I-PARTE GENERALE · batteri Gram negativi. Il primo ad essere sintetizzato fu l’acido nalidissico...

UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI PERUGIA

FACOLTÁ DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Dipartimento di Chimica e Tecnologia del Farmaco e

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche

TESI DI LAUREA SPERIMENTALE

MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE DI UN METODO DI SCREENING IMMUNOENZIMATICO PER LA

DETERMINAZIONE DI RESIDUI DI CHINOLONICI IN TESSUTI ANIMALI

OPTIMIZATION AND VALIDATION OF AN

IMMUNOENZYMATIC SCREENING METHOD FOR THE RESIDUES DETERMINATION OF QUINOLONES IN

ANIMAL TISSUES

Laureanda: Relatori: Valeria Di Girolamo Prof.ssa Luana Perioli Dott.ssa Roberta G alarini

Anno Accademico 2007-2008

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I-PARTE GENERALE

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1. I CHINOLONI

1.1. Introduzione

I chinoloni sono una classe di farmaci antimicrobici di origine sintetica nati in

seguito alla scoperta casuale di un prodotto secondario della sintesi della

clorochina (antimalarico) che possedeva una modesta attività nei confronti dei

batteri Gram negativi. Il primo ad essere sintetizzato fu l’acido nalidissico che

nel 1963 fu introdotto in terapia come chemioterapico delle vie urinarie. Il suo

uso, tuttavia, è andato via via declinando a causa del limitato spettro d’azione e

dei problemi di resistenza batterica [I].

L’acido nalidissico, oggi, non è più utilizzato in terapia ma alcune sue modifiche

strutturali hanno determinato la sintesi di composti che presentano un notevole

incremento dell’attività antimicrobica, un ampliamento dello spettro di azione e

una riduzione dei fenomeni di resistenza acquisita, parallelamente ai minori

effetti collaterali indesiderati. Si è quindi assistito alla sintesi di ben tre

generazioni di chinoloni [II].

Dal punto di vista chimico, la struttura base dei chinoloni è quella di un

eterociclico aromatico con anelli condensati e un gruppo chetonico in posizione

4. La maggior parte dei chinoloni presenta un solo atomo di azoto in posizione 1

(chinoline), ma alcuni possiedono due atomi di azoto in posizione 1 e 8

(naftiridine) o, ancora, tre atomi di azoto in posizione 1, 3 e 8 (piridopirimidine),

come riportato in Figura 1. Inoltre va sottolineato che in posizione 3 è sempre

presente il gruppo carbossilico che ha un ruolo fondamentale per le proprietà

farmacologiche dei chinoloni [I, II].

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Figura 1- Nomenclatura dei chinoloni

(da Corelli F. e Pasquini S. “Antibatterici chinolonici” http://www.farm.unisi.it/~corelli/Antibatterici _chinolonici.pdf)

Tutti i chinoloni hanno in comune un identico meccanismo d’azione,

caratterizzato dall’inibizione della subunità A della DNA-girasi batterica, nonché

una resistenza batterica esclusivamente di tipo cromosomico e alcuni effetti

indesiderati simili (fototossicità, neuro tossicità e tossicità cartilaginea) [I].

Siccome alcuni di questi farmaci sono impiegati nel settore zootecnico [I], la

presenza di loro residui negli alimenti di origine animale è stata regolamentata a

livello comunitario e sono stati fissati dei limiti massimi di residui (LMR) nel

Regolamento 2377/90(1). Per questo motivo, infatti, la loro ricerca nei tessuti di

alcune specie animali, nelle uova e nel latte è contemplata nei Piani di

monitoraggio dei residui effettuati in conformità alle normative dell’Unione

Europea (UE) [III].

1 Regolamento 2377/90 del 26 giugno 1990 che definisce una procedura comunitaria per la definizione dei limiti massimi di residui di medicinali veterinari negli alimenti di origine animale (GUCE L 224/1 del 18.08.1990).

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1.1.1. Chinoloni di prima generazione

Nella maggior parte dei casi i chinoloni presentano una struttura biciclica, a

eccezione della flumechina, dell’acido ossolinico e della cinossacina con

struttura triciclica. L’acido nalidissico ha una struttura 1,8-naftiridinica, mentre gli

altri sono derivati di naftiridine, pirido-pirimidine o cinoline (cinossacina). Oltre

alla funzione chetonica in posizione 4, è sempre presente un gruppo

carbossilico in 3. Sull’atomo di azoto N1 si ha molto spesso una sostituzione

etilica. Sull’atomo di carbonio in posizione 7 le sostituzioni sono molteplici

(metile, piperidina etc.). In Figura 2 sono riportate le strutture dei principali

chinoloni appartenenti alla prima generazione. Dal punto di vista chimico, il

passaggio strutturale che porta alla sintesi dei chinoloni di seconda

generazione, si nota nella flumequina (sostituzione di un atomo di fluoro in

posizione C6) e nell’acido pipemidico (sostituzione di un nucleo piperazinico in

posizione 7) [II].

Figura 2- Chinoloni di prima generazione


6

1.1.2. Chinoloni di seconda generazione

L’introduzione in posizione 6 di un atomo di fluoro e in posizione 7 di un anello

piperazinico ha comportato le modifiche più significative per i chinoloni di

seconda generazione, aumentandone l’attività antimicrobica, nonché lo spettro

d’azione rispetto alle caratteristiche della molecola precursore, ovvero l’acido

nalidissico. I principali composti appartenenti a questo gruppo sono riportati in

Figura 3. Si può affermare che la norflossacina è stato il primo fluorochinolone

propriamente detto, in quanto presenta non solo il fluoro in posizione 6, ma

anche l’altro elemento strutturale fondamentale che è la piperazina in posizione

7. Le modifiche strutturali, inoltre, hanno contribuito a migliorare le

caratteristiche farmacocinetiche, in particolare la biodisponibilità che permette,

in molti casi, la somministrazione per via orale dei chinoloni di seconda

generazione, nonché un aumento della capacità di diffusione tissutale

complessiva. Il fluoro, infatti, potenzia l’attività contro i Gram positivi patogeni

(Clostridium, Staphilococcus, Streptococcus), mentre l’anello piperazinico

aumenta l’efficenza contro gli organismi Gram negativi (Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis) [I, II].

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Figura 3- Chinoloni di seconda generazione


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1.1.3. Chinoloni di terza generazione

I nuovi composti di terza generazione, presentati in Figura 4, sono caratterizzati

da un’aumentata complessità strutturale, che ha introdotto interessanti

proprietà, quali l’attività contro i cocchi Gram positivi (in particolare S.

pneumoniae) e, per alcuni, contro anaerobi e patogeni atipici. In alcuni casi la

maggior potenza di azione e l’ampiezza dello spettro si coniugano con proprietà

farmacocinetiche migliorate che permettono di somministrare questi farmaci

una sola volta al giorno. Va sottolineato che non c’è comune accordo sulla

classificazione dei chinoloni e alcuni autori suddividono le molecole in quattro

generazioni [II].

Figura 4- Chinoloni di terza generazione


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1.2. Proprietà acido-base

Il gruppo carbossilico in posizione 3 conferisce ai chinoloni caratteristiche acide.

I 7-piperazinilchinoloni possiedono gruppi amminici basici e quindi, in soluzione

acquosa, questi mostrano tre differenti forme: cationica, zwitterionica e

anionica. In Figura 5 è riportato lo schema di protonazione/deprotonazione della

ciproflossacina, che si trova nella sua forma protonata in ambiente acido e in

quella deprotonata in ambiente basico, mentre a pH neutro è in equilibrio con la

sua forma zwitterionica dalla quale dipende la sua scarsa solubilità in acqua a

pH fisiologico [II].

Figura 5- Schema di protonazione/deprotonazione del la ciproflossacina


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Diversamente, chinoloni come l’acido ossolinico, la flumechina e l’acido

nalidissico possono avere solo due forme: neutra e anionica. Questi ultimi sono

detti chinoloni acidi, mentre i chinoloni come la ciproflossacina, che possiedono

l’anello piperazinico, sono detti anfoteri. I valori di pKa per i chinoloni acidi sono

compresi nel range 6.0-6.9 mentre gli anfoteri hanno valori di pKa1 5.5-6.6 e di

pKa2 7.2-8.9 [II].

1.3. Relazione struttura-attività

Lo studio delle relazioni tra struttura e attività farmacologica ha permesso di

mettere in evidenza che la caratteristica indispensabile dei chinoloni, affinché si

manifesti l’attività antibatterica, è la presenza del gruppo 1,4-diidro-4-piridon-3-

carbossilico, comune a tutti i chinoloni e, solo eccezionalmente, può essere

sostituito da quello isosterico 1,4-diidro-4-piridazinon-3-carbossilico

(sostituzione del CH= con –N=) [I].

Le proprietà antibatteriche dei chinoloni dipendono strettamente dalla funzione

carbossilica libera in posizione 3, tanto che la sua sostituzione con un gruppo

estereo, ammidico o con gruppi affini (CN, COCH3, SO2CH3) ne annulla

l’attività. La presenza del gruppo chetonico in posizione 4, allo stesso modo, è

indispensabile per l’inibizione della DNA-girasi.

Tutti i fluorochinoloni sono caratterizzati dalla presenza di un atomo di fluoro in

posizione 6 che ha portato ai miglioramenti di cui sopra.

Anche i gruppi in posizione 7 influenzano significativamente l’inibizione della

DNA-girasi e l’attività antibatterica. Piccoli radicali lineari, come -CH3, -Cl, -NH2,

-NHCH3, hanno permesso di ottenere composti con spettro d’attività ristretto,

benché più ampio di quello dell’acido nalidissico. Le sostituzioni con gruppi di

maggiori dimensioni, come ad esempio gruppi piperazinici, 3-amino-pirrolidinici

e 3-metilaminometil-pirrolidinici, hanno portato a composti caratterizzati da una

minore potenza in vitro, ma con il vantaggio di garantire livelli plasmatici più

elevati dopo somministrazione orale [I].

