HCV. Famiglia: Flavivirus Genoma: RNA (polarità positiva) 9.6 Kb Envelope CLASSIFICAZIONE/CARATTERI...

Famiglia: FlavivirusGenoma: RNA (polarità positiva) 9.6 KbEnvelope

CLASSIFICAZIONE/CARATTERI STRUTTURALI

Anzola M. Journal of Viral Hepatitis 11: 383-393, 2004

ORGANIZZAZIONE GENOMICA

Bersaglio cellulare

• Recettore/i cellulare: • molecola CD81 o il recettore LDL (low

density lipoprotein receptor) presenti sulla cellula epatica (lega E2),

• human scavenger receptor class B type I (SR-BI, also called CLA-1) (lega E2),

• claudin-1 (CLDN1) (lega E2)• molecole di glicosaminoglicani presenti

sulla superficie cellulare (lega E2)

Epidemiologia HCV

• HCV scoperto nel 1989 • HCV principale causa di malattia cronica

epatica nel mondo. Secondo le stime dell’Organizzazione Mondiale della Sanità la prevalenza dell’infezione è di circa il 2%, corrispondente a 200 milioni di persone infettate.

• HCV principale causa di trapianti di fegato nei Paesi sviluppati e la più comune causa di infezioni trasmesse con il sangue.

EpidemiologiaLa prevalenza dell’infezione da HCV riportata dall’OMS è rappresentata

Nonostante l’infezione da HCV sia endemica a livello mondiale, i dati suggeriscono che ci sia variabilità geografica nella sua distribuzione. Le regioni con maggiore prevalenza sono in Africa e in Asia, mentre regioni con prevalenza minore sono tra i Paesi industrializzati del nord America, dell’Europa del nord e occidentale e l’Australia. Nel mondo industrializzato, le regioni con minore sieroprevalenza di HCV sono la Germania (0.6%), il Canada (0.8%), la Francia (1.1%) e l’Australia (1.1%). Una sieroprevalenza bassa, ma leggermente più alta, è evidente negli Stati Uniti (1.8%), Giappone (1.5-2-3%) e Italia (2.2%).

Shepard et al., Lancet Infect Dis. 5:558-67, 2005

Caratteristiche dell’infezione da HCV

Malattia Epatite non-A, non-B Epatite post- trasfusione

Sorgente Sangue e fluidi corporei Contatto sessuale

Trasmissione ParenteralePercutaneaPermucosale

Trasmissione sessuale Si

Infezione cronica Si

Periodo di incubazione 14 – 180 giorni

Carcinogenesi Carcinoma epatocellulare

Cirrosi Si

Gravità della malattiaGeneralmente (70-80%) asintomatica Mortalità nel 4% dei casi

PrevenzioneModificazione delle abitudini di vitaScreening del sangue

Chemioterapia Peginterferone/Ribavirina

TRASMISSIONE

• Gli unici reservoir di HCV conosciuti sono l’uomo e lo scimpanzè. Infatti, il virus è stato identificato per la prima volta nel sangue di scimpanzè. HCV causa l’epatite non-A, non-B e rappresentava la principale causa di epatite post-trasfusionale, prima che il controllo del sangue per la presenza di HCV venisse introdotto nella routine di laboratorio.

L’infezione da HCV è generalmente acquisita in seguito a:

• Uso di droghe per via endovenosa.

• Trasfusione di sangue o trapianto di organi e tessuti.

• Esposizione a sangue e fluidi biologici (rischio occupazionale).

• Al momento del parto dalla madre infetta.

• Rapporti sessuali con una persona infettata.

Storia dell’infezione naturale

Bowen D. and Walzer C.M. Nature 436:946-952, 2005

Sono stati identificati 3 patterns di replicazione acuta e di risposte cellulari virus-specifiche che possono essere predittive della evoluzione dell’infezione primaria

La risoluzione della infezione acuta è associata a: •risposta CD8+ consistente •alti livelli di proliferazione dei linfociti T CD4+ verso più proteine virali, strutturali e non-strutturali.

