Valutazione della concentrazione delleimmunoglobuline nel colostro ovino mediantestrumento di routine per l’elettroforesi capillare

C. CENITI1, F. TRIMBOLI1, G. MASSIMINI2, V.M. MORITTU1, T. GIGLIOTTI3,C. CICINO1, D. BRITTI1

1 Dipartimento di Scienze della Salute, Università degli Studi “Magna Græcia” di Catanzaro2 Medico Veterinario Libero Professionista, Ortona (CH)3 Agrotecnico Laureato

INTRODUZIONE

Le differenze di placentazione tra le diverse specie di mam-miferi sono correlate con l’acquisizione dell’immunità passi-va del nascituro1. Nei ruminanti, il tipo di placentazioneostacola il trasferimento degli anticorpi materni e il neonatodeve ingerire il colostro materno per acquisire un’adeguataquantità di immunoglobuline (Ig)2.Negli agnelli, l’intestino consente l’assorbimento delle Ig du-rante le prime 24-48 ore dal parto dopodiché diventa imper-meabile a queste, fenomeno conosciuto come gut closure3. Gliagnelli dovrebbero assumere dai 180 ai 210 mL di colostroper kg di peso corporeo4, tuttavia fattori come età della ma-dre (primipare), gemellarità, ritardo nella somministrazione,durata della suzione, possono influire su qualità/quantità delcolostro assunto dal neonato4,5,6. Se la quantità di colostro in-gerito non è sufficiente, l’allevatore può intervenire sommini-strando colostro congelato o liofilizzato5. Qualora questo nonsia disponibile, un’alternativa è il ricorso a colostro bovinoche, in alcuni casi, potrebbe provocare anemia immuno-me-diata7. Pertanto, nell’allevamento ovino, dove la morbilità emortalità degli agnelli è un problema economicamente rile-vante, il colostro autologo dovrebbe essere la prima scelta. Atal fine, la preparazione di una banca aziendale di colostro di

buona qualità, costituirebbe un valido supporto al manage-ment. La concentrazione di Ig nel colostro è un termine asso-luto per misurarne la qualità ed un metodo che possa stimar-ne in maniera rapida e affidabile il valore al fine di conserva-re per un successivo utilizzo quello di buona qualità, rappre-senterebbe un valido ausilio per gli allevatori.La determinazione della concentrazione di Ig può essere ese-guita con diversi metodi classificati come indiretti e diretti.I metodi indiretti comprendono il colostrometro e il rifratto-metro8,9. I metodi diretti includono l’immunodiffusione ra-diale (RID)10, l’ELISA11 e le tecniche elettroforetiche (PAGE,IEF, CE)11,12. Tra queste ultime, l’elettroforesi capillare (CE) sidistingue per l’alto potere risolutivo delle frazioni proteiche.Scopo del nostro lavoro è valutare l’uso di uno strumentoautomatico di elettroforesi capillare (Minicap, Sebia, France)per la determinazione della qualità del colostro ovino me-diante misurazione della concentrazione di Ig colostrali.

MATERIALI E METODI

Lo studio è stato condotto durante i mesi di Giugno-Luglio2014 su 12 pecore unipare di razza Sarda alla 6ª/7ª lattazio-ne, scelte con criterio casuale nell’ambito di un gregge alle-vato in Provincia di Catanzaro, Calabria, Italia. Due mesi pri-ma del parto, le pecore sono state sottoposte a profilassi vac-cinale per la clostridiosi. Nessun animale è stato sottoposto atrattamenti farmacologici nei mesi precedenti e durante la

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l

Autore per la corrispondenza:Valeria Maria Morittu (morittu@unicz.it).

