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Reazioni di idrolisi

Circa 2/3 delle biotrasformazioni riportate su composti non-naturali negli ultimi 20 anni usano enzimi

idrolitici. Ci sono un certo numero di ragioni per questo:

Le idrolasi non richiedono cofattori;

Sono largamente ottenibili da fonti diverse;

Rimangono attive anche in mezzi non-acquosi dando luogo ha reazioni di formazioni di esteri, per

esempio, piuttosto che a reazioni di idrolisi

Mostrano frequentemente una rimarchevole chemo- regio- e stereoselettività anche accettando una

grande varietà di substrati:

Tra tutti i tipi di reazioni, che coinvolgono gli enzimi idrolitici, le idrolisi delle ammidi e degli esteri

sono quelle più utilizzate e sono anche le più facili. Queste reazioni coinvolgono proteasi, lipasi ed

esterasi.

Il meccanismo di una idrolisi enzimatica è molto simile a quello di una idrolisi chimica base catalizzata.

Un gruppo nucleofilico del sito attivo dell’enzima attacca il gruppo carbonilico dell’estere o dell’ammide.

Questo operatore chimico nucleofilo può essere il gruppo della serina, ad esempio l’esterasi estratta del

fegato del maiale (PLE), la subtilisina e le lipasi del pancreas suino (PPL) o da Mucor sp., il gruppo

carbossilico dell’acido aspartico (pepsina) o il tiolo della cisteina (papaina).

Il meccanismo proposto nello schema è quello della serina-idrolasi.

Due gruppi addizionali (acido aspartico e istidina) sistemati vicino alla serina, che è il nostro operatore

chimico formano la “triade catalitica”. Questa speciale configurazione aumenta l’acidità del gruppo

idrossilico e quindi la nucleofilicità che lo rende capace di attaccare il carbonile dell’estere (step I).

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Quindi il nucleofilo, normalmente l’acqua, può attaccare a sua volta l’acil-enzima intermedio rigenerando

l’enzima e rilasciando l’acido carbossilico.

Quando l’enzima opera in un mezzo dove la concentrazione di acqua è bassa (bassa attività di acqua)

qualsiasi altro nucleofilo può competere con l’acqua per dare varie biotrasformazioni.

L’attacco di un’altra molecola di alcol porta ad un altro estere (reazione di interesterificazione), l’entrata

di un’ammina produce un’ammide e quando l’ossigeno funge da nucleofilo si ha un peracido.

Le carbossil proteasi sono chiamate così perché hanno due residui essenziali di aspartato cataliticamente

essenziali. Erano anche chiamate proteasi acide perché sono attive ad un pH molto basso (2-3). Il

membro più noto di questa classe è la pepsina che è formata da un’unica catena polipeptidica con 327

amminoacidi. Il sito attivo è una regione estesa che può accomodare almeno 4 o 5 residui substrato.

L’enzima ha una preferenza per amminoacidi idrofobici su entrambi i lati da scindere. La pepsina

raramente catalizza l’idrolisi di esteri.

Le proteasi tioliche sono ampiamente distribuite in natura. La papaina, che è di origine vegetale, è un

polipeptide costituto da 212 amminoacidi. Il sito attivo è cisteina-25 aiutata da istidina-159.

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(cisteina-25) SH

istidina-159

NH

N

(cisteina-25) S

istidina-159

NH

N

H

R X

O

(cisteina-25) S

istidina-159

NH

N

O

R

HX

(cisteina-25) S

istidina-159

NH

N

O

RH2O

(cisteina-25) SH

istidina-159

NH

N

(cisteina-25) S

istidina-159

NH

N

H

RCOOH

Durante queste reazioni qualsiasi tipo di chiralità del substrato è riconosciuta dall’enzima e questo porta

ad una preferenza per una delle due direzioni possibili di attacco.

Il valore di questa discriminazione è detta selettività.

L’idrolasi può distinguere due enantiofacce di un substrato achirale come nel caso degli enol esteri.

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Se i substrati prochirali possiedono due gruppi identici (X) ma enantiotopici chiamati pro-R e pro-S sono

soggetti ad una idrolisi enzimatica, vi è una discriminazione nella scelta di X che viene trasformato in Y.

Numerosi diesteri meso sono trasformati in composti chirali usando questa discriminazione.

Dal momento che le reazioni idrolitiche si compiono in acqua, esse sono praticamente irreversibili. La

cinetica di queste reazioni ad un unico stadio (come quelle di un gruppo prochirale o di un composto

meso che vengono idrolizzati) dove i substrati sono trasformati nei due enantiomeri P e Q e regolata

dalle due costanti K1 e K2 rispettivamente.

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La selettività della reazione (�) è governata dal rapporto K1/K2 che è costante durante tutta la reazione.

