I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32

Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento e class switch.

Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione), switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo, per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari.

Lez Esercitazioni 19-20 e 26-27 Aprile 2007

Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene pesanti delle Ig umane

Come funziona il controllo “cis” della catena pesante delle Ig

Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma umano e di topo

Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte)

servono da segnale per i fattori ed enzimi per :

- i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico

- la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti sterili) che nella plasmacellula e della memoria

- interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che fungono da secondi messaggeri- con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno

Importanza della regolazione delle Ig

I - interazione col sistema immune nelle funzioni fisiologiche e patologiche

Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione primaria in se (in questo caso le Ig)

Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da questa prima funzione

Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc.

Altri sistemi correlati (snc, digerente …)

Chi dice al linfocita quale “switch” fare

E se lo “switch” è casuale quale è il segnale selettivo per cui nei distinti distretti restano i

linfociti che producono un certo tipo di Ig

Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed effetti della trascrizione delle Ig

Cosa si può chiedereA monte e a valle della trascrizione delle Ig

cosa c’è e quali metafunzioni svolge

Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso nessuno dei due.

Per ora cerchiamo dei possibili esecutori

Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla organizzazione della regione regolatrice e quindi sul genoma direttamente sul locus delle Ig

Forse è un quadro intermedio con responsabilità del settore “risposta umorale”

L’organizzazione genomica

Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14 q32, anche le catene leggere hanno la loro

importanza relativa

Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle catene pesanti

Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo dell’enhancer centrale del complesso regolatore.2 americani ed 1 francese

Il sito delle Ig umane è poco diverso dal topo

Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è presente la duplicazione dei 4 geni delle

regioni costanti Ig3, Ig1, Ig, Ig1

Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR

vedi la figura della mappa del locus

strutture regolatrici delle catene pesanti delle Ig umane

telomero

Chromosome 14q32

enhancer 5’ 3 enhancers 3 enhancers

3 1 2 41 a2

geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili *

V D J *

regione duplicata regione duplicatareg. variab.*

Strutture regolative della trascrizione

Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’Somatic hypermutation (SHM) class switch recombination (CSR)3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene VSequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS) interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (CH) e nelle IgH l’enhancer intronico (iE) L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in linee cellulari con delezioni di iE in cui c’era trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la trascrizione

bibliografiaHenderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, 163-200Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit. 148-163,

Lippincott-Raven, PhiladelphiaStavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, 127-168Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, 165-196Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, 73-80Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,317-345

Chromosome 14

IgH3’EC-2SF AL928742 (40 kb)

H

2

B

HS3

B

U2 U4

U5

B

R3

H

HS1,2

E

R3r U5rU1

R1

U3 U6

U7

U8r

B

U6r

HS4

Ub1 U4-5

R3 U7r

Ub2

B H

R4U9

R5

Ub3

U10

R5

U11

U12

R6

SA2.5 A2R A2F

Alu

U15 U16

H

LTR

END OF HOMOLOGY WITH ALFA1

U14U13

Ub4

H

1

B

HS3

B

U2U4

U5

B

R3

H*

HS1,2

E

R3r U5r

U1R1

Ua1

R2

U3

U6 U7 U8

B

U6r

HS4

B H

Ua2

R4

Ua3

U9 Ua4

R5U10

U11

R5

U12

R6

U13

SA2.5 A2R

Alu

U15 U16

H

LTR

END OF HOMOLOGY WITH ALFA2

K10 retrovirus

ELK2

IgH3’EC-1H

U14

Ua5

A

B

Telomere 3 1 2 41 2

CHR77 (35.616 kb)X76785

Y14407AL928767

AL928765 U64453

Poly A site

Poly A site

Internal spacers

Conserved sequence Unit

Selective amplification of HS1,2-B downstream C2 (IgH3’EC-2)

H

2m

HS 3

B B H

HS 1,2

E B

SA2.5

A2R A2F

HS1,24420 bp

ALLELE 3BP3Frw

HS1,2

D3Rev

EcoRI

ALLELE 4B

Poly A site

HPoly A site

1m

B

HS 3

B B H* B

5402 bp

SA2.5 A2R

HS1,2HS 3

Selective amplification of HS1,2-A downstream C1 (IgH3’EC-1)

ALLELE 1AHS1,2

P3Frw D3Rev

EcoRI

ALLELE 2A

ALLELE 3A

ALLELE 4A

HS 1,2

A B

BE

Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp

Repeated element - 38 bpExternal element -17 bp

EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRI

Ua1

R1 R2

U1 U5

U4U2

U3 R3 rR3

U6 U7

U8 U1 R1

U2

Ub1

UU3 4

U5

U6

R3 R3U8 r

U4-5

U7r R3r

U6r U5r

Ub2

R4

14bp 16bp 20bp

Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)

Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)

ALLELE 1A17bp El. END HS1,2

CORE enhancer

17bp El. 38bp Rp

14bp Sp.

ALLELE 2A16bp Sp.

