I virus• Un virus e’ una nucleoproteina che si moltiplica e che ha l’abilita’ di causare malattie

• Il numero totale di virus conosciuto a tutt’oggi raggiunge le 2000 “specie”

• Un virus puo’ infettare una o dozzine di differenti specie di piante e ogni pianta puo’

essere attaccata da differenti virus

• Benche’ i virus possano assumere diverse forme sono sostanzialmente a forma

bastoncellare, poliedrica o varianti di queste forme

• I virus non si dividono e non producono nessun tipo di strutture specializzate di

riproduzione (spore..)

• I virus causano una malattia attraverso la semplice occupazione degli spazi, l’uso di

sostanze cellulari durante la riproduzione e alterando I processi cellulari

• I virus vegetali sono molto diversi da tutti gli altri patogeni delle piante non solo in

taglia e forma ma anche nella semplicita’ della loro costituzione chimica, della struttura, dei

metodi di infezione, moltiplicazione, traslocazione all’interno dell’ospite, disseminazione e

sintomi prodotti

• E’ molto difficile diagnosticare la presenza di virus, molto spesso si formano però delle

vere e proprie inclusioni cellulari che consistono di particelle virali visibili al microscopio

ottico

Detection dei virus vegetali

• I metodi per rilevare i virus vegetali coinvolgono principalmente la trasmissione dei virus da una pianta malata a una sana per innesto o grattando le foglie di piante sane con il fluido cellulare di piante malate

• Il metodo migliore per rilevare un virus e’ dato dalla purificazione, la microscopia elettronica e la sierologia

• Inoltre negli ultimi 5-10 anni e’ aumentato l’uso di sonde a RNA o DNA per amplificare il genoma virale

Morfologia dei virus vegetali• I virus vegetali possono essere

di diverse forme e taglie• Piu’ della metà sono allungati

(bastoncellari, A-B; A2) e altrettanti sono sferici (isometrici o poliedrici, D) con I rimanenti che sono cilindrici e bacilliformi (C)

• Alcuni virus sono bastoncelli rigidi di circa 15-300 nm

• In sezione trasversale i virus bastoncellari appaiono come tubi vuoti in cui le proteine formano le pareti e gli acidi nucleici sono intercalati sempre spiralmente tra 2 subunita’ proteiche

Composizione e struttura• Ogni virus consiste al minimo di un acido nucleico e un tipo di proteina• Alcuni virus consistono di più tipi di acidi nucleici e di proteine e altri

hanno enzimi o lipidi• Gli acidi nucleici costituiscono dal 5 al 40 % del virus mentre le

proteine fanno il resto• Il genoma virale e’ abbastanza piccolo (1-3x106 Da) se comparato a

quello dei batteri (1.5x109 Da)• La parte proteica e’ composta di subunità ripetute, la cui composizione

aminoacidica varia da virus a virus e anche all’interno dello stesso tipo virale

• La subunita’ proteica di TMV consiste di 158 AA in una sequenza costante con una massa di 17.6 KDa

• Ogni particella di TMV consiste di circa 130 giri d’elica di subunita’ proteiche, tra cui e’ “impacchettato” il genoma

• La maggior parte dei virus vegetali e’ a RNA ma ci sono esempi anche di virus a DNA (su 1000; 800 a ssRNA, dsRNA, 110 ssDNA e 80 dsDNA)

• Esistono poi dei virus (satellite) che non sono in grado di replicarsi da soli nell’ospite ma hanno bisogno di un virus helper, di cui pero’ spesso ne causano il rallentamento della replicazione

• Sono stati trovati anche degli RNA satellite all’interno di virioni di virus multicomponenti

Genoma virale

• Il capside proteico virale non e’ solo un contenitore di acidi nucleici ma gioca un ruolo importante nel determinare la trasmissibilita’ virale, infatti la sua presenza aumenta l’infettivita’ del virus

• Alcuni virus hanno nel loro genoma una trascrittasi che serve per la loro moltiplicazione e infezione

• La capacita’ del RNA virale di riprodursi indica che nell’RNA stesso ci sono tutti i determinanti genetici del virus