Infezione acuta evolve in infezione cronica quando:•risposte CD4+ sono generalmente deboli o assenti

Evoluzione Infezione naturale da HCV


Ruolo della risposta immune cellulare nell’esito dell’infezione naturale

…quindi

La memoria immunologia conferita dalla risoluzione spontanea dell’epatite C acuta non protegge contro la re-infezione ma riduce il rischio di persistenza dopo la ri-esposizione al virus.

Ruolo della risposta immune cellulare nell’esito dell’infezione naturale

Risposte anticorpalidurante infezione acuta risolta

Risposte anticorpalidurante infezione acuta che

cronicizza

Ruolo risposte anticorpali

• Le risposte anticorpali virus specifiche, esse sono evidenziabili generalmente 7-8 settimane dopo l’infezione da HCV.

• Vi sono alcuni studi in scimpanzé nei quali è stato dimostrato che l’infettività di HCV può essere neutralizzata in vitro da anticorpi anti-HCV.

• Ci sono studi che indicano che gli anticorpi che si sviluppano durante l’infezione primaria, in realtà, non siano protettivi nei confronti di re-infezione, sia in scimpanzé sia nell’uomo.

• Alcuni studi indicano che la risoluzione benigna dell’infezione possa avvenire anche in assenza di anticorpi anti-HCV, sia in scimpanzé sia nell’uomo.

Storia Infezione naturale da HCV

Ipotesi per spiegare la persistenza dell’infezione da HCV

Evidenze in vivo

• Perdita o assenza di risposte CD4+• Delezione o soppressione delle

risposte CD8+ citotossiche ad opera di cellule regolatorie CD4+ CD25+ (i cui livelli sono elevati in individui con infezione cronica e la cui deplezione in vitro aumenta la frequenza e l’attività dei linfociti CD8+), o ad opera di cellule soppressorie CD8+ produttrici di IL-10. Tutti questi eventi favoriscono l’evasione immune e la persistenza dell’infezione.

Evidenze in vitro

• Alcune proteine virali svolgono un ruolo importante per l’insorgenza di una infezione persistente:

- possono favorire l’insorgenza di “escape mutants” (ad esempio la proteina NS5b, RNA polimerasi RNA-dipendente), svolgere attività immunosoppressiva sulle cellule T, inibire la maturazione delle cellule dendritiche e la loro capacità di presentare l’antigene, e sopprimere l’attività delle cellule natural killer (NK) e la capacità delle cellule NK di attivare le cellule dendritiche.

• Infine, è stato anche postulato che l’infezione virale possa inibire la localizzazione dei linfociti T nel fegato

Fattori virali ed evasione delle difese intracellulari

Gale M and Foyle E.M., Nature 436:939-945, 2005

NS3/4 attenua la risposta antivirale IFN a/b-mediata


Fattori virali ed evasione delle difese intracellulari

Inibizione dell’attività antivirale di IFN a/b(core, NS5A)


Riassumendo………………………

HCV ED EPATOCARCINOMA

Ipotesi per spiegare ruolo infezione HCV ed Epatocarcinoma

• Cirrosi e continua rigenerazione del tessuto epatico contribuiscono ai processi di trasformazione cellulare.

• Alcune proteine virali (quali la proteina del core, e le proteine non strutturali NS3 e NS5A) sono attivamente coinvolte nei processi di oncogenesi.

Hepatocellular carcinoma in a patient with chronic HCV infection. HCV antigens is massively deposited in most neoplastic cells. Staining: polyclonal human anti-HCV antibodies, EnVision (Dako), x200

Proteina del core e oncogenesi

Proteina NS5A e oncogenesi

Infezione da HCV e cofattori

Diversi cofattori sono stati associati con una più veloce progressione della fibrosi epatica tra gli individui HCV positivi, o con una maggiore incidenza di complicazioni associate all’infezione cronica da HCV e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare. Questi cofattori sono l’essere di sesso maschile, l’obesità, la co-infezione con HIV, con il virus dell’epatite B e l’uso di alcol.

