GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Giancarlo Parenti.

GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI

Giancarlo Parenti

Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe)

Frequenza: 1: 40.000

Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA)

Autophagy

Phagocytosis

Exocytosis

Autophagosome

exocytosis

endocytosis

Primary lysosomes

Secondary lysosomes

Residual bodies

Early endosome

Late endosome

Endoplasmic reticulum

Golgi apparatus




Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA

Eterogeneità genetica:272 mutazioni del gene GAA finora descritte(http://www.pompecenter.nl)

mutazione





Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in:

cuore muscolo scheletrico fegato

Malattia di Pompe




Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in:

cuore muscolo scheletrico fegato

Malattia di Pompe

Variabilità clinica:

Primi segni

Età, anni

Supporto ventilatorio

Deficit motori, Sedia a rotelle

10 20 30

Esordio precoce: classica infantile, non classica

Esordio tardivo: seconda infanzia, giovanile, adulta

exitusPrimi segni

Età, mesi1 12

Recombinant human -glucosidase from rabbit milk in Pompe patients

Hannerieke Van den Hout, Arnold JJ Reuser, Arnold G Vulto, M Christa Loonen, Adri Cromme-Dijkhuis, Ans T Van der Ploeg

THE LANCET . Vol 356 . July 29, 2000

Malattia di Pompe

Terapia enzimatica sostitutiva

therapy (weeks)

200

400

600

800

LV

MI

(g/m

2 )

6 12 18 24 360 32

Terapia enzimatica sostitutiva nella malattia di Pompe

problemi

Effetto variabile nelle forme tardive

Scarsa efficacia sulle fibre muscolari tipo II

In modelli animali sono richieste dosi molto alte (100 mg/kg/infusione) negli stati avanzati di malattia

Per funzionare un enzima deve avere una struttura (“folding”) corretta

Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici


Un enzima deve maturare correttamente

Autophagy

Phagocytosis

Exocytosis

Autophagosome

exocytosis

endocytosis

Primary lysosomes

Secondary lysosomes

Residual bodies

Early endosome

Late endosome

Endoplasmic reticulum

Golgi apparatus


Un enzima deve funzionare nel posto giusto


Gli chaperones migliorano il “folding” di un enzima mutato

Gli chaperones migliorano la maturazione dell’enzima

Gli chaperones migliorano il traffico dell’enzima verso la sede corretta

Il miglioramento del “folding”, della maturazione e del “trafficking” si traducono in un aumento dell’attività residua


N-butyl deoxynojirimycin (NB-DNJ)

Deoxynojirimycin (DNJ)

Both compounds are inhibitors of glycosidases and glycosyltransferases NB-DNJ is used as substrate reducing agent in Gaucher disease

IC50 for -glucosidase0.38 M (DNJ) and 1.9 M (NB-DNJ) (Andersson et al, 2004)

OH

CH2OH

OH

OH

NH

CH3

OH

CH2OH

OH

OH

N

Pazienti studiati

Pt fenotipo mutazione DNA

mutazione proteina

1 Infantilenon-classico (INC)

1655 C>T 1655 C>T

L552PL552P

2 Infantilenon-classico (INC)

1655 C>Tc.-35C>A

L552PSplicing anomalo

3 Giovanile (J) 1655 C>T1333G>C

L552PA445P

4 Giovanile(J) 1645G>Cc.692+1G>C

G549RSplicing anomalo

5 Giovanile(J) 1064T>C1064T>C

L355PL355P

6 Giovanile(J) c.-45T>Gunknown

Splicing anomalosconosciuta

7 Infantile classico (IC)

1124G>T1124G>T

R375LR375L

8 Infantile classico (IC)

n.a. n.a


Attività

2

GA

A a

cti

vity

(n

mo

les

4-M

U l

ibe

rate

d/m

g p

rote

in/h

r)

GAA activity in fibroblasts from Pompe patients

3

1

4

untreated Control values

58.5 + 28.1

PatientPhenotypeGenotype

1

INC

L552P

L552P

2

INC

L552P

abn splic

3

J

L552P

A445P

4

J

G549R

abn splic

5

J

L355P

L355P

8

IC

n.a.

6

J

abn splic

unknown

7

IC

R375L

R375L



1

INC

L552P

L552P

2

INC

L552P

abn splic

3

J

L552P

A445P

4

J

G549R

abn splic

5

J

L355P

L355P

8

IC

n.a.

6

J

abn splic

unknown

7

IC

R375L

R375L

+ NB-DNJ

+ DNJ


58.5 + 28.1

2

GA

A a

cti

vity

(n

mo

les

4-M

U l

ibe

rate

d/m

g p

rote

in/h

r)

3

1

4



1

INC

L552P

L552P

2

INC

L552P

abn splic

3

J

L552P

A445P

4

J

G549R

abn splic

5

J

L355P

L355P

8

IC

n.a.