• In alcuni virus la quantita’ di acidi nucleici a disposizione e’ aumentata dal fatto che la sequenza codificante di alcuni geni e’ sovrapposta con quella di altri

• Il numero di basi usati per la sintesi delle subunita’ proteiche del capside e’ solo una piccola parte del genoma virale (158 bp contro 2130 in TMV)

• La parte rimanente di genoma serve per codificare RNA polimerasi, altre proteine strutturali, di movimento, di interazione con il vettore, nucleasi e altre per produrre i corpi di inclusione

Infezione e biosintesi virale• La sintesi delle

proteine virali avviene grazie al ruolo di mRNA svolto dall’RNA virale

• Il virus utilizza gli AA, i ribosomi e il tRNA dell’ospite

• L’RNA replicato e le proteine prodotte sono ad uso esclusivo del virus

• Non appena si producono le proteine del capside queste si associano con l’acido nucleico e si forma un virus completo

• I primi virioni intatti compaiono nelle cellule 10 ore dopo l’infezione

Sintomi locali

• Tutti le malattie virali sembrano causare nanismo o appassimento della pianta intera e la riduzione della produttivita’

• In molte piante inoculate artificialmente con alcuni virus si ha la comparsa di piccole lesioni clorotiche o necrotiche soltanto nei punti di inoculo (lesioni locali)

• Molti virus infettano i loro ospiti senza causare lo sviluppo di alcun sintomo visibile

• Tali virus sono chiamati latenti e gli ospiti come portatori asintomatici

• In altri casi piante che sviluppano i sintomi dell’infezione possono, se infettate da certi tipi d virus, essere temporaneamente senza sintomi in certe condizioni ambientali (alte o basse T) (sintomi mascherati)

Traslocazione dei virus

• Quando un virus infetta una pianta si muove da una cellula all’altra e si moltiplica in tutte le cellule

• I virus si muovono attraverso i plasmodesmi moltiplicandosi nelle cellule parenchimatiche

• Nelle cellule fogliari i virus si muovono di circa 1 mm (8-10 cellule) al giorno

• Molti virus comunque richiedono 2-5 giorni per uscire da una foglia infetta

• I virus raggiungono il floema e da qui vengono rapidamente trasportati verso i meristemi apicali

• Nel floema i virus infettano la pianta a livello sistemico rientrando nelle cellule parenchimatiche adiacenti ai tubi cribrosi

• I virus a mosaico infettano tutti i tessuti della pianta e ogni cellula vegetale infettata puo’ contenere anche 10 milioni di particelle virali

Le proteine di movimento• I virus si propagano attraverso i plasmodesmi che sono una sorta di canalicoli

di circa 50 nm di diametro. Le loro pareti sono “tappezzate” dalla membrana plasmatica, mentre la cavita’ centrale è occupata da una duplice membrana di RE cui e’ addossata una serie di proteine.

• Il lume del plasmodesma e’ ridotto a 4-5 canalicoli di 2-3 nm di diametro, che consentono il passaggio di molecole di raggio non superiore a 1 nm e peso molecolare di 1 KDa e quindi hanno un limite di esclusione ben superiore al diametro delle particellle virali (3-90 nm) o dei loro acidi nucleici liberi (3-5 nm)

• Esistono pero’ plasmodesmi con limiti di esclusione diversi. Ad esempio nei tricomi il diametro e’ di 4nm (7KDa) e altri che collegano le cellule compagne con i tubi cricrosi di 6nm (25KDa)

• Per avere ragione di tali barriere dimensionali, insuperabili nel caso delle cellule parenchimatiche, I fitovirus hanno sviluppato strategie di trasporto i cui agenti sono le cosiddette proteine di trasporto o di movimento

• Queste proteine non strutturali (non sono parte integrante delle particelle virali) sono codificate dal genoma del 75% dei taxa virali noti e regolano il passaggio intercellulare delle unita’ infettive interagendo con i plasmodesmi

• Nelle piante esistono proteine endogene non virali che regolano il traffico macromolecolare intercellulare agendo proprio sui plasmodesmi