RIASSUNTOGli agnelli, per la placentazione sindesmocoriale che impedisce l’assorbimento transplacentare di immunoglobuline (Ig) da par-te del feto, dipendono dall’assunzione del colostro materno per la difesa dalle infezioni neonatali. L’adeguata assunzione del co-lostro da parte del neonato diventa pertanto fattore critico per la prevenzione del failure of passive transfert (FPT). Una variabi-le da considerare è la qualità del colostro intesa come quantità adeguata di Ig. I metodi proposti per la sua valutazione sono nu-merosi e tra questi il colostrometro, il rifrattometro, l’immunodiffusione radiale (RID), l’ELISA e le tecniche elettroforetiche(PAGE, IEF, CE). Scopo di questo lavoro è stato determinare la concentrazione di Ig nel colostro ovino mediante uno strumen-to di elettroforesi capillare normalmente utilizzato nell’analisi di routine delle proteine sieriche e urinarie (Minicap Sebia, Fran-cia). Il colostro è stato prelevato da pecore di razza Sarda e il siero per le successive analisi è stato ottenuto per cagliatura. Dueelettroforesi dello stesso siero di colostro, con e senza aggiunta di proteina G coniugata a Sefarosio, sono state confrontate peridentificare il picco di Ig. La concentrazione media di Ig totali, nel siero di colostro ovino, immediatamente dopo il parto (T0) ea 12 e 24 ore dalla nascita (T12 e T24) è risultata uguale rispettivamente a: 9,66 g/dL (± 4,57 g/dL), 5,87 g/dL (± 3,79 g/dL) e 3,19g/dL (± 2,48 g/dL). Questo lavoro è il primo a proporre l’utilizzo di uno strumento di elettroforesi capillare di routine nella va-lutazione della qualità del colostro ovino. Il metodo proposto si è dimostrato semplice, rapido, affidabile e, come tale, utile perla realizzazione di una banca del colostro di buona qualità a supporto del management degli allevamenti.

PAROLE CHIAVEColostro, elettroforesi capillare, immunoglobuline, proteina G coniugata a Sefarosio, immunità.

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ricerca. I campioni di colostro sono stati raccolti tramitemungitura manuale ai seguenti tempi sperimentali: imme-diatamente dopo il parto, a 12 e a 24 ore dal parto (rispetti-vamente T0, T12 e T24). Il sangue dei rispettivi agnelli è statoprelevato prima della suzione del colostro, a 12 e a 24 oredalla nascita (rispettivamente T0, T12 e T24).Dopo il prelievo, i campioni sono stati immediatamente refri-gerati (+4 °C) e portati in laboratorio per le analisi successive.

Preparazione del colostroLa frazione caseinica è stata fatta precipitare addizionando alcolostro 0,1 mg/mL di caglio di capretto in pasta (Calza Cle-mente srl, Italia). Il campione è stato incubato per 15 minu-ti a +37 °C in un bagno termostatico (Pyd System, MPM In-struments s.r.l. Bernareggio-Italia) e quindi con una spatolametallica si è provveduto a rompere la cagliata. Il siero di co-lostro è stato poi filtrato con un filtro per siringa di 0,45 µm(Minisart, Sartorius Stedim Italy S.p.A., Italia) e conservato a-20 °C fino alla raccolta di tutti i campioni.

Raccolta di sangue e preparazioneIl sangue, prelevato dalla vena giugulare degli agnelli, è statotrasferito in provette da siero (Vacuette, Greiner Bio-OneGmbH, Austria). In laboratorio i campioni sono stati centri-fugati a 837g per 10 minuti a temperatura ambiente e il sie-ro ottenuto è stato conservato -20 °C fino alla raccolta di tut-ti i campioni.

Test di laboratorioLe analisi sono state eseguite presso il Laboratorio Analisi Ve-terinarie dell’Università “Magna Græcia” di Catanzaro.a) La concentrazione delle proteine totali (PT) è stata determi-

nata in ogni siero di colostro e di sangue mediante metododel Biureto, utilizzando l’analizzatore automatico Dimen-sion EXL (Siemens Healthcare Diagnostics, Germania).

b) La separazione delle proteine presenti nel siero di colostroe nel siero di agnello è stata effettuata mediante lo stru-mento automatico per elettroforesi capillare (Minicap Se-bia, Francia).

c) Per il riconoscimento del picco di Ig sul tracciato elet-troforetico, ad un campione di siero di colostro (300 µL),sono stati addizionati 250 µL di Gammabind G Sepharo-se (GE Healthcare, Svezia). Il campione è stato incubato a+4 °C su un piano inclinato rotante per una notte, quindicentrifugato a 825g per 5 minuti e analizzato mediante lostrumento automatico per elettroforesi capillare.