Co-Infezione da HCV e HIV• Prima dell’introduzione su larga scala della terapia HAART, la

confezione con HIV era associata ad una rapida progressione della malattia epatica e ad una minore sopravvivenza tra gli individui infettati con HCV. Meno conclusivi sono, invece, i dati relativi all’effetto di HCV sulla storia naturale dell’infezione da HIV.

• Sebbene la terapia HAART non riduca il carico virale di HCV in pazienti coinfettati con HIV, è stato dimostrato che la terapia HAART in pazienti emofilici HIV positivi riduce la mortalità dovuta all’infezione cronica da HCV. Altri studi riportano un ritardo della progressione della fibrosi epatica in pazienti coinfettati e sottoposti a terapia HAART rispetto a soggetti coinfettati e non sottoposti a terapia.

• Nonostante gli effetti benefici della terapia HAART in pazienti confettati, la malattia cronica epatica risulta tra le principali cause di mortalità tra gli individui HIV positivi in terapia HAART. L’infezione da HCV quindi rappresenta un fattore di rischio.

Co-Infezione da HCV e HBV

• I dati relativi alla sieroprevalenza di individui HCV/HBV positivi sono limitati a studi eseguiti in gruppi a rischio (es. pazienti con malattia epatica cronica e utilizzatori di droghe per via endovenosa).

• La coinfezione con HCV e HBV è associata ad una malattia epatica clinicamente e istologicamente molto più grave rispetto a pazienti con epatite cronica causata solo dall’infezione con HCV. Alcuni studi suggeriscono che la confezione HCV/HBV sia significativamente associata con lo sviluppo di carcinoma epatocellulare rispetto all’infezione con i singoli virus, suggerendo quindi un effetto sinergico tra i due virus durante il processo di carcinogenesi del carcinoma epatocellulare.

DIAGNOSI

One Step Hepatitis C (Anti-HCV) Test (Strip and Cassette Format)The One-Step Anti-Hepatitis C (Anti-HCV) Tests are qualitative immunoassays for detecting antibodies in serum that are specific to the Hepatitis C Antigen. Qualitative results in 10-20 minutes High sensitivity and specificity No additional instrumentation or reagents required Qualitative results are easy to read, require no additional instrumentation or reagents, and are determined in 10-20 minutes. The One-Step Anti-Hepatitis C (Anti-HCV) Test is an effective aid in the screening and diagnosis of Hepatitis C infection.

DIAGNOSIHCV genotipi e genotipizzazione

Prevalence of HCV Genotypes in the U.S. and Italy

Genotype NHANES III (MJ Alter 1999) DIONYSOS (Bellentani 1999)

Genotype 1a 56.7% 4.3%

Genotype 1b 17% 42.0%


Genotype 2b 11.4% 0.6%

Genotype 2c 2.5%


Genotype 4 0.9%

Genotype 6 3.2%

TERAPIA

InterferoniIFN alfa 2bRisposta variabile e frequenti recidive - Viremia, genotipo, età, sessoReazioni avverse comuni

Associazione con Ribavirina più efficace

Problemi:efficace solo nel 50-60% dei pazienti trattati l’attuale terapia antivirale è molto costosa, con effetti tossici collateraliResistenze

Dr Md Javed Sobhan, 1998

Cumulative incidence of hepatocelluler carcinoma in a-interferon (IFN-œ) treatment and untreated patients with HCV induced cirrhosis .

Nuovi approcci terapeutici• Le attuali terapie basate sull’uso di interferone sono efficaci solo su

una frazione dei pazienti e, inoltre, presentano fastidiosi effetti collaterali.

• Oltre a ciò, uno dei principali problemi incontrati nello sviluppo di efficaci terapie farmacologiche anti-HCV è rappresentato dall’insorgenza rapida di varianti virali resistenti ai farmaci. Ciò è dovuto principalmente al fatto che il virus replica molto velocemente e la polimerasi di HCV (NS5) non ricopia fedelmente il genoma virale. Si calcola che ciascun nuovo genoma, generato ad ogni ciclo replicativo, presenti almeno una mutazione in un nucleotide. Questo determina, anche negli individui non trattati farmacologicamente, la presenza di una popolazione geneticamente eterogenea di HCV (quasispecie). Il successo clinico di nuovi approcci terapeutici dipenderà quindi dalla capacità del farmaco/i di sopprimere tutte le varianti virali e prevenire l’insorgenza di nuovi virus resistenti.