Come conseguenza la purezza ottica (ee) non dipende dalla conversione. La selettività in questo caso

può essere cambiata solo cambiando l’ambiente di reazione (modificazione del substrato, scelta di un

altro enzima, addizione di un cosolvente organico, variazione delle temperatura e del pH).

D’altra parte per alcuni diesteri la reazione non si ferma ad un unico stadio ma può procedere all’idrolisi

dell’altra funzione dando un prodotto R achirale.

Facciamo un esempio di una reazione ad un singolo stadio e di una reazione a due stadi.

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In questa reazione l’eccesso enantiomerico è regolato dal rapporto K1/K2 ed è costante lungo tutto l’arco

della reazione.

La purezza ottica in questo caso dipende da tutte e quattro le costanti dal momento che il secondo stadio

idrolitico non può essere evitato. Dal momento che l’enzima mantiene sempre la preferenza per la stessa

chiralità, si può concludere che se S (substrato) è trasformato più velocemente in P , Q sarà idrolizzato

più velocemente di P nel diolo R. La selettività in questo caso sarà governata da K1 > K2 e da K4 > K3

La purezza ottica (ee) in questo caso sarà funzione della conversione. La prima parte della reazione sarà

governata dalla K1 ma quando il secondo stadio idrolitico inizierà la sua richiesta stereochimica

aumenterà la purezza del primo stadio.

Quando un substrato racemico viene sottoposto ad idrolisi enzimatica si ha la discriminazione tra i due

enantiomeri dei quali uno reagirà più velocemente dell’altro perché fitterà meglio con il sito attivo

dell’enzima.

Questo porterà ad una risoluzione cinetica del racemato. In ogni caso in queste reazioni la resa teorica

sarà al massimo al 50%.

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Idrolisi di ammidi L’idrolisi enzimatica di un legame ammidico è legata alla chimica degli amminoacidi e dei peptidi. La

produzione mondiale di amminoacidi enantiomericamente puri è superiore a 0.5 milioni di tonnellate di

materiale ed ha un mercato di 2 bilioni di dollari l’anno. I tre amminoacidi, che dominano questa area,

sono l’acido glutammico, la lisina e la metionina racemiche, e sono prodotti per fermentazione o per

via chimica.

Gli L-amminoacidi sono usati sempre di più come additivi o come prodotti di partenza per la sintesi di

farmaci, prodotti per l’agricoltura e dolcificanti artificiali. Recentemente alcuni amminoacidi che

possiedono la non-naturale configurazione D vengono usati come composti biologicamente attivi o come

componenti di tali prodotti. Per esempio la D-fenilglicina e il suo p-idrossi derivato vengono utilizzati

nella sintesi di antibiotici come l’ampicillina e l’amoxicillina.

Tra i principali metodi per la sintesi di amminoacidi enantiomericamente puri vi è la risoluzione della

miscela racemica utilizzando enzimi idrolitici come la proteasi e l’esterasi, che è certamente il più

comune, mentre le reazioni con liasi e deidrogenasi sono più complesse.

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Gli amminoacidi possono essere idrolizzati da proteasi ed esterasi quando il gruppo amminico è protetto

come gruppo acilico. In queste reazioni si possono utilizzare anche proteasi non specifiche come quelle

delle cellule di lievito di birra.

Le ammidi degli amminoacidi sono idrolizzate anche da amidasi (chiamate anche amminopeptidasi)

ottenute da vari microrganismi come Pseudomonas, Aspergillus o Rhodococcus.

Le amminoacilasi, isolate da Aspergillus e Penicillium catalizzano invece l’idrolisi di N-acil-

amminoacidi.

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Idrolisi di esteri

A differenza del grande numero di lipasi disponibili poche esterasi sono utilizzabili (come quelle estratte

dal fegato del maiale, PLE, e del cavallo, HPLE) e la conseguenza era che quando l’idrolisi di un estere

non procede selettivamente non è facile cambiare enzima. Per ovviare il problema spesso vengono

utilizzati i microrganismi come tali anche se il controllo di queste reazioni è più complicato.

Le strutture dei substrati che vengono idrolizzati da esterasi e proteasi si possono ricondurre alle seguenti

strutture generali.

Tra le esterasi quella estratta dal fegato del maiale (PLE) è la più usata data la sua grande versatilità che

probabilmente è dovuta al ruolo giocato da questo enzima nella dieta del maiale. Una delle peculiarità di

questo enzima sono le blande condizioni di utilizzo che permettono di evitare reazioni di decomposizione

anche in prodotti molto sensibili alle condizioni di idrolisi chimica.

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Anche cellule di alcuni microrganismi sono utilizzate per l’idrolisi di esteri, come Bacillus subtilis,

Brevibacterium ammoniagenes, Bacillus coagulans, Pichia miso e Rhizopus nigricans.

