopreferenza

Forma A più selettiva e stabileForma A più selettiva e stabile

Modificazioni non covalenti di Lipasi di C. RugosaModificazioni non covalenti di Lipasi di C. Rugosa(trattamento con (trattamento con ii--PrOHPrOH))

Il semplice trattamento con Il semplice trattamento con ii--PrOHPrOH acquoso (50%) porta ad una lipasi acquoso (50%) porta ad una lipasi modificata che mostra un considerevole aumento di attività e modificata che mostra un considerevole aumento di attività e

stereoselezionestereoselezione

Lipasi di Candida antarticaLipasi di Candida antartica

Questi enzimi sono stati trovati in Antartico nel corso di uno sQuesti enzimi sono stati trovati in Antartico nel corso di uno screening creening effettuato per ottenere lipasi che operassero in condizioni estreffettuato per ottenere lipasi che operassero in condizioni estreme da eme da usare in formulazioni per la usare in formulazioni per la detergenzadetergenza

I due isoenzimi sono abbastanza diversi: I due isoenzimi sono abbastanza diversi:

isoenzima A: Caisoenzima A: Ca2+2+ dipendente, dipendente, termostabiletermostabile, molto stabile con , molto stabile con trigliceriditrigliceridiin modo non specifico, non molto utile per sistemi non naturali.in modo non specifico, non molto utile per sistemi non naturali.

isoenzima B: non è Caisoenzima B: non è Ca2+2+ dipendente, meno dipendente, meno termostabiletermostabile, attivo con un , attivo con un largo numero di substrati non naturali.largo numero di substrati non naturali.

Entranbi sono stati clonati e sovraespressi in Entranbi sono stati clonati e sovraespressi in Aspergillus Aspergillus oryzaeoryzae e sono e sono disponibili in larghe quantitàdisponibili in larghe quantità

Tipici substrati per lipasi di Candida antarticaTipici substrati per lipasi di Candida antartica

Ottimizzazione della selettività con lipasiOttimizzazione della selettività con lipasi

Possono essere utilizzate tutte le tecniche viste per le Possono essere utilizzate tutte le tecniche viste per le esterasiesterasi: : variazioni di temperatura, variazioni di temperatura, pHpH e variazione dei parametri cinetici delle e variazione dei parametri cinetici delle reazioni (riciclo del prodotto, risoluzione sequenziale). Sono reazioni (riciclo del prodotto, risoluzione sequenziale). Sono inoltre inoltre disponibili un elevato numero di lipasi. Il mezzo di reazione pudisponibili un elevato numero di lipasi. Il mezzo di reazione può inoltre ò inoltre essere modificato passando preferibilmente a sistemi essere modificato passando preferibilmente a sistemi bifasicibifasici piuttosto piuttosto che a sistemi omogenei.che a sistemi omogenei.

Modificazione del substratoModificazione del substrato

Per incrementare la stereoselezione del processo si possono utilPer incrementare la stereoselezione del processo si possono utilizzare izzare anche composti che abbiano anche composti che abbiano stereocentristereocentri sia alla funzione acida e alcolica.sia alla funzione acida e alcolica.Poiché l’enzima è sensibile a tutta la struttura del reagente quPoiché l’enzima è sensibile a tutta la struttura del reagente questa esta semplice modifica può incrementare sensibilmente la selettività.semplice modifica può incrementare sensibilmente la selettività.

Si generano dei Si generano dei diastereoisomeridiastereoisomeri

Il sistema selezione la miglior coppia alcol/acido (coppia matchIl sistema selezione la miglior coppia alcol/acido (coppia match).).

Inibizione Inibizione enantioselettivaenantioselettiva di lipasidi lipasi

Si tratta di una Si tratta di una inibizione non inibizione non competitiva, causata competitiva, causata dalla coordinazione dalla coordinazione dell’ammina a un dell’ammina a un diverso sito della diverso sito della lipasi che non lipasi che non idrolizza più uno idrolizza più uno diediediedie esteri esteri enantiomericienantiomerici..

Basi Basi chiralichirali (ammine o (ammine o amminoammino alcoli) possono giocare un ruolo di inibitore alcoli) possono giocare un ruolo di inibitore incrementando notevolmente la selettività.incrementando notevolmente la selettività.

Inibizione Inibizione enantioselettivaenantioselettiva di lipasi (di lipasi (PseudomonasPseudomonas sp. Lipasi)sp. Lipasi)

L’utilizzo dei due L’utilizzo dei due enantiomerienantiomeri porta ad effetti confrontabiliporta ad effetti confrontabili

Idrolisi di esteri Idrolisi di Esteri -Criteri generali · condizioni di reazione. Ampi screening...

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