Il radicale piperazinico migliora, tra l’altro, l’attività anti-Pseudomonas dei

fluorochinoloni. Infine l’aggiunta di atomi di Cl o F in posizione 8 non influenza

negativamente l’inibizione della DNA-girasi, ma migliora la capacità del farmaco

di penetrare nella cellula ed il suo assorbimento gastrointestinale [I].

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1.4. Meccanismo d’azione

All’interno della cellula batterica si trova una grande quantità di DNA (circa 1

metro) contenuta in uno spazio ridotto (circa 1-2 micron). Per permettere che

l’intero DNA sia compreso in una cellula di pochi micron di lunghezza, è

necessario che il doppio filamento di DNA batterico subisca una forte

compattazione, che può avvenire grazie ad un “superavvolgimento” del DNA.

La formazione di un DNA tridimensionale superavvolto avviene grazie a

numerose transizioni momentanee nella sua struttura, che lo portano a

comprimersi e a ricostituirsi nella giusta configurazione. Sia le cellule procariote

che eucariote sono dotate di due enzimi, la topoisomerasi I e la topoisomerasi

II, in grado di promuovere le interruzioni nei filamenti di DNA e di cooperare,

quindi, nel processo di superavvolgimento. La topoisomerasi I altera

transitoriamente la topologia del DNA provocando interruzioni ed unioni su di un

singolo filamento di DNA, mentre la topoisomerasi II determina interruzioni ed

unioni su entrambi i filamenti della struttura a doppia elica del DNA.

I batteri sono dotati di un particolare tipo di topoisomerasi II, la DNA-girasi, che

introduce un superavvolgimento negativo nella molecola a doppio filamento del

DNA batterico. Questo spiega la selettiva tossicità dei chinoloni nei confronti dei

batteri, piuttosto che nei confronti dei mammiferi, che non possiedono questo

particolare enzima.

La DNA-girasi è costituita da due subunità, la A e la B, che devono agire

contemporaneamente perché si realizzi il superavvolgimento. La subunità A

contiene il sito di legame del DNA e sovrintende alla capacità di ricongiungere

le interruzioni della doppia catena del DNA, mentre la subunità B sovrintende

alla trasformazione di energia necessaria ed alla idrolisi dell’ATP tanto da

essere ritenuta la reale responsabile dell’introduzione del superavvolgimento

negativo nel doppio filamento di DNA.

I chinoloni, e in particolare i fluorochinoloni, esercitano, quindi, la loro azione

tramite il meccanismo di inibizione selettiva della DNA-giarasi, soprattutto a

livello delle sue subunità. Si ritiene infatti che l’inibizione della DNA-girasi

batterica sia il fondamentale meccanismo con il quale questi farmaci esercitano

i loro effetti battericidi. I meccanismi molecolari che bloccano la replicazione del

DNA del microrganismo non sono però ancora completamente noti.

L’interruzione della sintesi di proteine batteriche e di RNA sembra essere il

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fenomeno intracellulare indispensabile per il definitivo espletamento dell’attività

battericida [I].

1.5. Spettro antimicrobico

I fluorochinoloni sono farmaci molto attivi a concentrazioni estremamente

basse, rispetto ai più tradizionali antibatterici come le penicilline, le

cefalosporine, le tetracicline, i macrolidi e gli inibitori dell’acido folico. La

suscettibilità di un certo microrganismo ai singoli composti del gruppo può

tuttavia variare in misura considerevole, pur essendo questi strutturalmente e

chimicamente simili. In linea generale, i fluorochinoloni sono attivi nei confronti

di bacilli e cocchi Gram negativi intestinali (E. Coli , Kelbsiella spp., Shigella

spp., ecc.) e di altri Gram negativi come Salmonella spp.,Yersinia spp.,

Aeromonas spp., Proteus spp. e Pseudomonas aeruginosa. Sono attivi però

anche nei confronti di Gram positivi come Staphilococcus aureus e

Staphilococcus epidermidis, Haemophilus spp., Neisseria spp. e Campylobacter

spp. e rivelano attività variabile nei confronti della maggior parte dei ceppi di

streptococco, tra cui Streptococcus pyogenes, streptococchi emolitici dei gruppi

B, C, F e G, Streptococcus pneumonite ed Enterococcus faecalis. Molti cocchi

anaerobi, come Clostridia e Bacteroides, sono invece insensibili a questo tipo di

farmaci. Nei confronti di alcuni batteri si è riscontrato anche un prolungato

effetto post-antibiotico, come nel caso della norflossacina nei confronti dello

Staphilococcus aureus, E. Coli, ecc [I].

1.6. Usi terapeutici in medicina veterinaria

In medicina umana i chinoloni sono impiegati principalmente per curare

numerose infezioni microbiche a carico delle vie genito-urinarie e respiratorie e,

grazie alle loro interessanti proprietà, il loro uso è stato largamente esteso

anche alla medicina veterinaria. Trattandosi, infatti, di composti notevolmente

meno tossici, ma con spettro antimicrobico simile, degli aminoglicosidi, i

chinoloni stanno assumendo il ruolo di farmaci di elezione per il trattamento

delle infezioni gravi da Gram negativi negli animali da allevamento, domestici e

in acquacoltura. In particolare alcuni di loro come norflossacina, enroflossacina

e ciproflossacina, vengono utilizzati per curare infezioni (complicate e non) delle

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vie urinarie nel cane e nel gatto. Inoltre, i fluorochinoloni (in particolare

l’enroflossacina) sembrano raggiungere anche nel tessuto prostatico

concentrazioni sufficienti a curare le prostatiti batteriche [I].

Le principali applicazioni dei fluorochinoloni riguardano comunque il trattamento

delle infezioni delle vie respiratorie e del tratto gastrointestinale, principalmente

in animali d’allevamento. Questi infatti, in particolare la norflossacina,

raggiungono, nel tessuto polmonare di molti animali, concentrazioni superiori a

quelle sieriche, tali da risultare superiori alle MIC (concentrazione inibente

minima) per molti patogeni. D’altra parte, la decolonizzazione selettiva

dell’apparato gastrointestinale, che si verifica dopo somministrazione di

chinoloni, risulta vantaggiosa per trattare le infezioni da microrganismi sensibili

che qui si instaurano.

L’enroflossacina è il fluorochinolone più usato nell’UE per il trattamento delle

infezioni, soprattutto nell’allevamento avicolo e suinicolo [IV].

La flumechina , sembra essere il fluorochinolone principalmente utilizzato,

sottoforma di pellets commestibili, nella produzione di alimenti medicati ad uso

zootecnico per l’acquacoltura e per il pollame, grazie alla sua efficacia sia nella

terapia che nella prevenzione di molte infezioni batteriche [IV]. Studi effettuati

somministrando flumechina a galline ovaiole in una dose pari a 200 mg/L

d’acqua per 5 giorni consecutivi, mostrano la presenza di residui nelle uova a

partire dal secondo giorno di trattamento fino all’undicesimo giorno dopo il

termine dello stesso. I residui si distribuiscono principalmente nell’albume [I].

L’acido ossolinico è stato autorizzato per il trattamento delle infezioni in pesci,

bovini, suini e pollame per via orale [IV]. Può essere somministrato tramite

alimenti, acqua o come compressa. Esso è velocemente assorbito in seguito a

somministrazione orale, ma tale assorbimento è variabile e può dipendere dalla

specie animale, dalla formulazione del farmaco, dalla dieta dell’animale e dallo

stadio della malattia. Quando ai polli viene somministrato acido ossolinico per

un certo periodo di tempo, alla fine del trattamento è possibile evidenziare

residui di tale farmaco nel fegato, nei reni e nel muscolo. Per questo motivo le

uova, insieme al tessuto muscolare e ai mangimi, sono alcune delle matrici

previste per la ricerca di residui di chinolonici nei piani di monitoraggio degli

alimenti di origine animale [I].

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1.7. Resistenza e tossicità

L’unico meccanismo noto tramite il quale i batteri possono manifestare

resistenza nei confronti dei chinoloni è quello di una modificazione

cromosomiale, la quale può comportare alterazioni dell’enzima bersaglio (DNA-

girasi), principalmente a carico della subunità A, o provocare ridotta capacità

del farmaco di penetrare all’interno della cellula microbica [I]. I chinoloni

penetrano nelle cellule microbiche per diffusione attraverso il doppio strato

fosfolipidico e tramite le porosità dello strato più esterno dei batteri Gram

negativi. Un aumento della lipofilia della membrana cellulare e della porosità

può ridurre la capacità del farmaco a penetrare nella cellula e pertanto rendere

la cellula stessa resistente ad esso [I].

I principali effetti tossici si manifestano quando i farmaci vengono somministrati

a dosi terapeutiche in animali ancora immaturi. Tutti gli appartenenti al gruppo

dei chinoloni sono in grado di provocare lesioni articolari nei giovani animali con

evidenti zoppie e forti dolori dovuti alle alterazioni a carico delle cartilagini di

accrescimento. Pertanto questi farmaci non possono essere somministrati a

giovani animali ancora in fase di sviluppo osseo, ossia nella maggior parte dei

cani sotto gli otto mesi di età, nei cavalli giovani e negli animali gravidi in genere

[I].

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2. IL CONTROLLO DEI RESIDUI NEGLI ALIMENTI DI ORIGI NE

ANIMALE

2.1. Il Piano Nazionale Residui

I prodotti di origine animale, come carne, latte, uova costituiscono la parte

preponderante dell’alimentazione nei paesi industrializzati e la sempre

crescente domanda di alimenti proteici ha stimolato e condizionato lo sviluppo

della zootecnia sia attraverso la selezione genetica ed il miglioramento delle

tecniche di produzione, trasformazione e conservazione di mangimi e foraggi,

sia attraverso il ricorso alla somministrazione di sostanze diverse da quelle

alimentari, quali farmaci, additivi, ormoni, ecc. Tra queste molecole, quelle

maggiormente utilizzate per incrementare il rendimento delle produzioni

zootecniche, sono state e sono i prodotti ad azione ormonale ed antiormonale,

gli antibiotici, i β-agonisti, il cui impiego, purtroppo, non è esente da rischi

igienico-sanitari, sia sugli alimenti che sulla salute del consumatore. Una vasta

serie di molecole autorizzate (antibiotici, antielmintici, anticoccidici, etc.) sono,

inoltre, impiegate in allevamento come medicinali veterinari nella prevenzione

e nella cura delle malattie [V].