Sebbene il controllo di queste reazioni sia più difficile, la selettività è di norma migliore di quella degli

enzimi isolati. Un esempio è la risoluzione di alcoli secondari per idrolisi degli acetati con Bacillus sp.

Per evitare il problema del controllo della reazione si può utilizzare l’immobilizzazione di cellule

cresciute come l’esempio dato dal lievito di birra.

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L’importanza degli α-aril e degli α-arilossi derivati dell’acido propionico come antiifiammatori

(Naproxen) e prodotti chimici per l’agricoltura (Diclofop), in cui l’attività maggiore è in uno solo dei due

enantiomeri (S nel caso del Naproxen), ha portato alla loro risoluzione con carbossil esterasi estratta da

ceppi di Bacillus.

Un altro esempio di idrolisi di un agente antinfiammatorio è il Ketorolac che viene risolto per idrolisi del

suo estere con una proteasi ottenuta da Streptomyces griseus. Quando l’idrolisi viene condotta a pH > 9

vi è una spontanea racemizzazione del prodotto di partenza che porta alla risoluzione totale (risoluzione

cinetica dinamica).

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L’ottimizzazione della selettività di questi enzimi si può ottenere per modificazione del substrato. Questo

concetto è applicabile a tutte le reazioni enzimatiche infatti l’abilità degli enzimi a riconoscere la chiralità

di un dato substrato dipende fortemente dalla forma sterica del substrato stesso.

Questa variazione si può ottenere semplicemente variando i gruppi protettori.

La variazione del solvente con l’aggiunta di cosolventi organici miscibili con l’acqua come metanolo

acetone, diossano, dimetilformammide è un metodo usato frequentemente per migliorare la selettività

dell’enzima. Si utilizza il cosolvente da un minimo del 10% ad un massimo del 50%. A concentrazioni

superiore si rischia di inattivare l’enzima.

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L’ottimizzazione delle condizioni di reazione come l’aggiustamento del pH e la variazione di temperatura

danno risultati inferiori.

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Idrolisi di epossidi Gli epossidi enantiomericamente puri e i corrispondenti dioli ottenibili da loro sono intermedi importanti

in sintesi organica e quindi molti metodi chimici e biochimici sono stati studiati per ottenerli. Tra i

metodi biochimici viene riportata la diretta epossidazione degli alcheni con monoossigenasi isolate

(citocromo P 450) o monoossiganasi batteriche (da pseudomonadacee, mycobatteri, xanthobatteri,

corynebatteri e nocardia). Le rese sono basse ma gli eccessi enantiomerici alti. D’altra parte gli epossidi

prodotti hanno configurazione R e i batteri hanno un’alta specificità di substrato. L’ultimo approccio

biocatalitico è dato dalla risoluzione cinetica o tramite lipasi, ma esiste la necessità della presenza nella

molecola di una funzione esterea, acida o alcolica, o tramite diretta idrolisi con epossido idrolasi. O

R1 R2

Epossido idrolasi OHHO

R1 R2 Le epossido idrolasi sono isolate da una grande varietà di organismi. Si trovano in tutte le specie di

mammiferi e la più studiata è quella estratta dal fegato dei mammiferi (mEH). Fino a poco tempo fa si

riteneva che le epossido idrolasi derivanti da altre fonti fossero rare, soprattutto quelle prodotte da

microrganismi che avrebbero permesso una produzione su larga scala. Invece un buon numero di

epossido idrolasi sono state recentemente purificate da microrganismi, patate, insetti e semi di soia.

L’apertura degli anelli epossidici avviene con attacco del nucleofilo in posizione anti all’ossigeno

dell’anello con inversione di configurazione del carbonio attaccato.

L’idrolisi dei cis-epossidi perciò produce dioli la cui configurazione assoluta è treo in proiezione di

Fischer e anti nella struttura a zigzag. Così l’idrolisi dei trans-epossidi porta agli anti (eritro) dioli.

O

O

H2O

H2O

HO

HO

OH

OH

OH

OH

syn

C3H7

anti

HO

OH

C3H7

C3H7

OH

OH

C3H7

eritro

treo

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L’epossido idrolasi estratta dal fegato dei mammiferi (mEH), che di gran lunga la più studiata, è una

singola catena peptidica con un peso molecolare tra 48.5 e 49.5 kDa e il pH ottimale di lavoro è compreso

tra 8.9 e 9.4.

Sono proposti due meccanismi per questa idrolisi.

Il primo è un meccanismo generale base catalizzato dove un residuo di istidina prende un protone da una

molecola di acqua intrappolata nel sito attivo dell’enzima. Questo genera un anione idrossilico libero che

attacca una delle due estremità dell’epossido, che d’altra parte può essere attivato da una parziale

protonazione, per esempio, da un residuo di lisina.