Nuovi approcci terapeutici.

• Farmaci che inibiscono l’attività della serin-proteasi NS3-4A e della RNA polimerasi NS5B di HCV

• Farmaci ad attività immunomodulatoria (ad esempio agonisti sintetici dei “toll-like receptors”).

• Le molecole che hanno dato i risultati più incoraggianti nei sistemi preclinici sono attualmente in fase di sperimentazione clinica nell’uomo

De Francesco R. and Migliaccio G. Nature 436:953-960, 2005

Vaccino anti-HCV• Il principale ostacolo per lo sviluppo di un vaccino anti-HCV è

rappresentato dal fatto che esiste una notevole variabilità di sequenza tra gli isolati di HCV sia a livello intra-individuale sia inter-individuale, e nelle diverse aree geografiche.

• Le quasispecie sono prevalenti ed evolvono continuamente durante il corso dell’infezione. Inoltre, i correlati di protezione non sono ancora ben identificati.

• Un altro ostacolo da non sottovalutare è rappresentato dal fatto che non esistono sistemi cellulari riproducibili per saggiare l’attività neutralizzante degli anticorpi e per coltivare HCV, e che l’unico modello animale attendibile per valutare l’efficacia di nuovi vaccini è il modello dello scimpanzé.

• Diversi approcci sono in fase di sviluppo e sperimentazione preclinica

Virus dell’epatite E Virus dell’epatite G

HEV e zoonosiHEV e zoonosi

INTRODUZIONEINTRODUZIONE

Caratteristiche dell’HEVCaratteristiche dell’HEV

• Virus sferico 32-34 nm• privo di envelop • genere Hepevirus, famiglia Hepeviridae inizialmente classificato come Calicivirus• RNA + di circa 7.2 Kb lineare poliadenilato• non coltivabile in colture cellulari• non stabile nell’ambiente (inattivato a 5-10°C)• inattivato da disinfettanti a base di iodio• resistente all’inattivazione da parte di acidi e sostanze mediamente alcaline• principale via di trasmissione è oro-fecale

PATOGENESIPATOGENESI

http://yourstdhelp.com/hepatitis-pictures.html

Titolo virale nelle feci 104-107 /mg feci

VIE DI TRASMISSIONE:1.oro-fecale2. food-born3. trasfusioni4. materno-fetale

Manifestazioni cliniche

• Epatite acuta generalmente autolimitante

asintomaticainsufficienza epatica acuta

(mortalità 1-4%; 20% donne gravide) -

DOSE DIPENDENTE

•Sintomi: ittero, anoressia, nausea, vomito

e raramente febbre.

• Periodo di incubazione 3-6 settimane

•Infezione cronica descritta in Francia e

Olanda in pazienti trapiantati

STRUTTURA DI HEVSTRUTTURA DI HEV

Guu et al. PNAS USA 21, 2009

60 proteine capsidiche costituite da tre domini lineari:

• S=costituiscono un involucro continuo (fig. C) • P1=three-fold protrusion (fig. E)- receptor binding sites importanti per il disassemblamento del capside e per l’entrata nella cellula• P2=two-fold spikes (fig. E)-ruolo nell’immunogenicità e nella neutralizzazione del virus-VACCINO?

http://www.microbiologybytes.com/virology/HEV.html

ORGANIZZAZIONE DEL GENOMAORGANIZZAZIONE DEL GENOMA

• 5’ e 3’ UTR (26-68 nt)• 3 ORF parzialmente sovrapposte

• ORF1: proteine non strutturali importanti per la replicazione (metil trasferasi, papain-like cysteine protease, viral RNA elicase, RNA polimerasi RNA dipendente)• ORF2: proteina capsidica altamente conservata, fortemente immunogena.•ORF3: piccola fosfoproteina non strutturale che contribuisce alla replicazione e patogenesi