Il problema del controllo dei residui nelle derrate alimentari di origine animale

si è così intensificato con il passare del tempo, anche per l’attenzione e

l’interesse sempre maggiori che il consumatore ha rivolto a questa tematica.

D’altra parte, la preoccupazione è giustificata dal fatto che un numero

crescente di farmaci viene impiegato nelle produzioni animali e ciò,

potenzialmente, espone il consumatore all’assunzione di residui di xenobiotici,

se pur in piccole quantità, per la durata di tutta una vita. Di conseguenza negli

ultimi decenni il legislatore, sia in ambito comunitario che nazionale, si è

fortemente impegnato a emanare una serie di normative atte a migliorare gli

aspetti inerenti alla sicurezza alimentare.

Il tema dell’igiene e della sicurezza degli alimenti di origine animale, infatti, è

una fase complessa ed articolata che fa parte di un processo che inizia in

allevamento con la lotta alle malattie infettive trasmissibili tra animali, e di cui

fanno parte la lotta alle zoonosi, il controllo degli alimenti destinati agli animali,

la vigilanza sull’inquinamento ambientale di derivazione animale, la

sorveglianza sul benessere e sulla sanità animale.

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Se certe sostanze possono essere assunte dagli animali in modo del tutto

involontario o accidentale (contaminanti ambientali), esistono invece, come

sopra accennato, molecole che vengono loro somministrate volontariamente.

Si tratta sia di farmaci veterinari autorizzati utilizzati a scopi terapeutici, sia di

promotori di crescita (sostanze ad azione ormonale) somministrati in modo del

tutto illecito per aumentare le rese delle produzioni di carne. Il legislatore, da

oltre quarant’anni, sta richiamando l’attenzione degli operatori sanitari su

queste problematiche legate sostanzialmente alla presenza di residui, i cui

effetti biologici sono strettamente correlati alle caratteristiche tossicologiche

del farmaco progenitore, alla sua metabolizzazione nell’organismo animale, ai

legami che i diversi metaboliti formano con le molecole biologiche e che ne

condizionano la biodisponibilità, oltre che la loro degradazione.

Nella Comunità Europea (CE) il problema dei residui delle sostanze ad azione

anabolizzante utilizzate in zootecnica venne alla ribalta nel 1981 con la

Direttiva 81/602/CEE (2,3).

A causa del problema dei residui di anabolizzanti nelle carni, con questa

Direttiva gli Stati membri decidevano di vietare la somministrazione agli

animali in allevamento di sostanze ad azione tireostatica, estrogena,

androgena e gestagena e l’immissione sul mercato di animali ai quali fossero

state somministrate dette sostanze. A seguito di questo provvedimento, la CE,

con la Direttiva 86/469/CEE(4), decise di istituire dei piani annuali di controllo

degli animali e delle carni fresche per la presenza di residui di medicinali

veterinari e di altri contaminanti, ritenuti un rischio per la salute del

consumatore, oltre che un danno per la qualità delle carni.

Fino ad allora, infatti, le modalità di controllo, la frequenza dei campionamenti e

le concentrazioni massime consentite di residui di farmaci e contaminanti

ambientali erano disciplinate in maniera profondamente eterogenea nei vari Stati

2 Per dare attuazione alle politiche in materia di sicurezza e qualità degli alimenti, la Comunità ha adottato principalmente due tipi di strumenti normativi: i Regolamenti e le Direttive. I primi non necessitano di normative particolari di recepimento da parte degli Stati membri, mentre le Direttive possono contenere solo principi generali della disciplina delle materie che vanno a regolare e sono rivolte ai singoli Stati membri, che devono attuarle con proprie leggi ordinarie. 3 Direttiva 81/602/CEE del Consiglio, del 31 luglio 1981, concernente il divieto di talune sostanze ad azione ormonica e delle sostanze ad azione tireostatica. Recepita in Italia con il Decreto: Decreto Ministeriale 3 novembre 1981: " Divieto di vendita di medicinali (specialità di medicinali o galenici) per uso veterinario contenenti stilbenici o tireostatici". 4 Direttiva 86/469/CEE del 16 settembre 1986 concernente il controllo degli animali e delle carni fresche per la presenza di residui.

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membri. Ciò comportava, fra l’altro, notevoli ostacoli agli scambi intracomunitari

ed una distorsione delle condizioni di concorrenza tra produzioni.

Pertanto, fu necessario trovare una soluzione globale e uniforme per

l’effettuazione dei controlli all’interno della Comunità per la ricerca di residui negli

animali di allevamento, nelle carni e nei prodotti a base di carne, sia che questi

prodotti fossero destinati al mercato nazionale degli Stati membri oppure agli

scambi intracomunitari. Venne, quindi, stabilito che gli Stati membri avrebbero

dovuto elaborare un piano annuale di controllo tenendo conto della propria

specifica situazione: tale piano è effettuato ancora oggi e va sotto il nome di

Piano Nazionale Residui (PNR) [VI].

La Direttiva 86/469/CEE sanciva che i campionamenti fossero eseguiti in modo

ufficiale secondo criteri comuni per le diverse categorie di sostanze interessate e

che i campioni venissero analizzati in laboratori ufficialmente autorizzati. Ed

infine, qualora una determinazione analitica avesse rilevato la presenza di

residui di sostanze non consentite o di sostanze consentite in concentrazione

superiore al limite ammesso (campione non conforme), si imponeva l’adozione

di misure comuni intese ad accertare la causa della non conformità, a eliminare

il problema ed atte ad assicurare che i prodotti coinvolti fossero effettivamente

esclusi dal consumo.

Ciascun Paese Membro doveva quindi provvedere affinché la ricerca dei residui

negli animali, nei loro escrementi e liquidi biologici, nonché nei tessuti e nelle

carni fresche venisse eseguita conformemente alle prescrizioni dettate dalla

Direttiva 86/469/CEE. Inoltre, i singoli paesi della CE affidavano a un servizio o

organismo centrale il compito di coordinare l’esecuzione dei controlli previsti

dalla Direttiva. Tale organismo doveva coordinare le attività dei servizi regionali

effettivamente incaricati di effettuare i controlli, raccogliere i risultati e le

informazioni da trasmettere alla Commissione e infine, di primaria importanza,

elaborare annualmente i piani stessi. Per quanto riguarda l’esecuzione delle

analisi, nel nostro paese furono affidate alla rete dei Laboratori degli Istituti

Zooprofilattici Sperimentali.

L’elenco completo e la classificazione delle sostanze da ricercare era riportato

nell’Allegato I della stessa Direttiva e prevedeva categorie comuni a tutti gli stati

membri (A) e categorie specifiche (B).

L’approvazione dei singoli piani nazionali veniva decisa dalla Commissione

Europea previa verifica della loro conformità ai requisisti della Direttiva CEE

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86/469; in caso di mancata approvazione lo Stato Membro avrebbe dovuto

modificare e/o completare il piano proposto.

A partire dal 1988, quindi, l’Italia attua il proprio PNR che ha subito nel tempo

molte modifiche derivanti dalla necessità di adeguamento alle nuove

problematiche, nell’ambito dei residui, che via via si presentavano. Nel tempo

l’enorme progresso delle tecniche analitiche e i vari allarmi a livello mondiale,

nell’ambito della sicurezza alimentare, hanno portato, ad esempio,

all’introduzione della ricerca di diossine, di metaboliti di nitrofuranici o di alcuni

gestageni [V]. Inoltre, nuovi settori produttivi sono stati via via coinvolti nei

campionamenti programmati tanto che i controlli che, inizialmente, riguardavano

prevalentemente il settore bovino (1988), attualmente prevedono il

campionamento nei settori bovino, suino, ovi-caprino, equino, avicolo, cuniculo,

selvaggina allevata ed acquacoltura. Inoltre sono effettuati anche prelievi di

latte, miele e uova.

Nel 1997 l’Italia dovette tener conto di due fondamentali Direttive promulgate

proprio dal Consiglio d’Europa durante il 1996(5). Le due Direttive furono recepite

nell’ordinamento nazionale solo qualche anno più tardi con il Decreto Legislativo

n. 336 del 4 agosto 1999(6) e sono alla base del PNR attuale.

Tra le novità, la Direttiva 96/23/CE comportava una riclassificazione delle

sostanze da ricercare come riportato in Tabella 1. Come si può osservare, nella

Categoria A sono incluse le sostanze considerate fonte di gravi rischi per la

salute pubblica e per le quali non è, quindi, possibile fissare un LMR, mentre

nella Categoria B si collocano i farmaci veterinari con LMR (ad esempio i

chinoloni che appartengono, nello specifico, alla categoria B1) ed i contaminanti

ambientali (metalli pesanti, micotossine, pesticidi etc.).