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Il secondo meccanismo coinvolge l’attacco di un residuo carbossilato, nucleofilico, all’epossido che

viene ancora attivato per protonazione. Questo dà origine ad un α-idrossiestere intermedio, legato in

maniera covalente al sito attivo dell’enzima. L’intermedio è idrolizzato da un anione idrossido, ancora

generato dalla deprotonazione di una molecola d’acqua operata da un residuo di istidina. Il rilascio del

diolo rigenera il carbossilato nucleofilo. Questo sembra essere il meccanismo più probabile di azione di

questo enzima.

In aggiunta agli studi sul loro ruolo biologico e al loro meccanismo, si è focalizzata l’attenzione sul loro

possibile impiego come catalizzatori nella sintesi organica.

In generale mEH mostra una grande enantioselettività e si è visto che gli epossidi monosostituiti con

una larga parte idrofobica sono degli ottimi substrati, i cis- e gli 1,1-disostituiti sono ancora

ragionevolmente accettati, mentre i trans-disostituiti, i tri- e i tetra sostituiti non sono substrati accettabili.

Alta stereoselettività si ha anche nell’apertura di epossidi aril sostituiti.

O

Ph

O

Ph

mEH

mEH

O

PhHO

OH

PhR

HO

OH

PhRR

S

O

Ph

SR

Lo stirene ossido viene idrolizzato dando l’R diolo otticamente puro al 12% di conversione, mentre al

78% di conversione viene lasciato l’S-epossido enantiomericamente puro. Per quanto riguarda il metil

stirene ossido si ottengono entrambi i prodotti enantiomericamente puri.

Gli stessi R,R-dioli si ottengono con cis-epossidi alifatici. Ampi studi su questa idrolasi hanno

dimostrano che questa agisce secondo queste linee guida:

L’anello epossidico è sempre aperto per attacco anti rispetto all’ossigeno;

L’attacco avviene sul carbonio meno stericamente impedito: questo è normalmente un primario o

secondario, mai un terziario;

Se l’epossido è come nella figura l’attacco avviene inizialmente sul carbonio di sinistra;

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Il problema della reperibilità delle epossido idrolasi derivanti dal fegato dei mammiferi non si pone per

gli enzimi ottenuti da microrganismi. Solo recentemente sono stati isolati questi enzimi da batteri e funghi

e hanno dimostrato una buona selettività oltre alla possibilità di fare reazioni su larga scala non essendoci

limitazioni alla loro produzione.

Una delle prime idrolasi è stata estratta, dopo un ampio screening su varie specie batteriche, da

Rhodococcus sp. e si è dimostrata capace di idrolizzare una serie di epossidi monosostituiti e 1,1-

disostituiti.

OH3C

RRhodococcus sp

OCH3

RR

CH3

R

OH

OH

S

Substrato R = Conversione % Epossido ee% Diolo ee%

n-pentile 43 71 (R) 96 (S)

n-eptile 20 25 (R) 98 (S)

n-nonile 36 55 ( R) >99 (S)

All’aumentare della catena aumenta la selettività. Altre specie come Rhodococcus equi, Rhodococcus

ruber, Mycobacterium paraffinicum e Nocardia hanno alta selettività verso epossidi 1,1-disostituiti.

In tutti i casi esaminati, l’idrolisi procede con inversione del carbonio ossiranico non-sostituito portando a

ritenzione di configurazione nel diolo prodotto.

67% 56%33%44%

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Dai dati finora ottenuti (pochi data la recente sperimentazione) possiamo dire che l’alta enantioselettività

di questi enzimi si esplica solo su substrati con struttura ben definita e questo indica che il gruppo

metilico in C-2 gioca un ruolo importante nella selettività quando lo confrontiamo con gli epossidi

monosostituiti.

Molti funghi possiedono delle EH che hanno strereospecificità in alcuni casi diversa. Un esempio è

l’idrolisi di stirene ossido con Aspergillus niger e Beauveria sulfurescens.

O

O

O

S

R

OH

OH

R

OH

OH

R

A. niger

B. sulfurescens

Entrambe le specie danno lo stesso R-diolo ma lasciano l’epossido opposto. Questo indica che A. niger

idrolizza l’R-stirene ossido con ritenzione di stereochimica (attacco al C-2) e che B. sulfurescens

idrolizza l’S-stirene ossido con inversione di stereochimica (attacco al C-1 in posizione benzilica).

Altra spiegazione è l’attacco in posizione benzilica di un gruppo nucleofilico del sito attivo con la

formazione di un complesso enzima-substrato (prima inversione) che viene idrolizzato da una molecola

d’acqua (seconda inversione).

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O

R ritenzione

H2O

OH

OH

R

O

R

Enz X

OH

X

Enz

S

H2O

OH

OH

Rinversione inversione

A. niger

O

S inversione

H2O

OH

OH

R

B. sulfurescens

E’ del 1997 la scoperta di un lievito, Rhodotorula glutinis, in grado di idrolizzare con enantioselettività

eccezionalmente alta sia epossidi alchilici che arilici ed aliciclici.