CLASSIFICAZIONECLASSIFICAZIONE4 genotipi con distribuzioni geografiche diverse :

Genotipo 1 epidemie e infezioni sporadiche in Asia e AfricaGenotipo 2 inizialmente isolato in Messico e successivamente in Africa occidentaleGenotipo 3 USA, Europa, Giappone, Australia e Nuova Zelanda Genotipo 4 Cina, Taiwan, Giappone e Vietnam

I genotipi 3 e 4 sono stati isolati anche negli animali ed in particolar modo MAIALI , CINGHIALI e CERVIDI.

NB. Tutti i genotipi condividono diversi epitopi e quindi appartengono ad un solo sierotipo

HEV-aviare epatosplenomegalia in broiler associata ad alta mortalità. 50% di identità nucleotidica con HEV umani e suini nuovo genere della famiglia Hepeviridae?

Distribuzione geografica dei genotipi di HEV nell’uomo e nel suino (Aggarwal & Sita, Journal of Gastroenterology and Hepatology 24 (2009): 1484–1493)

EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA

Probabilmente la causa più comune di epatite acuta (un terzo della popolazione mondiale infettata)

La prevalenza maggiore si ha nelle popolazioni in via di sviluppo dove le condizioni sanitarie sono precarie

Zone fortemente endemiche: genotipi 1 e 2• Sud-Est Asia >20% delle persone è sieropositiva• Nord Africa e Medio oriente sieroprevalenza > 25% in Egitto e 17% in Arabia Saudita• Messico e Sud America > 30%

Zone non endemiche: genotipi 3 e 4• Europa 1-3%• Nord America 2%

ZONE IPERENDEMICHEZONE IPERENDEMICHE

• Epidemie frequenti con coinvolgimento di diverse migliaia di persone

• Genotipi 1 e 2

• Generalmente correlate al consumo di acqua contaminata da feci (spesso conseguenti ad alluvioni o catastrofi naturali ) NO food-born

• Trasmissione uomo-uomo insignificante

• Vengono colpiti prevalentemente giovani adulti (15-45 anni) e maggiormente gli uomini delle donne, basso tasso di mortalità

• Alta mortalità per le donne in gravidanza (2°-3° trimestre)

ZONE NON ENDEMICHEZONE NON ENDEMICHE

• Casi sporadici non epidemie

• Conseguenti a viaggi nelle zone iper-endemiche, genotipo 1 e 2

• Infezioni “autoctone” dovute ai genotipi 3 e 4, associabili al consumo di carni poco cotte o alla vicinanza con animali

•Alta prevalenza in alcuni gruppi di persone: allevatori, veterinari, macellai

• Età >50 anni e più uomini che donne

• Donne in gravidanza raramente infette

• Occasionalmente osservate: epatite fulminante in persone già affette da altre patologie e cronicizzazione in persone immunocompromesse

Confermate (→), sospette (→) e potenziali ( ) vie di trasmissione di HEV nei paesi sviluppati (Dalton et al., The Lancet 8 (2008): 698-708)

HEV nelle zone non endemiche HEV nelle zone non endemiche -ZOONOSI-ZOONOSI-

• HEV presente in suini, cinghiali, cervidi, manguste e bivalvi • NO genotipi 1 e 2 SOLO genotipo 3 e 4• Ab anti-HEV rilevati in numerose altre specie animali : gatti, cani, bovini, capre, cavalli, asini, ratti e topi

trasmissione per diretto contatto con animali

trasmissione attraverso il consumo di cibo di origine animale

Infezione per diretto contatto Infezione per diretto contatto con animali infetticon animali infetti

Meng et al., 2002: 26% dei veterinari testati erano positivi per HEV antigene vs il 16% dei donatori di sangue che non lavoravano a contatto con gli animali

Colson et al., 2007: infezione acquisita durante esercitazioni in clinica chirurgica su suini

Galiana et al., 2008: positività HEV nel 18.8% delle persone esposte a l contatto con i suini vs 4.1% delle persone non esposte.