5 Direttiva 96/22/CE del 29 aprile 1996: "concernente il divieto di utilizzazione di talune sostanze ad azione ormonica, tireostatica e delle sostanze beta-agoniste nelle produzioni animali e che abroga le direttive 81/602/CEE, 88/146/CEE e 88/299/CEE". Direttiva 96/23/CE del 29 aprile 1996: "concernente le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei loro prodotti". 6 Decreto Legislativo n. 336 del 4 agosto 1999: "Attuazione delle direttive 96/22/CE e 96/23/CE concernenti il divieto di utilizzazione di talune sostanze ad azione ormonica, tireostatica e delle sostanze β-agoniste nelle produzioni di animali e le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei loro prodotti"

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Tabella 1- Classificazione delle sostanze da ricerc are come indicato nell’Allegato I della Direttiva 96/23/CEE [VI]

Categoria A - Sostanze ad effetto anabolizzante e s ostanze non autorizzate categoria A, 1

stibeni, loro derivati e loro sali ed esteri

categoria A, 2

agenti antitiroidei

categoria A, 3

steroidi

categoria A, 4

lattoni dell'acido resorcilico (compreso lo zeranolo)

categoria A, 5

beta-agonisti

categoria A, 6

sostanze incluse nell'allegato VI del regolamento (CEE) n. 2377/90 del Consiglio, del 26 giugno 1990

Categoria B - Farmaci veterinari ((((7)))) e contaminanti ambientali

categoria B, 1 sostanze antibatteriche, compresi sulfamidici e chinoloni

altri prodotti medicinali veterinari: B, 2a antielmintici

B, 2b coccidiostatici, compresi i nitroimidazoli

B, 2c carbammati e piretroidi

B, 2d tranquillanti

B, 2e antinfiammatori non steroidei (AINS)

categoria B, 2

B, 2f altre sostanze esercitanti un'attività farmacologia

altre sostanze e agenti contaminanti per l'ambiente: B, 3a composti organoclorurati, compresi i PCB

B, 3b composti organofosforati

B, 3c elementi chimici

B, 3d micotossine

B, 3e coloranti

categoria B, 3

B, 3f altri

7 Comprese le sostanze non registrate utilizzabili a fini veterinari.

20

2.2. I controlli analitici

Parallelamente all’istituzione dei Piani Nazionali, un nodo fondamentale era

quello di avere un sistema di controlli efficace. Infatti garantire l’affidabilità dei

dati non era un problema banale, data la numerosità e la disomogeneità dei

laboratori coinvolti nei vari paesi membri e la difficoltà intrinseca del settore

analitico che si occupa di determinare tracce di sostanze in matrici complesse,

quali gli alimenti di origine animale. L’UE si apprestò quindi a un’intensa

attività legislativa riguardante i criteri di qualità che dovevano adottare i

laboratori incaricati dello svolgimento delle analisi dei residui a livello

comunitario. Attraverso la Direttiva 89/397/CEE(8) si introdussero importanti

disposizioni riguardo alla necessità di un controllo pubblico dei prodotti

alimentari. La Direttiva prevedeva:

• ampliamento del campo di azione dei controlli a tutte le fasi della

produzione, della fabbricazione, del magazzinaggio, del trasporto, della

distribuzione, dell'importazione e del commercio;

• controllo sui prodotti alimentari anche all’esame dei sistemi di verifica

della qualità eventualmente installati dall'impresa e dei relativi risultati;

• pubblicazione di un elenco delle autorità competenti nel settore del

controllo dei prodotti alimentari di ciascuno stato membro, in cui siano

indicati i territori di rispettiva competenza ed i laboratori abilitati ad

effetuare le analisi;

• nomina, da parte delle suddette autorità competenti, di laboratori ufficiali

incaricati di effettuare le analisi.

Per garantire la qualità del dato analitico era necessario introdurre un sistema

di norme per i laboratori ufficiali dei vari Stati membri. Tale sistema doveva

essere basato su norme approvate e standardizzate, ed i laboratori incaricati

dovevano lavorare secondo metodi di analisi convalidati. Perciò venne

8 Direttiva 89/397/CEE del Consiglio, del 14 giugno 1989, relativa al controllo ufficiale dei prodotti alimentari. Recepita con il D.Lgs. 03/03/1993 n. 123. Attuazione della Direttiva 89/397/CEE relativa al controllo ufficiale dei prodotti alimentari.

21

successivamente emanata la Direttiva 93/99/CE(9) con la quale si

completavano in sostanza le disposizioni già riportate nella 89/397/CEE. Nelle

sue premesse essa ribadisce, quale preoccupazione prioritaria del Consiglio,

la necessità di introdurre un sistema di norme di qualità per i laboratori

incaricati dagli Stati membri di effettuare il controllo ufficiale delle derrate

alimentari; tale sistema doveva essere basato su norme generalmente

approvate e standardizzate. Inoltre i laboratori erano tenuti, ove possibile, a

impiegare metodi analitici convalidati. In particolare nella Direttiva si fissavano:

• il personale delle strutture cui compete il controllo ufficiale;

• i requisiti necessari per il funzionamento dei laboratori(10);

• gli organismi responsabili della verifica dei laboratori;

• i requisiti e le modalità dei sistemi di verifica dei laboratori;

• le procedure relative al sistema di mutua assistenza amministrativa e di

scambio di informazioni nonché alle ispezioni congiunte con gli agenti

dell'UE.

Ogni Stato membro, dal 1° novembre 1998, era in sos tanza obbligato a

prendere i provvedimenti necessari affinché:

• i laboratori fossero conformi ai criteri generali stabiliti dalla norma

europea UNI CEI EN 45001, ovvero fossero accreditati;

• fossero designati gli organismi responsabili della valutazione e del

riconoscimento dei laboratori preposti al controllo ufficiale. Tali

organismi dovevano soddisfare i criteri generali stabiliti dalla norma

europea UNI CEI EN 45003;

9 Direttiva 93/99/CE del Consiglio, del 29 ottobre 1993, riguardante misure supplementari in merito al controllo ufficiale dei prodotti alimentari. Recepita con il D.Lgs.26/05/1997, n.156. Attuazione della Direttiva 93/99/CE concernente misure supplementari in merito al controllo ufficiale dei prodotti alimentari. Sia la Direttiva 89/397/CEE che la 93/99/CE sono state abrogate con effetto dal 1° gennaio 2006 dall’articolo 61 del Regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004, relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali (GU L 165 del 30.4.2004). 10 I laboratori adibiti al controllo ufficiale sono quelli precisati all’articolo 7 della 89/397/CEE.

22

• la valutazione dei laboratori di prova doveva avvenire applicando i

requisiti stabiliti dalla norma UNI CEI EN 45002.

In Italia, nel novembre 1998, solo alcune strutture operavano in conformità alla

norma EN 45001 o erano in attesa di ricevere gli audit (verifiche ispettive) da

parte dell’unico organismo operante sul territorio nazionale in conformità alla

UNI CEI EN 45003: il SINAL (Sistema Nazionale per l’Accreditamento dei

Laboratori di prova).

Nel frattempo la Direttiva 96/23/CE cercò di migliorare l'efficacia dei piani di

sorveglianza messi in opera ogni anno degli Stati membri, assicurare la

comparabilità dei risultati ottenuti ed armonizzare le modalità di applicazione

per il campionamento.

A tal fine, venne emanata la Decisione 98/179/CE(11) la quale, all’articolo 1,

stabiliva che le analisi dei campioni dovevano essere effettuate

esclusivamente presso laboratori per il controllo ufficiale dei residui riconosciuti

dall'autorità competente, ribadendo la necessità di assicurare la qualità e la

comparabilità dei risultati analitici. I laboratori autorizzati erano, quindi, tenuti a

partecipare a un programma esterno, riconosciuto sul piano internazionale, di

valutazione qualitativa e di accreditamento. Tale obiettivo doveva essere

conseguito attraverso l’accreditamento (da ottenersi prima del 1° gennaio

2002) e la partecipazione degli stessi a circuiti interlaboratorio (proficiency

testing schemes), organizzati dai Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR) o

dai Laboratori Comunitari di Riferimento (LCR) [VII].

Con la Decisione 98/179/CE si richiedeva dunque che, a partire dal 2002, i

laboratori per il controllo ufficiale dovessero essere accreditati secondo la UNI

CEI EN ISO/IEC 17025 [VIII] che, dal 2000, ha sostituito la EN 45001.

Parallelamente allo svilupparsi dei Sistemi di Qualità, la UE emanava

provvedimenti più specifici atti a garantire il rispetto di alcuni requisiti minimi.

Infatti, la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025 è di tipo orizzontale e, quindi

piuttosto generica, non essendo indirizzata ad un settore analitico in

particolare. Da questa considerazione, si sviluppa dunque un punto

fondamentale della strategia dell’UE, che richiede ai propri laboratori ufficiali

11 98/179/CE: Decisione della Commissione del 23 febbraio 1998 recante modalità d'applicazione per il prelievo ufficiale di campioni al fine della sorveglianza su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei prodotti di origine animale.

23

ulteriori requisiti di qualità, considerando l’ambito analitico nei quali questi

operano, ovvero la ricerca di sostanze in tracce (residui).

Prima del 1993, i criteri analitici da applicare ai metodi di riferimento erano

riportati nella Decisione 89/610/CEE(12).

Dal 1993 entrarono poi in vigore la Decisione 93/256/CE(13) e la Decisione

93/257/CE(13).

Nelle previsioni, queste due Decisioni avrebbero dovuto essere riviste entro il

1996. Quindi, nel 1995, la Commissione Europea, in collaborazione con i

quattro laboratori di riferimento comunitari, dava inizio a un lavoro di revisione

tecnico-legislativo delle Decisioni 93/256/CE e 93/257/CE, proprio con il

compito di superare i limiti evidenziati dalla normativa vigente, soprattutto alla

luce dei progressi più recenti della chimica analitica. A causa della natura

complessa dell’opera di revisione e delle istanze di partecipazione dei

laboratori nazionali di riferimento, nel 1998 la Commissione designava un

gruppo di lavoro ad hoc con il compito di delineare e revisionare i criteri relativi

alla validazione dei metodi e all’interpretazione dei risultati. Questa attività

portò finalmente alla pubblicazione nel 2002 della Decisione 2002/657/CE(14).

La 2002/657/CE abroga sia la Decisione 93/256/CEE che la 93/257/CEE e,

all’articolo 5, ribadisce che: “Gli Stati membri garantiscono la qualità dei

risultati delle analisi dei campioni prelevati a norma della Direttiva 96/23/CE, in

particolare attraverso la sorveglianza delle analisi e/o la calibrazione dei

risultati in ossequio al capitolo 5.9 della ISO 17025” [VIII].