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Lipasi I lipidi sono gli elementi chiave nella chimica della vita. La maggior parte degli organismi usa la chimica

supramolecolare inerente ai fosfolipidi per formare membrane. Molte piante ed animali immagazzinano

energia sotto forma di trigliceridi che non sono solubili in acqua. Per il riciclo di tali sostanze e altre

molecole biologiche, essi producono esterasi, enzimi che sono in grado di idrolizzare legami di esteri

solubili in acqua. Le esterasi, che possono idrolizzare trigliceridi all’interfaccia acqua/olio, sono chiamate

lipasi o più sistematicamente triacilglicerolo idrolasi e quelle che attaccano i fosfolipidi sono chiamate

fosfolipasi.

Entrambi i tipi di enzimi hanno ricevuto recentemente grande attenzione. Mentre le fosfolipasi sono

coinvolte in molti processi metabolici, quali il ripristino delle membrane, le lipasi hanno diverse

funzioni nella degradazione dei cibi e dei grassi. Esse trovano anche applicazioni nelle biotecnologie

(in particolare come additivi di detergenti) e come catalizzatori per la produzione di speciali prodotti

oleochimici e per la sintesi organica.

Questa larga potenzialità sintetica è dovuta al fatto che le lipasi, a differenza di molti altri enzimi,

accettano una grande varietà di substrati, sono abbastanza stabili in solventi organici non-acquosi e a

seconda del sistema solvente usato possono dare reazioni di idrolisi e di esterificazione.

OAc

OAc OAc

OAc

OAc OAc

HOAc

HOAc

H2O

OAc

OAc OH

OAc

OH OHHOAc

H2O

OH

OH OHHOAc

H2O

HOAc

In aggiunta le lipasi possono ospitare una grande varietà di substrati, oltre ai trigliceridi, come gli esteri

alifatici, aliciclici ed aromatici e reagiscono con alta enantio- e regioselettività.

Infine l’acil-enzima intermedio nelle reazioni catalizzate da lipasi non è solo formato da esteri

carbossilici, ma da molti altri substrati come tioesteri ed ammine attivate, che allargano

considerevolmente la potenzialità sintetica delle lipasi.

Pur essendo ubiquitarie e quindi estraibili da tessuti animali e vegetali, le lipasi che si trovano in

commercio sono derivate da microrganismi. Dall’avvento delle tecniche di ingegneria genetica un

crescente numero di lipasi sono preparate da ricombinanti batteri e lieviti.

Un esempio è la “lipasi detergente” ottenuta dal fungo Humicola lanuginosa che è commercialmente

prodotta in larga scala (parecchie tonnellate all’anno) per fermentazione di Aspergillus oryzae in cui è

stato clonato il gene che codifica per la lipasi di Humicola lanuginosa.

Nella tabella sono riportate importanti lipasi commerciali.

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Tabella. Importanti lipasi commerciali

ORIGINE SIGLA M (kDa) SPECIFICITA’ APPLICAZIONI

da mammiferi

lipasi pancreatica umana HPL 50 sn-1,3 lipasi gastrica umana HGL 50 sn-3 Sintesi organica, aiuto

digestivo lipasi pancreatica suina PPL 50 sn-1,3 da funghi

Candida rugosa CRL 60 non-specifica Sintesi organica Candida antarctica B CAL 60 sn-1,3 Sintesi organica Geotrichum candidum GCL 60 acidi grassi

insaturi Oleochimica

Humicola lanuginosa HLL 30 non-specifica Detergenti Rhizomucor miehei RML 30 sn-1,3 Produzione formaggi Aspergillus orizae AOL 30 Produzione formaggi Penicillium camamberti PEL 41 sn-1,3 Monogliceridi Rhizopus delemar RDL 41 sn-1,3 Oleochimica Rhizopus oryzae ROL 41 sn-1,3 Oleochimica Rhizopus arrhizus RAL 41 sn-1,3 Oleochimica da batteri

Pseudomonas glumae PGL 33 non-specifica Enzima detergente, sintesi organica

Burkholderia cepacia BCL 33 non-specifica Sintesi organica Pseudomonas pseudoalcaligenes PPL 33 sn-1,3 Detergenti Pseudomonas mendocina PML 33 sn-1,3 Detergenti Chromobacterium viscosum CVL 33 sn-1,3 Sintesi organica Bacillus thermocatenulatus BTL-2 43 sn-1,3 Fusarium solani FSl 22 Detergenti

Sebbene le lipasi idrolizzino e formino il legame estereo come le esterasi e le proteasi, hanno un

meccanismo differente.