• E’ possibile che queste proteine costituiscano i fattori dell’ospite di cui e’ stata ipotizzata la collaborazione con le proteine virali di movimento

Le proteine di movimento

• Le proteine di trasporto note sono rapportabili a 4 principali raggruppamenti– Proteine della superfamiglia 30K– Proteine del triplo blocco– Proteine ricche in prolina– Altri tipi di proteine

La superfamiglia 30K• E’ costituita da proteine di dimensioni variabili tra 22 e 50 Kd e

contengono un motivo conservato di 30 AA• Sono state identificate nei seguenti taxa

– ssRNA (+) virus: tobamovirus, tobravirusAlfamovirus, Comovirus e molti altri– ssRNA (-) virus: tospovirus– dsDNA virus: Caulimovirus, Badnavirus– ssDNA virus: geninivirus

• La proteina meglio studiata e’ la 30K di TMV che svolge le seguenti funzioni:

– Aumenta la permeabilita’ dei plasmodesmi portando il limite di esclusione da 1,5 fino a 9 nm

– Favorisce il dispiegamento dell’RNA virale linearizzandone la molecola– Si lega all’RNA virale formando complessi di 3-5 nm di diametro – Accompagna l’RNA virale attraversando i plasmodesmi come parte del

complesso di trasporto– Protegge l’RNA virale dall’attivita’ nucleolitica delle cellule dell’ospite– Indica la direzione del trasporto attraverso segnali di localizzazione

plasmodesmica • Le proteine 30K-simili sono state individuate nel canale dei

plasmodesmi, nella parete cellulare in prossimita’ dei plasmodesmi delle cellule infette, in associazione col reticolo endoplasmatico e col citoscheletro

Sintomi sistemici• Le piante possono mostrare

sintomi acuti e severi subito dopo l’infezione che possono portare a morte di rami giovani o dell’intera pianta

• Se l’ospite sopravvive all’infezione puo’ mostrare sintomi cronici che possono essere recuperati

• In altri casi questo stato cronico porta a deperimento la pianta intera

• I tipi di sintomi piu’ comunemente registrati nelle infezioni virali sono I mosaici o le macchie anulari (mosaics and ring spots)

• I mosaici sono caratterizzati da aree verde-pallido, gialle o bianche intervallate con aree normali su foglie, fiori e frutti

• I ring spots sono caratterizzati dalla comparsa di anelli clorotici o necrotici sulle foglie e qualche volta su fusto e frutti

Fisiologia delle piante infettate da virus

• I virus vegetali non contengono nessun enzima, tossine o altre sostanze patogeniche ma ciononostante riescono a indurre molti sintomi diversi nell’ospite

• La semplice presenza del virus stesso, anche in grandi quantita’, non basta a spiegarli

• Le malattie virali non sono dovute principalmente ad una deplezione dei nutrienti che sono stati deviati verso la sintesi del virus stesso, ma piuttosto a effetti indiretti che il virus ha sul metabolismo dell’ospite

• Questi efetti sono indotti probabilmente dalla sintesi, indotta da virus, di nuove proteine alcune delle quali sono biologicamente attive (enzimi) e possono interferire con il normale metabolismo dell’ospite

• I virus generalmente causano un decremento del tasso fotosintetico attraverso un’alterazione della quantita’ di clorofilla, dell’efficienza della clorofilla stessa e dell’area fogliare

• I virus usualmente causano un decremento delle sostanze ormonali attraverso l’induzione della produzione di sostanze inibenti la crescita

• Un decremento nell’azoto solubile durante la sintesi rapida di virus e’ abbastanza comune e in particolare nei virus a mosaico c’e una cronica deplezione dei livelli di carboidrati nei tessuti vegetali

RNA silencing• RNA silencing is an evolutionarily conserved sequence-

specific gene-inactivation system that also functions as an antiviral mechanism in higher plants and insects.

• To overcome antiviral RNA silencing, viruses express silencing-suppressor proteins which can counteract the host silencing-based antiviral process.