La 2002/657/CE [VI,IX] si configura come un provvedimento completo e

complesso, che ha dato adito ad alcune critiche e a diverse interpretazioni, ma

che, comunque, rappresenta ormai un punto di riferimento sia per i laboratori

ufficiali che non, all’interno dell’UE e anche al di fuori dei suoi confini. Infatti,

12 89/610/CEE: Decisione della Commissione, del 14 novembre 1989, che stabilisce i metodi di riferimento e la lista dei laboratori nazionali da impiegare per la ricerca dei residui. 13 93/256/CE: Decisione della Commissione, del 14 aprile 1993, che stabilisce i metodi da impiegare per la ricerca dei residui di sostanze ad azione ormonica e di sostanze ad azione tireostatica. 93/257/CE: Decisione della Commissione, del 15 aprile 1993, che stabilisce i metodi di riferimento e l'elenco dei laboratori di riferimento nazionali per la ricerca dei residui. 14 2002/657/CE: Decisione della Commissione, del 12 agosto 2002, che attua la Direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all'interpretazione dei risultati (GUCE L221/8 del 17.08.2002). Precedentemente, con il nome di SANCO/1085/2000, era stata diffusa una bozza di revisione della Decisione 93/256/CE.

24

oltre a indicare i parametri di prestazione che devono essere determinati e i

loro limiti di accettabilità, essa descrive anche il piano sperimentale per

ottenerli. Indica, inoltre, i criteri da seguire nell’interpretazione dei risultati,

modulando le prescrizioni anche in funzione della categoria delle sostanze

analizzate (sostanze vietate appartenenti alla categoria A o permesse della

categoria B).

La Decisione supera, inoltre, la precedente distinzione tra i metodi di routine e

di riferimento, distinzione riportata nella stessa Direttiva 96/23/CE (art. 15),

lasciando solo la differenziazione tra metodi di screening e di conferma [X].

In particolare, i metodi di screening sono usati per determinare la presenza di

un analita o di una classe di analiti al di sopra o al di sotto del livello di

interesse (LMR, presenza, etc..). Sono caratterizzati dalla capacità di

analizzare un gran numero di campioni allo scopo di individuare quelli sospetti

da processare, successivamente, con un metodo di conferma. Sono, quindi,

sostanzialmente concepiti per evitare campioni falsi negativi (falsi conformi).

I metodi di conferma , invece, devono fornire informazioni definitive per

l’identificazione, e, se necessario, per il dosaggio dell’analita al livello

d’interesse. Proprio per garantire questo, al contrario dello screening per cui

non esistono prescrizioni particolari, la Decisione stabilisce che, per un esame

di conferma, possano essere utilizzate solo tecniche strumentali con requisiti

ben precisi.

Con il provvedimento di cui sopra, l’obiettivo della Commissione è stato quello

di garantire l’adozione di procedure analitiche con performances prestabilite.

La filosofia perseguita dall’UE si configura, quindi, come molto flessibile dal

punto di vista delle scelte di ciascun laboratorio, ma estremamente rigida sui

criteri minimi di qualità da rispettare affinché un metodo di prova sia da

considerarsi adeguato allo scopo. Tutto ciò si è reso necessario poiché, d’altra

parte, l’utilizzo di metodi standardizzati ufficialmente riconosciuti (di

riferimento), che costituirebbe già di per sé una garanzia di confrontabilità del

dato analitico, si era dimostrata una strada inadatta proprio in virtù del

continuo progresso tecnico-scientifico di questo particolare settore della

chimica analitica. Inoltre questa strategia permette una maggiore flessibilità

rispetto alle varie allerte, che via via possono presentarsi anche su

analiti/matrici inusuali. Anche se molta strada rimane ancora da percorrere,

25

anche nell’armonizzazione e semplificazione delle norme che fissano requisiti

tecnici riguardanti gli obblighi dei laboratori, l’impegnativa strategia comunitaria

ha comunque fatto registrare imponenti miglioramenti. A dimostrazione di ciò,

un esempio per tutti è rappresentato dall’abbassamento dei livelli medi di

controllo per le sostanze vietate di oltre un ordine di grandezza dall’istituzione

dei piani nazionali dal 1988 a oggi.

3. I METODI ANALITICI DI SCREENING

3.1. Introduzione

La normativa europea vigente, riguardo alle performances dei metodi analitici

per la ricerca di residui negli animali vivi e nei loro prodotti (Decisione

2002/657/CE), prevede espressamente l’utilizzo di metodi di screening. Tale

eventualità non è obbligatoria, ma riguarda una scelta del laboratorio.

Tecnicamente i metodi di conferma, generalmente più sofisticati e costosi,

possono essere utilizzati anche come primo approccio analitico e, nel caso in

cui non siano disponibili adeguati metodi di screening, questo avviene

sistematicamente. Tuttavia, quando è possibile, per il laboratorio e anche per il

cliente, è estremamente conveniente avere a disposizione screening che

permettano di ottenere una maggiore produttività, costi più contenuti e, non

ultimo, tempi di risposta brevi.

Sostanzialmente il flusso dei campioni può essere riassunto come in Figura 6,

dove per conventional analytical process si intende il metodo di conferma

attuato prevalentemente con tecniche cromatografiche (HPLC o GC). Il ruolo

del metodo di screening è quindi quello di selezionare, tra la massa dei

campioni in arrivo, quelli sospetti, che poi verranno rianalizzati con una idonea

procedura di conferma.

26

Figura 6- Flusso dei campioni in laboratorio: metod i di screening e di conferma

Per i metodi di conferma, la Decisione 657 prevede l’utilizzo solo di certe

tecniche analitiche strumentali elencate nella Tabella 1 della stessa Decisione:

tali tecniche sono in grado di fornire adeguate garanzie di riconoscimento

strutturale delle molecole da determinare. Per lo screening, invece, non è

prevista alcuna restrizione da questo punto di vista, ma sono altresì richieste

determinate performances metodologiche che, come è ovvio, per lo screening

sono meno severe che per la conferma, come si evince dalla Tabella 2

seguente (Tabella 9 della Decisione 2002/657/CE) [VI, IX].

Tabella 2- Classificazione di metodi analitici in b ase alle caratteristiche di rendimento che devono essere determinate

Limite di

rilevazione CCβ

Limite di decisione

CCα

Esattezza/ Recupero

Preci- sione

Selettività/ Specificità

Applicabilità/ Robustezza/

Stabilità

S + − − − + +

Metodi

qualitativi C + + − − + +

S + − − + + +

Metodi

quantitativi C + + + + + +

S = metodi di screening; C = metodi di conferma; + = la determinazione è obbligatoria

27

Infatti generalmente lo screening è un test a risposta binaria (negativo/sospetto)

che, quindi, non presenta le problematiche legate ad un esito quantitativo, quale

quello ottenuto con i metodi di conferma.

Riguardo ai parametri riportati in Tabella 2, essi devono essere determinati

durante lo studio di validazione. La validazione di un metodo è la “conferma

attraverso l’esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per

l’utilizzazione prevista siano soddisfatti”. Le definizioni dei parametri di

performances importanti per un metodo di screening qualitativo sono riportati di

seguito [VI].

.

• Limite di decisione (CC α = Critical Concentration α): il limite al quale

e oltre il quale è possibile concludere con una probabilità di errore pari

ad α che un campione è non conforme. L’errore α rappresenta la

probabilità che il campione sottoposto ad analisi sia conforme, sebbene

sia stata ottenuta una misura non conforme (decisione di falsa non

conformità o falsa positiva).

• Capacità di rilevazione (CC β = Critical Concentration β): il CCβ è il

contenuto più piccolo della sostanza che è possibile rilevare, identificare

e/o quantificare in un campione con la probabilità di un errore β. L’errore

β rappresenta la probabilità che il campione sottoposto ad analisi sia

effettivamente non conforme, sebbene sia stata ottenuta una misura

conforme (decisione di falsa conformità o falsa negativa). Questo

parametro è fondamentale per i metodi di screening in quanto, se una

decisione falsa positiva comporta un’analisi “inutile” di un campione con

metodo di conferma, diversamente una decisione falsa negativa ha come

ripercussione la commercializzazione di prodotti contaminati. La

massima percentuale di errore beta che viene ammessa dalla Decisione

2002/657/CE è il 5%. Per metodi qualitativi, la verifica di tale percentuale

può essere effettuata sulla base dei risultati ottenuti dall’analisi di almeno

venti bianchi-campione fortificati ad un livello pari o superiore al limite di

decisione.

• Robustezza : è la capacità posseduta da un metodo di non essere

influenzato significativamente, in termini di risultati finali, da variazioni

deliberate introdotte nelle sue fasi di effettuazione. Questo parametro

28

serve a qualificare l’affidabilità di una procedura durante il suo utilizzo

routinario o la possibilità di riprodurre il metodo analitico in differenti

laboratori e in tempi diversi, senza una differenza significativa nei

risultati. Sperimentalmente la valutazione della robustezza può essere

ottimizzata mediante l’utilizzo di tecniche di disegno sperimentale, come

suggerito dalla stessa Decisione 2002/657/CE (schema di Youden).

• Specificità : è l’abilità di un metodo di rilevare solo quello che intende

rilevare, ovvero la sua capacità di non risentire della presenza di

interferenti o di altri componenti diversi dagli analiti in esame. Per lo

screening è importante nel determinare la percentuale di campioni falsi

positivi, che, se presenti in misura elevata, vanificano l’utilità dello

screening stesso, costringendo a rianalizzare i campioni sospetti con il

metodo di conferma.

E’ importante sottolineare che, rispetto ai tradizionali parametri “limite di

rilevazione” (LOD) e “limite di quantificazione” (LOQ), la Decisione 657

introduce il CCα e il CCβ, limiti definiti in funzione, rispettivamente, della

probabilità di decisione falsa positiva e negativa. Ciò comporta che, allorquando

si trattino sostanze con un LMR fissato, tali concentrazioni sono determinate a

partire dal LMR e non sulla presenza/assenza dell’analita e quindi non hanno

niente a che vedere con la sensibilità del metodo.

Tra le tecniche di screening più utilizzate, soprattutto nel settore della ricerca di

sostanze ad azione anabolizzante (estrogeni, androgeni, beta-agonisti etc..) ci

sono i metodi immunoenzimatici e, in particolare, l’ELISA.