La differenza più importante sta nella interazione con il substrato. Mentre le esterasi e le proteasi seguono

la normale legge di Michaelis-Menten in cui l’attività dell’enzima dipende dalla concentrazione del

substrato, le lipasi invece non mostrano quasi attività fino a che sono disciolte nel mezzo, mentre quando

la concentrazione del substrato cresce fino al limite della sua solubilità, vi è un repentino aumento di

attività.

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La prima struttura tridimensionale di una lipasi (raggi X nel 1990) suggerisce che l’attivazione

interfacciale sia dovuta alla presenza di un gancio peptidico amfifilico che copre il sito attico dell’enzima

in soluzione, proprio come un coperchio. Dalla struttura di un cocristallo tra una lipasi e il substrato, vi è

un’evidenza che quando avviene il contatto con l’interfaccia lipide/acqua, questo coperchio si riarrangia

e rende il sito attivo accessibile al substrato.

Le idrolisi catalizzate da lipasi quindi avvengono in un sistema bifasico. E’ sufficiente impiegare il

substrato ad alte concentrazioni in quanto esso stesso costituisce la fase organica o un solvente organico

immiscibile con l’acqua per aver l’attivazione dell’enzima.

E’ da tenere presente che non tutte le lipasi mostrano il fenomeno dell’attivazione interfacciale e quindi

non è questo il criterio per classificarle ma rimane quello della loro capacità di idrolisi degli acil gliceroli

a lunga catena.

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Comunque tutte le lipasi finora studiate idrolizzano i legami esterei attraverso una “triade catalitica”

composta da una serina nucleofilica attivata da un legame idrogeno con l’istidina e aspartato o

glutammato.

Mentre molte lipasi hanno grandi somiglianze, piccole variazioni nell’architettura del sito di legame

dell’enzima hanno grandi ripercussioni sulle proprietà catalitiche, la temperatura e la stabilità della lipasi

in un solvente.

Applicazioni in oleochimica Mentre la maggior parte dei 60 milioni di tonnellate di grassi e oli prodotti ogni anno sono direttamente

usati nei cibi, più di 5 milioni di tonnellate sono una fonte chimica rinnovabile per applicazioni non-

alimentari (oleochimica) come saponi, trigliceridi transesterificati e monogliceridi.

a) Saponi

La maggior applicazione dei trigliceridi è nella produzione dei saponi. Il processo chimico fornisce rese

quantitative (2 milioni di tonn/anno) in pochi minuti a 100°C partendo da qualsiasi tipo di grasso.

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La produzione di sapone con lipasi (34 h a 30°C) oggi è effettuato soltanto da una ditta giapponese

(Miyoshi Yushi) che produce saponi usando lipasi da Candida rugosa.

A favore dell’utilizzo di lipasi sta il minor costo d’impianto, il miglior colore del sapone e la produzione

di glicerolo acquoso al 20% invece del diluitissimo glicerolo che si ottiene con il processo chimico

mediante vapore.

b) Trigliceridi transesterificati

Molte lipasi mostrano una specificità sn-1,3 e possono quindi essere usate in reazione di

transesterificazione delle posizioni 1 e 3 di un trigliceride naturale: bisogna però sopprimere la tendenza

degli acili a migrare dalla posizione 2 alle posizioni 1 e 3.

Tre tipi di trigliceridi modificati hanno oggi importanza commerciale:

1. Grassi con alta spalmabilità

2. Equivalenti del burro di cacao

3. Trigliceridi altamente digeribili

Grassi con alta spalmabilità

Il punto di fusione di un grasso è modulato sul numero di doppi legami presenti nelle catene alchiliche.

Nella produzione di margarine dopo il processo di idrogenazione , bisogna modificare la quantità di acidi

grassi saturi per renderle morbide e questo viene fatto con lipasi sn-1,3 e reazioni di transesterificazione.

Equivalenti del burro di cacao

Nel 1995 sono state importate dai paesi tropicali 100.000 tonnellate di burro di cacao. Il burro di cacao ha

un grande uso alimentare perché fonde alla temperatura del corpo umano e quindi ha un gradevole sapore

in bocca. I trigliceridi predominanti nel burro di cacao sono glicerolo con in posizione sn-2 acido oleico e

in posizione sn-1 e sn-3 acido stearico e palmitico (SOS o SOP).

Questi equivalenti del burro di cacao vengono preparati chimicamente o con lipasi attraverso reazioni di

transesterificazione di trigliceridi naturali come la frazione intermedia di olio di palma (POP) o di olio di

girasole con alto contenuto di oleico (OOO) con la tristearina (SSS).

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Poiché i gruppi idrossilici primari sono più reattivi del secondario, i trigliceridi del tipo SOP e SOS si

formano in maniera predominante. L’Unichema produce parecchie tonnellate di “grasso di cioccolata”

da olio di girasole OOO con acido stearico usando lipasi da Rhizomucor miehei.