• After the discovery of virus-encoded silencing suppressors, it was shown that these viral proteins can target one or more key points in the silencing machinery.

• RNA silencing and expression of viral silencing suppressor proteins are tools forged as a consequence of virus–host coevolution for fine-tuning host–pathogen coexistence.

• RNA silencing relies on small RNA (sRNA) molecules, approximately 21–24 nucleotides long, so-called short interfering RNAs (siRNAs) and micro RNAs (miRNAs)

• RNA silencing is triggered by double-stranded (ds) or self-complementary foldback RNAs that are processed into 21–24 nt short siRNA or miRNA duplexes by the RNase III-type DICER enzymes

• These miRNAs and siRNAs activate a multiprotein effector complex, the RNA-induced silencing complex (RISC) of which Argonaute protein (AGO) is the slicer component showing similarity to RNase H

RNAi

RNA interference

• RISC is the executioner of RNA silencing, inhibiting target RNA expression.

• The specific recognition of target sequences is guided by the siRNAs through a base-pairing mechanism, whereas the slicing of target RNA is carried out by the AGO proteins at the post-transcriptional or transcriptional levels

• Short RNAs can also guide another effector complex, namely the RNA-induced transcriptional gene silencing (RITS) complex to direct the chromatin modification of homologous DNA sequences

• RNA interference (http://www.nature.com/nrg/multimedia/rnai/animation/index.html)

RNA-BASED ANTIVIRAL IMMUNITY• One of the best-established functions of RNA

silencing is antiviral defense, which was first discovered in plants

• The antiviral functions of RNA silencing are supported by the following observations: – first, virus-derived siRNAs (viRNAs) accumulate at

high level during viral infections and can effectively target the viral RNA.

– Second, most, if not all, plant viruses have evolved virulence factors called viral suppressors of RNA silencing (VSRs) to overcome the RNA silencing-based host defense.

Current model of antiviral RNA silencing and its suppression in plants.

• RNA silencing is initiated by the perception of viral dsRNA or partially double stranded hairpin RNA, which are processed to 21 nt viral siRNAs (viRNAs) by siRNA specific RNAses called Dicer like 4 (DCL4) in association with dsRNA-binding protein 4 (DRB4).

• The viRNA are stabilized by 2u-O-methylation by HUA ENHANCER1 (HEN1) and afterward incorporated into Argonaute1 (AGO1) protein, the major antiviral slicer.

• The viral RNA molecules cleaved by RISC and viral RNAs lacking 5’- or/and 3’- end are likely recognized being aberrant RNAs (abRNA) and converted to dsRNA by RDR6 action.

• This dsRNA processed again viRNAs, that leads to generation of more viRNA and amplification of the silencing response

SILENCING SUPPRESSION STRATEGIES• More than 50 individual VSRs (virus silencing repressors-Viral

SuppresoRs) have been identified from almost all plant virus genera, underlining the need of their expression for successful virus infection.

• Available data suggest that virtually all plant viruses encode at least one suppressor, but in many cases viruses encode more than one

• Due to their evolution many of the suppressors identified to date are multifunctional: beside being RNA-silencing suppressors they also perform essential roles by functioning as coat protein, replicase, movement protein, helper component for virus transmission, protease or transcriptional regulators.

• Virtually all steps of the silencing pathway have been found to be targeted by VSRs; either acting on silencing-related RNA molecules or through protein–protein interaction

Suppressors targeting silencing-related RNAs

• The most widely used suppression strategy, adopted by many viral genera occurs through siRNA sequestration which prevents assembly of the RISC effector complex

• p19 homodimer acts like a molecular caliper, which measures the length of siRNAs and binds them with high affinity in a sequence-independent way selecting for the 19 bp-long dsRNA (duplex region) of the typical siRNA

Suppressors targeting silencing-related RNAs

• p14 and p38 are potent VSRs and bind long and short dsRNAs (including ds siRNAs) in a size-independent way

• p14 and p38 may interact with the viral dsRNA, inhibiting the RNA-silencing machinery on two levels: – (i) by siRNA sequestration– (ii) by interfering with DCL4-

mediated vsiRNA processing.