Scopo di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo della procedura di

preparazione del campione e la validazione, secondo i criteri prescritti dalla

2002/657/CE, di un metodo di screening ELISA per la determinazione di residui

di chinolonici nel tessuto muscolare. Fino ad oggi la ricerca di questa

importante classe di antibiotici prevista dal PNR è stata prevalentemente

effettuata mediante l’utilizzo diretto dello stesso metodo di conferma in HPLC

con rilevazione in fluorescenza. La disponibilità di una procedura di screening

adatta allo scopo offre, quindi, interessanti prospettive nella riduzione dei tempi

di risposta e dei costi analitici.

29

3.2. I test immunoenzimatici ELISA

ELISA è l’acronimo dell’espressione Enzyme Linked Immunosorbent Assay, un

metodo di analisi immunologica usato per rilevare l’eventuale presenza di un

dato antigene in un campione, oppure per misurare la concentrazione di

anticorpi nel plasma sanguigno, come ad esempio nei test per l’AIDS. Il termine

ELISA sta a significare che il dosaggio unisce la specificità della reazione

antigene-anticorpo (reazione immunologica) con la sensibilità di un semplice

dosaggio spettrofotometrico di un enzima. Nell’ambito dei vari metodi

immunoenzimatici, la denominazione ELISA si riferisce esclusivamente ai

sistemi in fase eterogenea, sistemi in cui anticorpi o antigeni sono adsorbiti o

legati ad un substrato solido [XI].

L’Antigene è una molecola che può legarsi ad una specifica immunoglobulina,

grazie ad una struttura specifica detta epitopo . Una singola molecola di

antigene può contenere diversi epitopi riconosciuti da anticorpi differenti.

L’anticorpo (o immunoglobulina ) è una glicoproteina del siero con una

peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a “Y”. Sono costituiti

da una regione costante, comune a tutte le immunoglobuline appartenenti allo

stesso isotipo e una regione variabile che contiene invece il sito di

combinazione con l’antigene e che è quindi variabile a seconda della specificità

dell’anticorpo per un dato antigene. Nell’ambito del sistema immunitario gli

anticorpi hanno la funzione di neutralizzare corpi estranei come virus e batteri,

riconoscendo ogni antigene legato al corpo come un estraneo [XII].

L’ELISA ha una elevata selettività nei confronti degli analiti da determinare.

L’anticorpo, infatti, è in grado di riconoscere specificamente l’antigene che ha

portato alla sua formazione. La costante di affinità per la formazione dei

complessi antigene-anticorpo è estremamente elevata e, benché la reazione sia

di tipo reversibile, l’equilibrio è di gran lunga spostato verso la formazione dei

complessi antigene-anticorpo. La tecnica si basa sul fatto che, con adatti

procedimenti, è possibile coniugare gli anticorpi di un siero con alcuni enzimi

(perossidasi, fosfatasi alcalina, beta-galattosidasi) senza alterarne la capacità di

combinazione con gli antigeni corrispondenti. Gli enzimi utilizzati sono in grado

di catalizzare una reazione su un idoneo substrato (ad esempio la

tetrametilbenzidina) con la formazione di un prodotto terminale colorato che

permette così di evidenziare la quantità di antigene presente.

30

Nei formati commerciali le reazioni vengono, di norma, eseguite all’interno di

pozzetti di polivinile o polistirene (micropiastre da 12 strip da 8 pozzetti

ciascuna per un totale di 96 pozzetti) su cui sono adesi, a seconda dei casi, gli

anticorpi specifici per l’antigene di interesse o l’antigene stesso. All’interno dei

pozzetti vengono incubati i campioni da analizzare (plasma, siero, omogenati

tissutali, latte etc.) e gli opportuni reagenti intervallati da lavaggi atti a rimuovere

i reagenti in eccesso. Per ultimo si aggiunge il substrato che dà origine al

prodotto colorato. La positività è valutata analizzando la comparsa o meno del

colore, in seguito alla reazione catalizzata dall’enzima sul substrato. La tecnica

immunoenzimatica può essere impiegata per la ricerca sia di antigeni che

anticorpi e si presta a numerose variazioni per altrettante applicazioni diverse. I

test ELISA possono essere, infatti, di tipo competitivo o non competitivo

(sandwich) (Figura 7).

31

Figura 7- Rappresentazione schematica di un saggio ELISA tipo sandwich (non competitivo) e competitivo diretto

I saggi tipo sandwich sono generalmente utilizzati per la ricerca di molecole ad

alto peso molecolare, come ad esempio, le proteine. Quando invece gli antigeni

sono molecole a basso peso molecolare, come nel caso della ricerca di residui

di farmaci o ormoni, i saggi sono sempre di tipo competitivo e possono essere a

loro volta ulteriormente classificati in diretti e indiretti. Per i test competitivi,

maggiore è la concentrazione di antigene, minore sarà il numero di

immunocomplessi rilevabili per cui, contrariamente a quanto avviene

generalmente in chimica analitica, esiste una proporzionalità inversa tra il

segnale registrato (assorbanza) e concentrazione.

ELISA competitivo di tipo diretto [XI]

L’anticorpo specifico per l’analita è adsorbito sulla superficie dei pozzetti della

micropiastra. Il campione in esame, nel quale si deve determinare la presenza

dell’analita (antigene libero), e una quantità prefissata di coniugato (antigene

legato all’enzima) vengono depositati nei vari pozzetti. Durante la fase di

incubazione, l’antigene coniugato compete con l’antigene libero,

eventualmente presente nel campione, per i siti di legame degli anticorpi adesi

nei pozzetti. Quindi, il materiale non reagito viene rimosso grazie ad opportuni

lavaggi e la quantità di analita coniugato, legata dagli anticorpi immobilizzati, è

quantificata mediante l’aggiunta di un substrato che forma un prodotto

colorato. La reazione viene arrestata mediante l’aggiunta di una soluzione

acida (stop solution) e la lettura spettrofotometrica è effettuata a 450 nm

(giallo).

ELISA competitivo di tipo indiretto [XX]

In questo caso è l’analita (antigene, X), generalmente legato ad una proteina

carrier come l’albumina di siero bovino, ad essere adsorbito sulla superficie dei

pozzetti. Il campione viene addizionato nei pozzetti e successivamente si

aggiunge una quantità prefissata di anticorpo specifico per l’analita. Durante la

fase di incubazione, gli anticorpi in soluzione si ripartiscono tra l’analita libero

(X), eventualmente presente nel campione in analisi, e l’analita immobilizzato

sulla superficie solida del pozzetto. Tutto ciò che non ha reagito durante

l’incubazione viene successivamente rimosso mediante lavaggi e la quantità di

anticorpo legato all’analita specifico nel pozzetto viene quantificata mediante

aggiunta di un secondo anticorpo enzima-coniugato che si lega al primo. In

32

seguito ad una seconda fase di incubazione e ai lavaggi, si aggiunge il

substrato, si arresta la reazione e si procede alla lettura. Anche in questo caso,

la quantità di colore sviluppatosi risulterà inversamente proporzionale alla

quantità di analita libero nel campione.

Sempre nei saggi competitivi di tipo indiretto, in alcuni casi, nella superficie dei

pozzetti sono adesi, invece che gli antigeni, degli anticorpi in grado di legare

anticorpi anti-antigene (X). Durante l’esecuzione del test, si aggiunge la

soluzione contenente gli anticorpi anti-antigene che si legano agli anticorpi

adesi. Con l’aggiunta simultanea del coniugato e del campione (in cui può

essere eventualmente presente l’analita libero (X) si origina la reazione di

competizione per i siti anticorpali già vista sopra. Lo schema di questo tipo di

saggio è riportato in Figura 8. Si procede infine ai lavaggi e all’aggiunta del

substrato. La reazione viene arrestata mediante una soluzione acida (stop

solution), che muta il colore da blu a giallo e la lettura spettrofotometrica è

effettuata a 450 nm.

Figura 9- Schema di un saggio competitivo indiretto

33

4. BIBLIOGRAFIA

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35

II - PARTE SPERIMENTALE

36

1. Introduzione

Durante le prove di validazione del metodo si sono effettuati esperimenti

utilizzando due differenti procedure di trattamento del campione, di seguito

denominate con A e B. Quindi, nella prima parte dello studio di

ottimizzazione/validazione, sono state eseguite prove ripetute in parallelo su

bianchi-campione e fortificati appartenenti a varie specie animali per verificare

le performances ottenute con i due diversi protocolli. Il metodo A è più semplice

e veloce ed è, tranne per alcune piccole modifiche, sostanzialmente quello

suggerito dal produttore dei test ELISA adottati [I, II], mentre il metodo B è più

lungo e complesso, ma ha il vantaggio di portare a estratti più concentrati e con

meno interferenti [III, IV]. Questo primo gruppo di esperimenti è stato pianificato

per decidere quale fosse il trattamento più adeguato da adottare.

Nella seconda parte dello studio di validazione, si è invece utilizzato il solo

protocollo B ritenuto, in base all’analisi dei dati ottenuti nella prima parte, più

efficace; quindi, si è completata l’indagine sulle caratteristiche di performances

del metodo, utilizzando la procedura più complessa. Tale procedura prevede

un’estrazione, una successiva purificazione in fase liquida (sgrassaggio) e una

in fase solida. Le due parti dello studio di validazione sono schematizzate in

Figura 1 della pagina seguente.

Gli esperimenti sono stati effettuati presso il Laboratorio Residui dell’Istituto

Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, ad eccezione delle

prove eseguite con la procedura di preparazione del campione A, effettuate

presso il Laboratorio di Chimica dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale

dell’Abruzzo e del Molise.