Analisi statisticaSono stati calcolati i valori medi e la deviazione standard del-le concentrazioni di PT ed Ig di colostro e siero a T0, T12 e T24.Le medie sono state confrontate mediante test ANOVA a unavia (Sigma Plot versione 12, Systat Software Inc., San JoseCalifornia USA, www.sigmaplot.com) e le differenze tra diesse (p < 0,05) confermate mediante post-test di Tukey.

RISULTATI

Le PT nel siero di colostro e nel siero di agnello sono ripor-tate in Tabella 1. In Figura 1A è mostrato un tipico elettrofe-rogramma ottenuto da siero di colostro ovino (campione L,T24). Il picco corrispondente alle Ig è stato identificato me-diante il confronto degli elettroferogrammi di un campione

di siero di colostro prima e dopo sottrazione delle IgG peraggiunta di Gammabind G Sepharose (GE Healthcare, Sve-zia) (Figura 1B). L’aggiunta di proteina G al siero di colostrocomporta la netta diminuzione (da 1,87 g/dL a 0,73 g/dL) delpicco indicato dalla freccia (Figura 1B).I valori della concentrazione delle Ig presenti nel colostro enel siero sono stati determinati e riportati in Tabella 2.In Figura 2 è illustrata la riduzione di Ig colostrali nelle pri-me 24 ore dal parto (T0 vs T12, p<0,05 e T0 vs T24 p<0,001);andamento inverso è risultato per le concentrazioni delle Igpresenti nel siero degli agnelli (T0 vs T12 e T0 vs T24, p<0,001).

DISCUSSIONE

In questo studio abbiamo utilizzato, per la prima volta nelladeterminazione della concentrazione delle Ig presenti nelsiero di colostro ovino, uno strumento per l’elettroforesi ca-pillare (Minicap Sebia, Francia) normalmente usato nell’a-nalisi di routine delle proteine sieriche e urinarie.L’identificazione del picco corrispondente alla frazione im-munoglobulinica è stata ottenuta mediante sottrazione delleIgG. Come si può notare, osservando il tracciato elettroforeti-co in Figura 1B, a seguito dell’aggiunta della proteina G co-niugata a Sefarosio, si ha un netto decremento del picco checorrisponde alle Ig colostrali. L’aggiunta di proteina G non az-zera il picco di Ig colostrali e questo è spiegabile con la sua ca-pacità di riconoscere e legare solo la frazione costante delleIgG. Dopo la sottrazione, quello che rimane del picco delle Igcolostrali (Figura 1B) potrebbe essere giustificato dalla pre-senza delle sottoclassi di Ig di tipo A e M. Nel colostro, infatti,le Ig di tipo G rappresentano la componente principale (circal’80%) delle Ig totali, ma sono presenti anche basse concen-trazioni di IgA e di IgM11. A nostra conoscenza, non esistonoin bibliografia valori di riferimento della concentrazione di Igcolostrali per la razza Sarda. Infatti, i valori medi di Ig colo-strali al parto dipendono fortemente dalla razza in esame va-riando da un minimo di 6,4 g/dL nelle pecore di razza Ram-bouillet13 fino a 12,5 g/dL nelle pecore di razza Karakoul14. I

Tabella 1 - Concentrazione delle proteine totali colostrali (PT c., ing/dL) e delle proteine totali sieriche (PT s., in g/dL) ai diversi tempisperimentali.

T0 T12 T24

PT c. PT s. PT c. PT s. PT c. PT s.