Suppressors interacting with silencing-related host proteins

• The 2b protein of CMV was one of the first VSRs described.

• 2b prevents the spread of the long-range silencing signal, and so facilitate the systemic virus infection

• 2b has been found to physically interact on PAZ and part of the PIWI domain with siRNA-loaded AGO1, and inhibits its slicing activity

Other silencing suppressor strategies

• The p69 protein suppresses RNA silencing induced by sense–transgenes (SPTGS) but not silencing induced by inverted-repeat transgenes (IRPTGS)

• these suppressors could interfere with dsRNA generation by inhibition of plant RDRs or other components of this pathway.

• Consistent with these observations is the fact that p69 expression leads to a phenotype characteristic for rdr6 mutant

SILENCING SUPPRESSORS AND VIRAL SYMPTOMS

• Although many VSRs have been identified as pathogenic determinants largely responsible for virus-induced symptoms, the molecular basis for virus-induced diseases in plants has been a long-standing mystery

• It is well established that the antiviral and endogenous silencing pathways share common elements, and VSRs have been shown to interfere with those pathways. siRNA-binding VSRs (e.g. HC-Pro and p19) could interact with siRNA and miRNA biogenesis at different stages.

• This interference may alter endogenous gene expression regulated through miRNAs or siRNAs.

• Similarly, long dsRNA-binding VSRs (e.g. p38 and p14) could compromise DCLs or AGO1-targeting VSRs (e.g. P0 and P1) inhibit RISC activities, which in turn may alter the expression of an unpredictable number of genes involved in plant development.

• Indeed expression of VSRs in transgenic plants leads to phenotypes that mimic virus symptoms

Il silenziamento genico – strategia OGM

• Gli acidi nucleici transgenici possono essere progettati in modo da agire come molecole trappola che competono con il genoma virale infettante

• Questo tipo di inibizione competitiva – silenziamento genico post trascrizionale (PTGS) – è stato già dimostrato in casi in cui il transgene codifica per una molecola di RNA o di DNA difettiva (e perciò interferente)

PTGS - 1• La produzione di RNA aberranti

(aRNA) funziona da segnale di attivazione del meccanismo di silenziamento

• In seguito all’ingresso dei virus nella cellula vengono liberate copie di ssDNA virale (1) può avvenire l’appaiamento diretto tra DNA virale e transgene trappola (2), determinando la formazione di ssRNA aberranti (3).

• In alternativa trascritti derivanti dal transgene antisenso/senso ibridizzano con mRNA virale (senso/antisenso) determinando la formazione di dsRNA aberrante

• Se questi si accumulano al di sopra di un valore soglia (4) si attiva il silenziamento genico

35S transg

ssDNA

1

Appaiamento diretto

2 trascrizione

ssRNA ab.

RNA virale

.

Accumulo di dsRNA aberrante

3

4

PTGS - 2• Le molecole di aRNA

possono attivare le metilasi (5) che abbassano l’espressione del transgene (6) oppure possono attivare RNA polimerasi RNA-dipendenti codificati dall’ospite (RDRP) (7) che producono copie di RNA che sono complementari ai trascritti virali (cRNA)

35S transg1

6trascrizione

Ss o dsRNA ab.

RNA ab.

.

Accumulo di cRNA

5

7

CH3

Attivazione di metilasi

..

Attivazione di RDRP dell’ospite

PTGS- 3• Gli RDRP utilizzano molecole di aRNA

come stampi per produrre copie di RNA (8) che sono complementari ai trascritti e si legano a questi e a quelli del transgene determinando l’accumulo di RNA che ibridizzano con le sequenze silenziate

• Questo abbassa la produzione dei prodotti genici virali anche quando la velocità di trascrizione è alta (9)

• I cRNA o i dsRNA possono anche muoversi sistemicamente in tutta la pianta inducendo il meccanismo di silenziamento in tutte le cellule dell’ospite

RNA ab.

.

Diffusione sistemica di cRNA

8

.

.

RDRP

Complesso RDRP

9 Degr. RNA

cRNA

10

Current model