Trigliceridi altamente digeribili

L’assorbimento dei trigliceridi nell’intestino tenue dipende dalla struttura del trigliceride. I trigliceridi

che contengono acido palmitico in posizione sn-2, come nel latte umano, sono assorbiit molto bene.

L’Unichema produce OPO, che viene utilizzato nella dieta dei neonati prematuri, da tripalmitina (PPP)

con acido oleico utilizzando lipasi da Rhizomucor miehei.

c) Monogliceridi

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Nel 1993 sono state prodotte 120.000 tonnellate di mono- e digliceridi via glicerolisi di trigliceridi. I

monogliceridi sono dei blandi emulsionanti e sono permessi come additivi alimentari.

L’applicazione industriale include l’emulsificazione dei cibi, dei cosmetici e dei farmaci. Dal punto di

vista economico questo processo enzimatico non è ancora conveniente perché comunque si ottengono

miscele di mono- e digliceridi.

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Applicazioni come detergenti Dopo il grande successo commerciale delle proteasi come additivi di detergenti, sono state studiate le le

lipasi per lo stesso scopo. Si sperava che le lipasi competessero con i tensioattivi chimici in modo da

poter cambiare la formulazione dei detersivi in modo da abbassare le temperature di lavaggio e diminuire

l’impatto ambientale. Un liquido di lavaggio standard contiene tensioattivi anionici e non-ionici, ossidanti

e agenti complessanti a pH di circa 10 e a temperature di 50°C che sono un ambiente ostile per gli

enzimi. D’altra parte l’utilizzo di lipasi portava ad un netto miglioramento delle prestazioni di lavaggio

soprattutto quando sui tessuti erano presenti macchie di rossetto.

La prima compagnia a commercializzare lipasi come detergenti è stata la Novo-Nordisk che ha prodotto

la LIPOLASE, una lipasi fungina ricombinante da Humicola lanuginosa espressa in Aspergillus oryzae.

Oggi le lipasi sono usate in molte formulazioni di detergenti. I maggiori prodotti commerciali sono nella

tabella.

Tabella. Lipasi usate in formulazioni di detergenti

Nome corrente Compagnia Origine pH ottimale T ottimale

Lipolase Novo-

Nordisk

Humicola lanuginosa, clonata ed espressa

in Aspergillus oryzae

10 40°C

Lipomax Gist-

Brocades

Pseudomonas pseudoalcaligenes,

riclonata ed espressa nello stesso

organismo

11 45°C

Lumafast Genencor Pseudomonas mendocina, clonata ed

espressa in Bacillus

10.5 40°C

28

Applicazioni nell’industria alimentare Il caglio, isolato dallo stomaco dei ruminanti, è una miscela di enzimi tradizionalmente usata per la

preparazione di formaggio. Il componente attivo del caglio è la chimosina, un aspartato proteasi

coinvolta nella coagulazione del latte attraverso l’idrolisi della caseina: inoltre le lipasi ed le esterasi

contenute del caglio contribuiscono alla maturazione del formaggio.

Quando in America sono state proibite le importazioni di cagli dall’Europa, proteasi e lipasi sono state

usate largamente nella produzione di formaggi. La specificità delle lipasi per lunghezze di catena diversa,

hanno permesso di innalzare il profumo dei formaggi, di rendere più veloce la maturazione o preparare

“formaggi modificati enzimaticamente” (EMC).

Nella tabella vengono indicati alcuni esempi di lipasi utilizzate nella produzione di formaggi o

nell’accelerazione della loro maturazione.

Tabella. Esempi di lipasi utilizzate nella produzione di formaggi

FORMAGGIO LIPASI

Romano, domiati, feta Lipasi pregastriche da agnello o capra, Mucor

miehei

Mozzarella, parmigiano, provolone Lipasi pregastriche da agnello o capra

Fontina, ras, romi Mucor miehei

Cheddar, manchego, blue Aspergillus oryzae, Aspergillus niger

A seconda della specificità di lunghezza di catena delle lipasi, c’è la predominante liberazione di acidi

grassi a corta catena (C4-C6) che porta ad un odore intenso, o di acidi grassi a media o lunga catena

(>C12) che portano ad un sapore di sapone che vengono rapidamente metabolizzati dai consorzi

microbici che si trovano nei formaggi ad latri odori e sapori.

29

Applicazioni come biocatalizzatori in sintesi organica Se vengono considerate solo le specifiche e limitate funzioni nel metabolismo, le lipasi dovrebbero avere

uno scarso interesse in chimica organica mentre si è finora visto che è uno degli enzimi più versatili per

poche e semplici ragioni:

A causa del grande dominio enzimatico richiesto per legare il gruppo acilico e il comportamento

non-definito delle catene aciliche, le lipasi possono ospitare una grande varietà di substrati

sintetici mantenendo ancora enantio- e regioselettività.