ALLELE 3A

ALLELE 4A

20bp Sp.

ALLELE 3B

31bp El

ALLELE 4B

Sites for : AP4; E47; MYOD; E5

Sites for : NF-kB (Q6)

Sites for : CMYB

M2M1

ALLELE 1

ALLELE 4ALLELE 3ALLELE 2

G A B G A B

CM11 CM 4 CM 5

G A B

100 bp

400 bp

200 bp

300 bp

A

B

LCR (nel topo 4 enhancers)

IgH3’EC-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)

V D J

human chromosome 14 q 32

HS3 HS1,2 HS4 HS3 HS1,2 HS4

3 1 2 41 a2 telomere

copia 1 copia 2

mouse Ig heavy locus

HS3A HS1,2 HS3B HS4

L C R a b

Chromosome 14

cluster della catena pesante delle Ig

IgH3’EC-2

Telomere 3 1 2 41 2

SF AL928742 (40 kb)

CHR77 (35.616 kb)X76785

Y14407AL928767

AL928765 U64453

IgH3’EC-1

PLASMACELLULE

Cellule B proliferanti

Cellula B attivata (centroblasto)

IL-2; IL-4; IL-5;

IgG2a o IgG3

IgA o IgG2b

IgE o IgG1

IgM

IFN-

IL-4

TNF-

IL-2; IL-4; IL-5;

Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5;

Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-TNF-

Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)

Locus catena leggera

Locus catena leggera

Locus catena pesante

Cromosoma 22

Cromosoma 2

Cromosoma 14

LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig

ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE

CE

LL

UL

E B

VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana

Locus Catene pesanti

Locus Catene leggere

VDJriarrangiato

VJriarrangiato

VJriarrangiato

V-Jprocessing

VDJriarrangiato

V-DJprocessing

D-Jprocessing

VDJriarrangiato. IgM prodotto in membrana.

Lo splicing produce anche

IgD

Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

CE

LL

UL

E B

Locus Catene pesanti

Locus Catene leggere

ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE

VJriarrangiato

VJriarrangiato

VJ riarrangiato Ipermutazioni

somatiche

VJ riarrangiato Ipermutazioni

somatiche

VJ riarrangiato Ipermutazioni

somatiche

PlasmacellulePlasmacelluleCellule MemoriaCellule B attivate

Centrociti

VDJ riarrangiato. Le catene prodotte in

forma di membrana

Switch isotipico a C, C o C. Ipermutazione

somatica

Switch isotipico. Ipermutazione

somatica. Catene pesanti prodotte in

forma di membrana

Switch isotipico. Catene pesanti

prodotte in forma secreta.

VDJ riarrangiato Catene prodotte in forma secreta.

Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

VH DH JH CH

Ricombinazione V(D)J

V(D)J

Risultato dello switch Cricolo exciso

Ricombinazione class switching (CSR)

b a

V(D)J

IgM

IgE

2b

2a

Switch region:

• Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb

• Il filamento non stampo è ricco in G

• S, S ed S hanno un repeat di 5 bp. S ha un repeat di 49 bp.

Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

A B C D FETrascrizione regione S

RNA editing ?

AID? AID?

AID?AID?

CSR ricombinasi?

Riconoscimento delle regioni S accessibili

Formazione di breaks al DNAA

B C D FE

AB C

AB C D FE

AB C

CSR ricombinasi?

Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili

Formazione di strutture secondarie (R loop?)

Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA

Riparazione dei breaks

SSS S c-myc

una regione Sdue regioni S Switch su un altro cromosoma

traslocazioneClass switching recombination

AAA B B E FC

Delezioni intra-switch

Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR).

1 2

La risposta immunitaria cellulo mediata (linfociti T)umorale (non dell’umore)

I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria (immunita’ acquisita) specifica.L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig).Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico.

A che serve lo studio della struttura?

La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la fisiologia.

La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del sistema.

(aforismi)

Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico

I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con la maturazione dei linfociti

Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme

Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali

Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 sub-telomerico) Mappa della catena pesante delle IG

Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad una sequenza costante.

Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica, IgD funzione ancora non del tutto chiara.

V D J

cluster della catena pesante delle immunoglobuline

Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC nell’uomo e nel topo

UOMO

3’5’

LCR-A LCR-

SacII

Eag I Eag I

NaeI

120 Kb 130 Kb180 KbVH j 23 1 2 41

Eag I

NaeI

Eag I

NaeI

MluI MluI350 kb

50 kb

LCR- LCR-B

b a 3’5’

TOPO

LCR

Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento

Confronti in silicio : omologie di strutturaricerca cloni EST

Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione)Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primatiConservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti)

I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione

Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.)

Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig

Studio della diversa funzionalita’

Studio di espressione dei markers della maturazione

Studio della induzione della maturazione e switch in vitro

Finalita’Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig

La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico

Le attivita’ coinvolte in questo modello sono:a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia)b) la proliferazione cellulare (linfomi)c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e

malattie autoimmuni)

Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”. Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????