6

J

abn splic

unknown

7

IC

R375L

R375L

+ NB-DNJ

+ DNJ


58.5 + 28.1

2

GA

A a

cti

vity

(n

mo

les

4-M

U l

ibe

rate

d/m

g p

rote

in/h

r)

3

1

4

p<0.001

p<0.001

p<0.004

p<0.019

p<0.002

p<0.010

p<0.002

p<0.008


Maturazione

Patient 1 4 7 contr

Phenotype NCI J CI

Genotype L552P/L552P G549R/abn splicing

R375L/R375L

NB-DNJ - + - + - + -110 kDa

70-76 kDa

-actin

Western blot analysis

fibroblasts

110 kDa

70-76 kDa

-actin

95 kDa

HEK293T 293 w.t. L552P G549R A445P R375L

NB-DNJ - - - + - + - + - +


“Trafficking”

a

b

c

m. di Pompe

normale

GAA

m. di Pompe+chaperone

a

b

c

d

e

f

m. di Pompe

normale

GAA LAMP2


a

b

c

d

e

f

g

h

i

m. di Pompe

normale

GAA LAMP2 Merge


Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario

Mutazione Fenotipo Aumento attivita’

Effetto sullamaturazione

L552P intermedio + +G549R lieve + +A445P severo - +L355P severo - -R375L severo - -

Y455F lieve + +P545L intermedio + +

S529V lieve + +E521K severo - -M519T severo - +

Pazienti studiati

21


Pazienti studiati

Aumento attivita’ % Nessun

aumento %

21 5 23.8 16 76.2


Conclusioni

Due farmaci (DNJ e NB-DNJ) migliorano l’attività enzimatica della GAA

Per il momento sono disponibili solo dati in vitro, cioè in cellule di laboratorio

L’effetto positivo dei farmaci si osserva solo in cellule di pazienti con specifiche mutazioni del gene GAA

Questi risultati potrebbero indicare un possibile trattamento alternativo alla terapia enzimatica sostitutiva almeno in alcuni pazienti

Programma di ricerca futuro

Valutazione in vivo

Identificazione di mutazioni responsive al trattamento con chaperones

Uso combinato di terapia enzimatica sostitutiva e chaperones

Alfredo Zuppaldi

Rosaria Tuzzi

Katia Porto

Generoso Andria

Giancarlo Parenti

Francesca Donaudy

Barbara Rossi

Monica Cardone

Ida Annunziata

Germana Meroni

Andrea Ballabio

Giancarlo Parenti

25

50

75

100

e.v. w.t. Am10

Am03

Am04

Am05

Am06

Am07

Am08

Am09

552 549 529 445 375 521 519

GA

A a

ctiv

ity

(nm

ole

s 4-

MU

lib

erat

ed/m

g p

rote

in/h

r)

untreated

+ DNJ

Mutations expressed at the Dept of Pediatrics - Tigem

Pharmacological enhancement of mutated -Glucosidase in fibroblasts from Patients with Pompe Disease

Expression of single mutations in HEK293T

182231

286318

359399

442480

517546

585 680730

778827

882933

952630

140 233 398 470 652 882 925

110 kDa intracellular membrane bound

110 kDa secreted

95-76 kDa

70 kDaactive site

Glycosylation sites

aa position at exon boundaries

76 kDa

S529V

182231

286318

359399

442480

517546

585 680730

778827

882933

952630

140 233 398 470 652 882 925 Glycosylation sites

aa position at exon boundaries

G549R

L552P

Imino sugar treatment in Pompe disease Summary

P549L

Y455F

Catalytic sitered non-responsive mutations

green responsive mutations

GAA model structure

FUGUE Sequence-structure homology recognition / SWISS MODEL

Lysosomal storage diseases in which pharmacological chaperone effects have been

demonstrated

Disease Enzyme deficiency Reference

Fabry disease -galactosidase A Fan et al, 1999

Asano et al, 2000 Frustaci et al, 2001

GM1 gangliosidosis

-galactosidase Matsuda et al, 2003

GM2

gangliosidosis-hexosaminidase Tropak et al, 2004

Gaucher disease

-glucosidase Sawkar et al, 2005

ERT (20 mg/kg/week) in a Pompe KO mouseRaben et al, 2003

GAA activity(nmol/mg/hr)

% normal Glycogen clearance %

Muscle 0.7 +/- 0.1 9.7 38

Heart 3.8 +/- 0.3 32.5 95

Liver 493.0 +/- 27.1 2464.0 75

GAA activity(nmol/mg/hr)

% normal Glycogen clearance %

Muscle 2.5 +/- 0.3 32.6 74

Heart 9.4 +/- 1.4 99.0 98

Liver 559.0 +/- 13.7 2798.0 98

ERT (100 mg/kg/week) in a Pompe KO mouseRaben et al, 2003

Messenger RNA

ribosome Endoplasmic reticulum membrane

MisfoldingCorrect folding and assembly

lumen protein Molecular chaperones

Wild type protein

mutant protein

3’ 5’

Golgi apparatus

lysosome

Degradation

Enzyme enhancement by pharmacological chaperones

Endoplasmic reticulum membrane

Messenger RNA

ribosome

MisfoldingCorrect folding and assembly

lumen protein Molecular chaperones

Wild type protein

mutant protein

3’ 5’

Golgi apparatus

lysosome lysosome

Golgi apparatusDegradation

Pharmacological chaperone

Enzyme enhancement by pharmacological chaperones

Range of plasma concentrations in Gaucher patients treated with NB-DNJ (Cox et al, 2000)

2

3

4

5

NB-DNJ concentration (M)

0 10 20 30 50 80

1

Time (days)

0 3 6 9 13 15

Effects of NB-DNJ concentrations and time course of GAA enhancement

GA

A a

cti

vity

(n

mo

les

4-M

U l

ibe

rate

d/m

g p

rote

in/h

r)

Gli chaperones migliorano il “folding” delle proteine


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