Pourpongporn et al., 2009: positività per HEV nel 23.3% in allevatori vs 16.7% in persone di altro mestiere

HEV nelle carni vendute al dettaglio HEV nelle carni vendute al dettaglio GIAPPONEYazaky et al., 2003: 2% fegati venduti al dettaglio positivi ad HEV, sequenza strettamente correlata a quella dei casi umani.

OLANDABouwknegt et al., 2007: 6.5% dei fegati venduti al dettaglio positivi per HEV gt3 con 97% di similitudine con sequenze di HEV causa di patologia nell’uomo.

UK Banks et al., 2007: nessuna positività per HEV in 80 macellerie al dettaglio.

USAFeagins et al., 2007: 11% dei fegati positivi per HEV, inoculati in maiali sono risultati infettivi

CANADALeblanc et al., 2010: 32.5% dei suini positivi per HEV al macello (linfonodi, vescica, fegato, bile, feci, tonsille, plasma NO nel muscolo)

Infezioni da HEV conseguenti ad Infezioni da HEV conseguenti ad assunzione di carne infettaassunzione di carne infetta

Tei et al., 2003: prima evidenza diretta in food-born transmission- infezione da HEV in 2 famiglie giapponesi conseguente all’assunzione di carne cruda di cervo. RNA del virus presente nella carne identico a quello presente nelle feci dei pazienti

Tamada et al., 2004; Li et al., 2005; Shimizu et al., 2006: Infezioni da HEV conseguente all’assunzione di carne di cinghiale poco cotta.

Wichmann et al., 2008: infezione da HEV acquisita attraverso il consumo di frattaglie e carne di cinghiale poco cotta

HEV e vacciniHEV e vaccini

Vaccino ricombinante prodotto in cellule di

Spodoptera frugiperda infettate con un

baculovirus contenente una sequenza troncata

del gene codificante l’antigene capsidico

EFFICACIA E SICUREZZA

• 1794 soggetti: 898 sottoposti al vaccino e 896 con

placebo

• efficacia della somministrazione di 3 e 2 dosi (0, 1 e

6 mesi)

• valutazione degli effetti avversi

• follow-up di circa 800 giorni

• Dopo la 3A somministrazione 3/898 con vaccino e

66/896 con il placebo hanno contratto l’epatite →

efficacia del vaccino 95.5%

• efficacia dell’86% con solo 2 somministrazioni

• Nessun effetto avverso significativo

LIMITI DELLO STUDIO •Dopo il follow-up il 44% delle persone che aveva ricevuto le 3 dosi presentava un titolo anticorpale al di sotto del limite di detection

• Gruppo di studio troppo omogeneo 99% uomini età media 25 anni NO donne in gravidanza, bambini e persone con problemi epatici cronici

•Costoso

Proteina capsidica di HEV troncata ed espressa in

cellule Escherichia coli purificata ed adsorbita su

idrossido di alluminio e diluita in soluzione salina

2009

EFFICACIA E SICUREZZA

• 612 soggetti: 457 vaccino (3 diversi dosaggi e 2 o 3

somministrazioni), 151 controlli

• soggetti tra i 16 e i 55 anni

• valutazione degli effetti avversi

• Follow-up a 0, 1, 6, 7 e 13 mesi

• vaccino ben tollerato

• 100% di sieroconversione dopo 1 mese dalla terza

somministrazione (20 µg mesi 0, 1 e 6)

• 3 dosi significativamente più immunogene di 2

• 88.7% di efficacia del vaccino dopo 3 x 20 µg (tutte

infezioni asintomatiche)

• FASE III in corso

Virus dell’epatite G

Virus GB FlavivirusVirus con env: sensibile ai detergenti1-2% di positivita’ nei donatori di sangue (PCR)Dati di rilevazione della prevalenza indicano che

circa 85% superano l’infezionecirca 15% rimane portatore

Trasmissione via parenteraleReplica nei linfociti B e TMeccanismo di sviluppo epatite è sconosciuto10-20% epatiti non A-ESignificato clinico sconosciuto

• TTV

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