A 20,4 4,6 9,6 5,1 9,7 5,2

B 22,0 4,1 16,8 6,6 9,4 7,3

C 6,3 4,8 8,3 4,8 3,1 5,0

D 17,2 4,6 17,6 8,9 12,8 8,9

E 14,2 4,4 4,9 7,1 2,9 7,1

F 30,8 4,3 6,9 8,7 4,6 8,7

G 32,0 5,2 23,0 8,2 14,0 8,4

H 16,2 4,7 7,1 8,9 6,8 8,9

I 6,3 4,8 4,5 5,9 3,6 6,4

L 18,0 4,7 11,6 8,5 4,4 8,8

M 24,4 4,8 15,8 5,7 8,7 9,2

N 26,6 4,5 13,4 7,9 8,4 9,6

Media 19,5 4,6 11,6 7,2 7,4 7,8

d.s. 8,3 0,3 5,8 1,5 3,7 1,6

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risultati da noi attenuti (9,6 g/dL) sono intermedi rispetto aquelli delle razze citate. In accordo con precedenti studi3,15 ab-biamo osservato, inoltre, la diminuzione della concentrazionedelle Ig nel colostro ovino durante le prime ore dal parto (Fi-gura 2). Questa diminuzione è risultata statisticamente signi-ficativa (T0 vs T12 p<0,05; T0 vs T24 p<0,001) (Figura 2).Il risultato ottenuto sul siero di agnello, oltre ad aver confer-mato così come descritto da altri Autori3,16 l’aumento delleconcentrazioni di Ig (T0 vs T12 e T0 vsT24, p<0,001) durante le prime 24 oredal parto, ci ha consentito di verifica-re che il picco delle Ig occupa la stes-sa posizione sul tracciato elettrofore-tico di siero di colostro e di siero disangue. Inoltre la concentrazionemedia di Ig negli agnelli a 24 ore dalparto da noi osservata (3,39±1,69g/dL) è in accordo con i valori medidescritti da altri Autori17. In realtà,non esiste un valore di concentrazio-ne di Ig nell’agnello universalmenteaccettato come limite minimo pernon incorrere nel deficit di immu-nità passiva colostrale (FPT). Tutta-via alcuni Autori considerano con-centrazioni di Ig sieriche superiori a0,6-1,6 g/dL come valore soglia al disotto del quale si potrebbe verificareFPT in agnelli di 1 e 2 giorni18;13.

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La metodica da noi descritta è stata utilizzata con successoanche per misurare le Ig sul colostro bovino (dati in corso dipubblicazione).

CONCLUSIONI

I risultati ottenuti nel presente studio dimostrano come unostrumento di elettroforesi capillare, normalmente utilizzatoper l’analisi delle proteine sieriche e urinarie (Minicap Sebia,Francia), sia in grado di separare anche le differenti frazioniproteiche nel siero di colostro ovino e può essere utilizzato,quindi, per misurare la concentrazione di Ig colostrali. A no-stra conoscenza, questa è la prima volta che tale metodica èimpiegata con questa finalità.I metodi ad oggi utilizzati per la valutazione della qualità delcolostro sono diversi. Tra questi vi sono il colostrometro8, lametodica ELISA11, il test RID10 e le tecniche elettroforetiche

Figura 1 - Tracciato elettroforetico di siero di colostro ovino (cam-pione L, T24) prima (A) e dopo (B) l’aggiunta di proteina G coniuga-ta a Sefarosio. La freccia indica il picco individuato di IgG.

A

B

Tabella 2 - Concentrazione delle immunoglobuline colostrali (Ig c.,in g/dL) e delle immunoglobuline sieriche (Ig s., in g/dL) ai diversitempi sperimentali.

T0 T12 T24

Ig c. Ig s. Ig c. Ig s. Ig c. Ig s.

A 11,87 0,05 5,29 0,42 5,17 0,37

B 11,09 0,03 9,80 2,31 3,76 3,11

C 1,56 0,05 2,17 0,67 1,00 0,68

D 6,20 0,06 7,06 4,51 4,83 4,36

E 7,01 0,04 1,58 3,16 0,48 3,00

F 14,48 0,05 3,52 4,30 1,71 4,29

G 16,51 0,05 14,10 3,90 9,20 4,08

H 9,56 0,07 3,43 4,53 2,94 4,41

I 2,35 0,05 1,33 1,16 0,39 1,44

L 10,78 0,05 7,08 4,59 1,87 4,95

M 12,59 0,04 8,52 1,14 3,03 4,84

N 11,94 0,06 6,55 3,56 3,87 5,17

Media 9,66 0,05 5,87 2,85 3,19 3,39

d.s. 4,57 0,01 3,79 1,63 2,48 1,69

Figura 2 - Decremento della concentrazione delle Ig di colostro ovino a 0, 12 e 24 ore dal par-to (T0 vs T12 p<0,05; T0 vs T24 p<0,001). Incremento della concentrazione delle Ig nel siero diagnello a 0, 12 e 24 ore dal parto (T0 vs T12 e T0 vs T24, p<0,001).