Le lipasi agiscono all’interfaccia acqua/lipide, che esibisce un’alta energia interfacciale. Per resistere

all’effetto denaturante dell’interfaccia, le lipasi hanno strutture stabili che possono sopravvivere

anche in presenza di un solvente organico.

L’energia libera dell’idrolisi degli acidi grassi è vicino a 0 kJ/mol. Come risultato, gli equilibri

termodinamici sono governati dalla concentrazione dei reagenti, e l’idrolisi di esteri in acqua

catalizzate da lipasi possono essere reversibili. In mezzi non-acquosi si possono avere

l’esterificazione e la transesterificazione.

L’acil-lipasi formato nel primo stadio della reazione enzimatica può essere formalmente considerato

un agente acilante. La grande specificità di substrato di questa classe di enzimi porta all’acilazione di

nucleofili diversi dai gruppi idrossilici, per esempio idroperossidi, ammine e tioli.

Il risultato è l’utilizzo delle lipasi in una grande varietà di reazioni. Un terzo circa delle biotrasformazioni

sono operate da lipasi.

Quando si usano composti polifunzionali, isomeri o substrati racemici o prostereogenici, le lipasi di

solito mostrano regio- e stereoselettività.

Così PPL che idrolizza i trigliceridi da la esterificazione regioselettiva di dioli e RML catalizza la

OH

OH

AcOEt

PPLOAc

OH

transesterificazione enantioselettiva in alte rese di biciclo eptenolo acetilato.

30

H

H

AcO

HH

H

AcO

PhCOOMe

RMLHH

H

AcO

HH

H

PhCOO

H

Il solo grave inconveniente delle lipasi è la loro ristretta specificità verso il gruppo acilico degli esteri.

La maggior parte delle lipasi accettano gruppi alifatici lineari molto meglio che grossi gruppi aromatici.

Il fatto che le lipasi siano capaci di idrolizzare esteri diversi dai triacilgliceroli le rende molto utili

soprattutto nella risoluzione dei racemati.

Dal momento che i substrati naturali sono esteri di un alcol chirale, il glicerolo, con un acido achirale, ci

si aspetta che le lipasi siano più utili nell’idrolisi di esteri di alcoli chirali (struttura tipo I) più che di acidi

chirali (struttura tipo II).

Assumendo che la sequenza sia largo > piccolo l’enantiomero del tipo I preferito dalla lipasi avrà

configurazione R al centro alcolico ed é esattamente l’opposto di quello preferito dalla maggior parte

delle proteasi ed esterasi.

La richiesta sterica delle varie lipasi presenti in commercio è abbastanza differente. Mentre le lipasi

estratte da Aspergillus sono in grado di idrolizzare anche substrati piuttosto voluminosi e quindi

dimostrano scarsa selettività per quelli di dimensioni ridotte, le lipasi da Candida sp. sono meno

31

vincolate. In questo ambito invece le lipasi estratte da Pseudomonas e da Mucor mostrano una elevata

selettività per substrati di dimensioni ridotte non accettano substrati voluminosi.

In un caso di racemato, le lipasi vengono sfruttate per ottenere la risoluzione cinetica della miscela fino

alla resa teorica del 50%. Inoltre le reazioni catalizzate da lipasi sono di solito reversibili e bisogna tenere

presente che la reazione inversa porta a racemizzazione. Così se l’acilazione di un alcol racemico

fornisce prevalentemente l’S-alcol e l’R-estere, la reazione inversa dell’alcol achirale ottenuto R3OH con

l’R estere porterà alla formazione dell’R-alcol.

R1 OHR2 OR3

O

R,S

R1 OH R3 OHR2 OR1

O

S R Questo porta ad una diminuzione di purezza enantiomerica. Si può ovviare a questo eliminando l’acqua

durante l’esterificazione o utilizzando un grande eccesso (solvente) di acil donatore.

Il metodo migliore finora usato è quello di utilizzare enolesteri ( di solito vinil o isopropenil). L’alcol

primario che si forma isomerizza a composto carbonilico che non può partecipare alla reazione inversa.

R1

OH

R1

OHO

O R2

lipasiR1

O

R1

OH

O

R2

O

racemo

32

Le lipasi sono anche utilizzate nelle acilazioni regioselettive di gruppi alcolici come quelli del

cloramfenicolo e sobrerolo.

O2N

OH

OH

NHCHCl2

cloramfenicolo

HO

OH

sobrerolo

Vengono anche risolti gli stereoisomeri E/Z di un alcol allilico: nella miscela geraniolo (E) e nerolo (Z),

il geraniolo viene acetilato più velocemente del nerolo in un rapporto 4:1.

OH

OH

(E) geraniolo (Z) nerolo