37

I PARTE(SPECIFICITA'/ERRORE BETA)

FLUOROCHINOLONI (EIA)(Generic test)

50 µL in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 µL in doppio

TEST ELISA

ESTRATTO PURIFICATOCON

METODO A

-BIANCHI-CAMPIONE-FORTIFICATI

(acido ossolinico/flumechina)


50 µL in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 µL in doppio

TEST ELISA


METODO B

-BIANCHI-CAMPIONE-FORTIFICATI

(acido ossolinico/flumechina)

STUDIO DI VALIDAZIONE/OTTIMIZZAZIONE


METODO B

II PARTE


50 µL in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 µL in doppio

TEST ELISA

-FORTIFICATI(farmaci non chinoloni)

SPECIFICITA'


50 µL in doppio

TEST ELISA

-FORTIFICATI(diflossacina-saraflossacina)

ERRORE BETA


50 µL in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 µL in doppio

TEST ELISA

FORTIFICATI(acido ossolinico/flumechina)

ROBUSTEZZA

STUDIO DI VALIDAZIONE

Figura 1- Schema del piano di validazione/ottimizza zione

Di seguito sono riportrati entrambi i metodi di trattamento del campione, nonché

le istruzioni per l’esecuzione dei due saggi ELISA.

38

2. Metodo A: preparazione del campione secondo le indicazioni riportate dal produttore dei kit ELISA con piccole modifiche

2.1. Reagenti :

• Acqua ultrapura per HPLC

• Metanolo per HPLC

• Normal esano

• Sample dilution buffer: Pesare 0.97 g di Na2HPO4 · H2O, 0.18 g di KH2PO4,

8.94 g di NaCl in un matraccio da 1 L e portare a volume con H2O

ultrapura per HPLC. Portare a pH=7.4 (7.3-7.5)

2.2. Materiali di riferimento ( standard analitici)

• Standard di acido ossolinico (OXO): Sigma-Aldrich, cod. 00877

• Standard di flumechina (FLU): Sigma-Aldrich, cod. 45735

• Standard di diflossacina (DIF): Sigma-Aldrich, cod. 33984

• Standard di marboflossacina (MAR): Sigma-Aldrich, cod. 34039

2.2.1. Soluzioni Madre dei Materiali di Riferimento

Le soluzioni madre sono conservate a +4°C per tre m esi

• Soluzione Madre di acido ossolinico 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio

idrossido

• Soluzione Madre di flumechina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

• Soluzione Madre di diflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

• Soluzione Madre di marboflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di acido nitrico

Per ciascuna soluzione pesare circa 10 mg di standard in un matraccio tarato

da 100 mL e portare a volume.

39

2.2.2. Soluzione Intermedia dei Materiali di Riferi mento

Soluzione intermedia dei Materiali di Riferimento ( analiti) a 10 µg/mL

La soluzione intermedia è conservata a +4°C per una settimana

Introdurre, mediante pipetta in vetro in un matraccio tarato da 10 mL 1 mL di

ciascuna soluzione madre a 100 µg/mL e portare a volume con Metanolo per

HPLC.

2.2.3. Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferim ento

Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferimento a 1 µg/mL

Con una pipetta da 2 mL prelevare 1 mL della soluzione intermedia a 10 µg/mL

(2.2.2.) degli analiti (flumechina e acido ossolinico) e portare a volume con

Metanolo per HPLC in matraccio tarato da 10 mL.

NB: Le soluzioni di lavoro è preparata di fresco al momento dell’uso.

2.3. Materiali

• Cilindri in vetro

• Imbuti di vetro

• Matracci in vetro

• Pipette tarate in vetro

• Provette in plastica da centrifuga tipo Falcon da 15 e 50 mL

• Puntali per micropipette

• Siringhe tipo Hamilton

• Kit immunoenzimatico: Fluoroquinolones EIA (Euro-Diagnostica cod. ED

21) e Flumequine EIA (Euro-Diagnostica cod. ED 22)

2.4. Apparecchiatura

• Agitatore meccanico: (IKA, KS 501 digital)

• Bilancia analitica 0.00001 g: (Mettler Toledo, XS 105 DU)

40

• Bilancia tecnica, sensibilità 0.01 g: (Ohaus Corporation, Ohaus Explorer)

• Centrifuga: (Hettich Rotina, 46 R)

• Evaporatore a flusso d’azoto: (BUCHI, 461 Buchi)

• Frigorifero (4°C ± 2°C): (Angelantoni Industrie Spa, FCL 400/2 TS)

• Lettore di micropiastre ELISA: (Bio-Rad, 550)

• Ultraturrax: (Janke & Kunkel IKA-LABORTECHNIK, T 25)

• Vortex: (Barloworld Scientific, Vortex Stuart SAS)

2.5. Estrazione

• Pesare circa 1 g (± 0.1 g) di tessuto muscolare precedentemente

omogenato con ultraturrax in falcon di plastica da 50 mL

• Aggiungere 3 mL di soluzione di estrazione (MeOH/Sample dilution buffer

80/20 v/v)

• Vortexare per alcuni secondi

• Porre su agitatore meccanico per 15 minuti

• Centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm

• Prelevare 2 mL di surnatante

• Portare a secco sotto flusso d’azoto a 50°C

• Riprendere il residuo con 1 mL di MeOH/sample dilution buffer 8/92 v/v

• Sgrassare con 1 mL di normal esano

• Centrifugare brevemente e scartare lo strato superiore

• Prelevare 50 µL e diluire con 250 µL di MeOH/sample dilution buffer 8/92

v/v e dispensare sul kit della Flumechina (par. 4. Reazione

immunoenzimatica (analisi ELISA)

• Prelevare altri 50 µL e diluire con 450 µL di MeOH/sample dilution buffer

8/92 v/v e dispensare sul kit dei Fluorochinoloni (par. 4. Reazione

immunoenzimatica (analisi ELISA)

41

3. Metodo B: preparazione del campione con estrazi one e purificazione SPE

3.1. Reagenti

• Acido fosforico 0.025 M a pH=3: Prelevare con pipetta di vetro da 2 mL 1.7

mL di acido ortofosforico 85%, porlo in un matraccio tarato da 1 L, portare

a volume con acqua per HPLC. Miscelare accuratamente e portare a pH 3

con NaOH 10 M.

• Acqua ultrapura per HPLC

• Ammoniaca concentrata al 30%

• Normal esano

• Idrossido di sodio 0.01 M

• Metanolo per HPLC

• Miscela di estrazione: Pesare 1 g di di acido metafosforico e introdurlo in

matraccio tarato da 100 mL. Solubilizzare e quindi portare a volume con

acqua. Prelevare 60 mL della precedente soluzione di MPA 1% (p/v) e

portare a volume con metanolo in matraccio tarato da 100 mL

• Sample dilution buffer: Pesare 0.97 g di Na2HPO4 · H2O, 0.18 g di KH2PO4,

8.94 g di NaCl in un matraccio da 1 L e portare a volume con H2O

ultrapura per HPLC. Portare a pH=7.4 (7.3-7.5).

3.2. Materiali di riferimento ( standard analitici)

• Standard di acido ossolinico (OXO): Sigma-Aldrich, cod. 00877

• Standard di flumechina (FLU): Sigma-Aldrich, cod. 45735

• Standard di diflossacina (DIF): Sigma-Aldrich, cod. 33984

• Standard di marboflossacina (MAR): Sigma-Aldrich, cod. 34039

• Standard di saraflossacina (SAR): Sigma-Aldrich, cod. 33497

3.2.1. Soluzioni Madre dei Materiali di Riferimento

Le soluzioni madre sono conservate a +4°C per tre m esi

42

• Soluzione Madre di acido ossolinico 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio

idrossido

• Soluzione Madre di flumechina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

• Soluzione Madre di diflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

• Soluzione Madre di marboflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di acido nitrico

• Soluzione Madre di saraflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di acido nitrico

Per ciascuna soluzione pesare circa 10 mg di standard in un matraccio tarato

da 100 mL e portare a volume.

3.2.2. Soluzione Intermedia dei Materiali di Riferi mento

Soluzione intermedia dei Materiali di Riferimento ( analiti) a 10 µg/mL

La soluzione intermedia è conservata a +4°C per una settimana

Introdurre, mediante pipetta in vetro in un matraccio tarato da 10mL 1 mL di

ciascuna soluzione madre a 100 µg/mL e portare a volume con Metanolo per

HPLC.

3.2.3. Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferim ento

Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferimento a 0.1 µg/mL

Con una siringa tipo Hamilton prelevare 100 µL della soluzione intermedia a 10

µg/mL (3.2.2.) degli analiti (flumechina e acido ossolinico) e portare a volume

con Metanolo per HPLC in matraccio tarato da 10 mL.

NB: Le soluzioni di lavoro è preparata di fresco al momento dell’uso.

3.3. Materiali

• Colonnine SPE OASIS HLB Waters (30 mg/1 mL)

• Cilindri in vetro

• Filtri idrofili per siringa da 17 mm 0.45 µm

• Imbuti di vetro

43

• Matracci in vetro

• Pipette tarate in vetro

• Provette in plastica da centrifuga tipo Falcon da 15 e 50 mL

• Puntali per micropipette

• Reservoir, adattatore e rubinetti per SPE

• Siringhe tipo Hamilton

• Kit immunoenzimatico: Fluoroquinolones EIA (Euro-Diagnostica cod. ED

21) e Flumequine EIA (Euro-Diagnostica cod. ED 22)

3.4. Apparecchiatura

• Agitatore meccanico: (IKA, KS 501 digital)

• Bagnomaria termostatato: (Heto, HMT 200)

• Bilancia analitica 0.00001 g: (Mettler Toledo, XS 105 DU)

• Bilancia tecnica, sensibilità 0.01 g: (Ohaus Corporation, Ohaus Explorer)

• Centrifuga: (Hettich Rotina, 46 R)

• Evaporatore a flusso d’azoto: (BUCHI, 461 Buchi)

• Frigorifero (4°C ± 2°C): (Angelantoni Industrie Spa, FCL 400/2 TS)

• Lettore di micropiastre ELISA: (Bio-Rad, 550)

• Ultraturrax: (Janke & Kunkel IKA-LABORTECHNIK, T 25)

• Vortex: (Barloworld Scientific, Vortex Stuart SAS)

3.5. Estrazione

• Pesare circa 1 g (± 0.1 g) di tessuto muscolare precedentemente

omogenato con ultraturrax in falcon di plastica da 50 mL

• Aggiungere 4 mL di soluzione di estrazione (soluzione di MPA allo 0.6% in

MeOH/acqua 40/60)