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(SDS-PAGE, CE)11,12. Il test RID, sviluppato da Mancini, è at-tualmente il gold standard per la misurazione delle Ig colo-strali, ma richiede un lungo tempo di esecuzione (dalle 18 al-le 24 ore) ed ha un costo di analisi elevato. Il colostrometro èdi facile uso, tuttavia è importante eseguire la determinazio-ne della concentrazione di Ig in un ristretto intervallo di tem-peratura, compreso tra i 20 e i 22 °C8, condizione questa nonsempre riproducibile in stalla. La metodica ELISA richiede di-versi passaggi e, come il test RID, ha lunghi tempi di esecu-zione19. L’elettroforesi capillare ad oggi è stata usata solo perseparare le principali proteine presenti nel siero di colostrobovino, tra cui le Ig, senza fornire però dati quantitativi12.La metodica di elettroforesi capillare da noi proposta rap-presenta una valida alternativa ai metodi utilizzati di normaper la valutazione della qualità colostrale nei ruminanti. Lapreparazione del siero di colostro mediante l’aggiunta di ca-glio è rapida e di facile esecuzione in qualsiasi laboratorio equesto, associato all’automatismo dello strumento proposto,contribuisce alla rapidità della metodica.Il metodo proposto è, a nostro avviso, rapido ed economicoe può essere un utile ausilio nella selezione di colostro conun’alta concentrazione di Ig anche al fine di realizzare unabanca di colostro aziendale. Il colostro autologo e di buonaqualità in un’azienda ovina rappresenterebbe un valido sup-porto per diminuire le perdite di capi dovute a fenomeni diinsufficiente trasferimento passivo colostrale. La metodicaproposta consente, con uno stesso analizzatore automatico enello stesso laboratorio, di accertare in maniera rapida sia laqualità del colostro che il trasferimento passivo colostrale.

RINGRAZIAMENTI

Si ringrazia l’Interregional Research Center for Food Safety& Health ed in particolare il Prof. Vincenzo Mollace per ilcontributo alla presente ricerca.

❚ Evaluation of immunoglobulinconcentrations in ovine colostrumby routinely capillaryelectrophoresis instrument

SUMMARYIntroduction - The best approach to assess the quality of co-lostrum in flock management is still debated.Aim - The aim of this work was to evaluate the use of a rou-tinely capillary electrophoresis instrument to assess the con-centration of immunoglobulins (Igs) in sheep colostrum.Materials and methods - During the summer of 2014, the co-lostrum was sampled from 12 Sarda sheeps (6-7 lactations)immediately after lambing (T0) and at 12 (T12) and 24 (T24)hours post partum. At the same time, the blood samples werecollected from respective lambs. Whey colostrum and serumsamples were analyzed by a capillary electrophoresis instru-ment (Minicap, Sebia France). The Ig peak was determined byaddition of protein G Sepharose coniugate (Gammabind GSepharose) to whey colostrum and subsequent comparison ofelectropherograms before and after Ig subtraction.Results and discussion - Protein G Sepharose addition cau-sed a strong decrement of Ig peak by Ig type G sequestration,identifying the Ig position on the electropherogram. In sheep

whey colostrum, total Igs mean concentration at T0, T12, andT24 was 9.66 g/dL (± 4.57 g/dL), 5.87 g/dL (± 3.79 g/dL), and3.19 g/dL (± 2.48 g/dL), respectively. According to otherAuthors, the comparison of Ig means at different time,showed a statistically significant decrease (T0 vs T12 p<0.05;T0 vs T24 p<0.001). In lamb serum, total Igs mean concentra-tion at T0, T12, and T24 was 0.05 g/dL (± 0.01 g/dL), 2.85 g/dL(± 1.63 g/dL), and 3.39 g/dL (± 1.69 g/dL), respectively. Thelamb serum Igs concentration increase was statistically signi-ficant (T0 vs T12 and T0 vs T24 p<0.001).Conclusions - This is the first work that suggest the use aroutinely capillary electrophoresis instrument in the evalua-tion of the quality of sheep colostrum. Moreover, we confirmthe suitability of this instrument to measure the serum Igsconcentration in suckling lambs to assess passive immunetransfer. In our opinion, the proposed method is simple, ra-pid, reliable, and fit with a purpose of creating a quality co-lostrum bank in flock management.

KEY WORDSColostrum, capillary electrophoresis, immunoglobulin, pro-tein G Sepharose, immunity.

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