• Vortexare per circa 30 secondi

• Porre su agitatore meccanico per 10 minuti

• Immergere le provette in bagnomaria per 30 minuti a 45°-50°C per favorire

la precipitazione proteica

• Lasciare raffreddare e centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm

• Filtrare il surnatante mediante filtri per siringa da 17 mm 0.45 µm

44

• Ripetere l’estrazione, come sopra, con ulteriori 4 mL di soluzione di

estrazione (soluzione di MPA allo 0.6% in MeOH/acqua 40/60)

• Unire gli estratti

• Vortexare per rimescolare gli estratti

• Prelevare la metà dell’estratto complessivo (circa 4 mL)

• Ridurre sotto flusso d’azoto a 40-50°C il volume de ll’estratto fino a circa 2

mL per garantire la completa eliminazione del metanolo. La fase di

evaporazione del metanolo è critica, poiché la sua incompleta eliminazione

porta ad una perdita degli analiti durante la purificazione SPE

• Alla fine del processo di evaporazione diluire gli estratti con 4 mL di

soluzione acquosa di MPA all’1%

• E’ possibile lasciare i campioni in frigo a +4°C pe r una notte prima di

procedere allo sgrassaggio

• Sgrassare con 3 mL di normal esano

• Vortexare per qualche secondo, centrifugare brevemente, prelevare e

buttare lo strato superiore

• E’ possibile lasciare i campioni in frigo a +4°C pe r una notte prima di

procedere alla purificazione.

3.6. Purificazione SPE

• Posizionare la colonnina OASIS in stazione da vuoto

• Attivare la colonnina con 1 mL di metanolo e seccare, con 1 mL di acqua e

seccare

• Caricare quantitativamente l’estratto diluito

• Scartare l’eluato avendo cura di non far seccare la colonnina

• Lavare la colonnina con 2 mL di acido fosforico 0.025 M (pH=3)/Metanolo

95:5 v/v

• Lavare con 2 mL di acqua

• Far asciugare la colonnina sotto flusso d’aria per circa 15 minuti

• Eluire i chinolonici con 2 mL di Metanolo/NH3 95:5 v/v in provetta di

plastica da 15 mL

• E’ possibile lasciare i campioni in frigo per una notte a +4°C prima di

procedere all’analisi ELISA

45

• Portare a secco sotto flusso di azoto a 50°C

• Riprendere il residuo con 2 mL di Sample diluition buffer diluito

• Vortexare per alcuni minuti

• Seminare 50 µL dei campioni in doppio su ciascuno dei due kit (par. 4.

Reazione immunoenzimatica o analisi ELISA)

4. Reazione immunoenzimatica (analisi ELISA)

4.1. Operazioni preliminari

• Estrarre i kit dal frigorifero almeno un’ora prima dell’esecuzione dei saggi

e porli a temperatura ambiente

All’apertura dei kit effettuare le seguenti operazioni valide per entrambe i kit:

• Ricostituire il coniugato liofilizzato (CAP-HRPO) con 4 mL di tampone di

ricostituzione (dilution buffer). Agitare bene e conservare al buio

• Ricostituire l’anticorpo liofilizzato (antibody) con 4 mL di tampone di

ricostituzione (dilution buffer). Agitare bene e conservare al buio

• Diluire il tampone di lavaggio (rinsing buffer) con acqua secondo le

indicazioni riportate nel libretto di istruzioni allegato al kit in uso (2 mL di

rinsing buffer concentrato con 38 mL d’acqua). Per ogni strip sono

necessari circa 40 mL di tampone di lavaggio diluito. Conservarlo in una

spruzzetta

• Prelevare il numero di pozzetti necessari alla esecuzione del saggio

considerando una semina in doppio sia degli standard che dei campioni, e

riporre immediatamente la piastra in frigorifero.

4.2. Esecuzione del saggio

• Seminare in doppio 100 µL di standard di Flumechina o Norflossacina a 0

ng/mL (bianco)

• Seminare in doppio 50 µL di standard di Flumechina o Norflossacina a 0

ng/mL (segnale massimo B0)

46

• Seminare in doppio 50 µL di standard di Flumechina a 1 ng/mL o

Norflossacina a 1.25 ng/mL forniti dai kit (standard obbligatori)

• Qualora si voglia controllare l’intera curva di taratura, seminare in doppio

50 µL anche degli altri standard di Flumechina o Norflossacina forniti dai

kit, rispettivamente nel range tra 0.1 e 50 ng/mL e nel range tra 0.313 e 10

ng/mL (standard facoltativi)

• Seminare in doppio 50 µL di ciascun campione

• Aggiungere 25 µL del coniugato (CAP-HPRO) a tutti i pozzetti, tranne a

quelli del bianco

• Aggiungere 25 µL dell’anticorpo diluito (Anti-CAP), a tutti i pozzetti, tranne

quelli del bianco

• Agitare leggermente la micropiastra con un movimento rotatorio per alcuni

secondi

• Incubare per 1 ora a temperatura di refrigerazione (4 ± 2°C), al buio

• Scaricare il contenuto dei pozzetti e lavare per 3 volte con il tampone di

lavaggio, eliminando ogni volta i residui capovolgendo energicamente la

piastra su carta assorbente e avendo cura di eliminare completamente il

tampone

• Procedere immediatamente con l’aggiunta di 100 µL di substrato, a tutti i

pozzetti e agitare

• Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (25 ± 2°C)

• Aggiungere 100 µL di soluzione d’arresto (stop solution), a tutte le cuvette

• Leggere immediatamente i valori di assorbanza (OD) a 450 nm.

5. Elaborazione dei dati

Alla media delle assorbanze (optical density, OD) registrate o per un campione

o per uno standard è sottratta la media delle assorbanze del bianco: si ottiene

così una quantità indicata con “B”. Analogamente, alla media delle assorbanze

registrate per il segnale massimo (standard zero) è sottratta la media delle

assorbanze del bianco: si ottiene così una quantità indicata con “B0”.

Quindi si procede ad effettuare il rapporto tra B e B0 moltiplicando per 100:

47

100

ODOD

ODOD%

BB

biancomassimosegnale

biancocampione/dardtans

0

⋅−−

=

6. Studio di validazione

Il piano sperimentale dello studio di validazione è stato approntato in conformità

ai criteri della Decisione della Commissione 2002/657/CE per metodi di

screening qualitativi. Lo schema completo utilizzato durante lo studio è riportato

in Tabella 1.

Tabella 1- Livelli di fortificazione utilizzati nel lo studio di validazione del muscolo in funzione dei parametri determinati

FLUMEQUINE

ELISA GENERIC

FLUOROQUINOLONES ELISA

Parametro N° di

esperi-menti

Tratta-mento FLU

(µg/kg) OXO

(µg/kg) DIF

(µg/kg) SARA (µg/kg)

I PARTE

specificitàa 20 A 0 0 0 0

specificitàa 21 B 0 0 0 0

CCß 20 A 200 50 0 0

CCß 21 B 10 10 0 0

II PARTE

FLUMEQUINE ELISA

GENERIC FLUOROQUINOLONES ELISA

Parametro

N° di esperi-menti

Tratta-mento FLU

(µg/kg) OXO

(µg/kg) DIF

(µg/kg) SARA (µg/kg)

specificitàb 6 B 0 0 0 0

CCß 20 B 10 0 25 0

robustezza 8 B 10 10 0 0

Errore βc 10 B 0 0 0 10 aProve di specificità effettuate su bianchi-campione per la verifica dell’influenza delle sostanze endogene; bProve di specificità effettuate fortificando sei bianchi-campione con sei farmaci veterinari diversi dai chinolonici (sulfadimetossina, ossitetraciclina, nicarbazina, robenidina, dimetridazolo e cloramfenicolo); cProve aggiuntive effettuate su un numero limitato di campioni inferiore a quello minimo richiesto (20).

48

6.1. Curve in tampone

Come ogni sistema di rilevazione strumentale, anche la tecnica ELISA prevede

l’allestimento di curve di taratura. Preliminarmente sono quindi stati seminati,

per entrambi i kit, i sei standard forniti dal produttore, al fine di verificare le

performances dei due prodotti. Per quanto riguarda il kit Generic

fluoroquinolones, gli standard forniti sono di norflossacina alle concentrazioni

progressive di 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5 e 10 ng/mL, mentre per il kit

Flumequine gli standard sono di flumechina alle concentrazioni 0.1, 0.5, 1.5, 10

e 50 ng/mL.

6.2. Prima parte dello studio di validazione

La prima parte dello studio di validazione/ottimizzazione, come

precedentemente accennato, è stata condotta in parallelo testando entrambe le

procedure di preparazione del campione (A e B), al fine di valutare quale

trattamento del campione sia adatto allo scopo di utilizzo del metodo.

6.2.1. Specificità (bianchi-campione)

Sono stati analizzati almeno venti bianchi-campione di tessuto muscolare

rappresentativi delle specie prelevate durante il controllo ufficiale (polli, suini,

bovini, ovi-caprini, pesci). Lo scopo è quello di valutare l’influenza di possibili

interferenze endogene naturalmente presenti in matrice (falsi positivi).

6.2.2. Verifica della percentuale di errore beta (a cido ossolinico e

flumechina)

Almeno venti bianchi-campione sono stati fortificati a livelli di concentrazione

appropriati simultaneamente con flumechina e acido ossolinico. La fortificazione

è avvenuta in parallelo all’esperimento di specificità (6.2.1.). Durante le prove

preliminari, per il kit Generic fluoroquinolones, la scelta della molecola di

chinolone da utilizzare per la verifica delle performances e il relativo livello di

fortificazione sono stati individuati considerando la cross-reattività dell’anticorpo

(Tabella 2), l’LMR fissato a livello comunitario e, non ultima, la procedura di

49

preparazione del campione (A o B).

Tabella 2- Cross- reattività Kit Generic fluoroquinolones (Eurodiagnostica)

Molecola Cross -reattività

Acido ossolinic

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