Giuseppe Servillo Dip. Di Medicina Clinica e Sperimentale ... · EPIGENETICA Comporta modificazioni...
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Università degli Studi di PERUGIA
EPIGENETICAEPIGENETICA
Giuseppe ServilloGiuseppe ServilloDip. Di Medicina Clinica e SperimentaleDip. Di Medicina Clinica e Sperimentale
Università di PerugiaUniversità di Perugia
EPIGENETICA
Definizioni: Definizioni:
�La branca della biologia che studia le interazioni causali fra i geni e il loro prodotto cellulare per determinare il fenotipo.C.H.Waddington(1942)
� Studio dei cambiamenti ereditabili nell'espressione genica ereditabili nell'espressione genica che si manifestano indipendentemente dai cambiamenti nella sequenza del DNA
EPIGENETICA
Comporta modificazioni a livello della cromatina che:
� Non modificano la struttura primaria del DNA
� Possono essere ereditabili
� Influenzano l'accessibilità del DNA, regolando
l'attivazione e l'inibizione di determinati geni
Le cellule staminali embrionali (ES) sono capaci di differenziarsiin tutti i tipi cellulari (totipotenza)
Epigenetica e Differenti Aspetti della Vita
• Sviluppo di organismi multicellulari
• Interazioni Ambiente-organismo• Interazioni Ambiente-organismo
Per esempio: Nutrizione e ambiente (eventi fisici,
biologici e chimici)
• Patogenesi di malattia
IMPRINTING
L’espressione di una piccola
minoranza di geni, nei minoranza di geni, nei
mammiferi, è determinata dalla
propria origine parentale
L'imprinting è un meccanismo
genetico importante per:
� trasferimento di sostanze
nutritive dalla madre al fetonutritive dalla madre al feto
� crescita nel grembo materno e
comportamento dopo la
nascita
� imprinting aberrante causa
svariate sindromi
IMPRINTING
Durante il ciclo vitale di un Durante il ciclo vitale di un
organismo l'imprinting varia
passando per tre fasi:
� Cancellazione
� Impianto� Impianto
� Manutenzione
CROMATINA
� Eucromatina, trascrizionalmente attiva
� Eterocromatina� Eterocromatina
� Costitutiva, trascrizionalmente inattiva
� Facoltativa, trascritta in alcune fasi della vita
dell'organismo
CROMATINA
Le differenze strutturali tra i due stati della cromatina
sono dovuti:
� Diversa interazione tra DNA linker e istone H1
� Diverso stato di acetilazione degli istoni
� Metilazione degli istoni
� Ubiquitinazione
� Sumolazione
NUCLEOSOMI
Il nucleosoma è l'unità fondamentale della cromatina,
costituito da un core di istoni intorno al quale si avvolge
il DNA, tra due nucleosomi vi è un tratto di DNA
denominato DNA linker
NucleosomiNucleosomi • Otto molecole istoniche
formano un ottameroottamero
– 2 molecole di H2AH2A
– 2 molecole di H2BH2B
– 2 molecole di H3H3– 2 molecole di H3H3
– 2 molecole di H4H4
• 146 bp di DNA
arrotolate intorno
all'ottamero
•• Istone H1Istone H1
– Stabilizza il DNA
negli e tra gli
ottameri
ISTONI
Sono proteine basicheSono proteine basiche
utilizzate per compattare il
DNA, vengono suddivise in due
classi:
� H2A, H2B, H3 E H4, H2A, H2B, H3 E H4,
formano strutture
ottameriche
� H1, stabilizza il nucleosoma
ESPRESSIONEGENICA
Processo attraverso il quale l’informazione codificata da un
particolare gene è decodificata in proteinaparticolare gene è decodificata in proteina
La regolazione dell'espressione
genica serve per:
� Sviluppo embrionale
� Differenziamento cellulare e
tessutale
CpG ISLAND
o Regioni di DNA di 0,5-5 kb
o Ricche di GC (60%)
o Localizzate a livello del promotore (50% dei geni)
Nonostante la stabilità del nucleosoma e dell’alto grado di compattezza nel nucleo la cromatina è sorprendentemente dinamica.
Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle
Dinamicità della cromatina
Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità della cellula di regolare i processi biologici dall’espressione genica, alla riparazione del DNA, alla replicazione e ricombinazione.
Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre.
Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione del nucleosoma.
Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.
•Acetilazione: implicata nella regolazione dell’espressione genica. Interessa le LISINE (K).
•Metilazione: associata a differenti funzioni cromatiniche e alla regolazione della trascrizione. Interessa le ARGININE e le LISINE (R
Tipi di modificazione istoniche
regolazione della trascrizione. Interessa le ARGININE e le LISINE (R e K).
•Fosforilazione: coinvolta nella regolazione della trascrizione, nei processi di riparo del DNA e nella condensazione cromosomica durante la mitosi. Interessa le SERINE (S).
•Ubiquitinazione: critica per i processi di mitosi e di meiosi. Interessa le LISINE (K).le LISINE (K).
•poli(ADP)Ribosilazione:associata a varie funzioni cromatiniche(condensazione e decondensazione), principalmente al rilevamento di danni al DNA, ma anche ad altre funzioni genomiche. Interessa le GLUTAMINE (E).
Conseguenze funzionali delle modificazioni istoniche
•Le modificazioni non influenzano la stabilità del core nucleosomale, ma alterano solamente la carica elettrostatica delle code N-terminali. Ciò modifica le proprietà strutturali dell’istone o il suo legame al DNA.
•Si crea un meccanismo che altera la struttura della cromatina, la cui conseguenza è una modificazione dello stato trascrizionale (“on-off”) oppure la definizione di strutture cromosomali di ordine superiore.superiore.
•Modificazioni transitorie e quindi reversibili.
H3R2 K4 K9 S10 K14 R17 K18 K23 R26 K27 S28
Modificazioni covalenti delle code ammino-terminali
K79
H2A
H4
H2B
S1 R3 K5 K8 K12 K16 K20
K9K5 K119
S1 E3 K12 K15 K20 K24 K120
Metilazione Acetilazione Fosforilazione
Ubiquitinazione
METILAZIONE DEL DNA
� Effettuata da DNA-metiltrasferasi DNMT:
• De novo: DNMT3a, DMNT3b;• De novo: DNMT3a, DMNT3b;
• Di mantenimento: DNMT1;
� Il donatore di metili è S-adenosil metionina SAM
METILAZIONE DEL DNA
� Avviene soprattutto nei CpG:
� CpG island;� CpG island;
� CpG island shore;
� Esoni;
� Sequenze ripetute.
� Riconosciuta da proteine MBD.
� Azione variabile:� Azione variabile:
� Silenziamento;
� Efficienza della trascrizione;
� Stabilità cromosomica.
MODIFICAZIONE DEGLI ISTONI
� Gli istoni più interessati sono H3 e H4;
� Possono essere modificati da:� Possono essere modificati da:
o Acetiltrasferasi HAT e deacetilasi HDAC = gruppo acetile
o Metiltrasferasi = gruppi metile
o Chinasi = gruppi fosfato
MODIFICAZIONE DEGLI ISTONI
� L’acetilazione degli istoni regola la trascrizione genica;
� La metilazione è variamente associata a:
• Eterocromatina, es H3 K9me;
• Eucromatina, es H3 K4me.
CODICE ISTONICO
RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA
� Effettuato da complessi con attività ATPasica:ATPasica:
� SWI/SNF;
� ISWI;
� CHD;
� INO80.
� Permettono scivolamento e rimozione � Permettono scivolamento e rimozione dei nucleosomi.
CROSS-TALK
� I meccanismi epigenetici funzionano in maniera coordinata, esempi:
• Metilazione degli istoni e metilazione del DNA;
• Metilazione del DNA e acetilazione degli istoni;
• Reclutamento dei complessi di rimodellamento della cromatina.
Scopo:
PROGETTO EPIGENOMA
� Produrre mappe dettagliate di:
• Metilazione del DNA,
• Modificazione degli istoni,
• Posizione dei nucleosomi;
� Identificare marker di cellule sane e malate;
� Rendere i dati disponibili gratuitamente;
� Migliorare le tecnologie e abbassarne i costi.
mammalsFive kingdom
system(Haeckel, 1879)
animals invertebrates
vertebrates
plants
animals
monera
fungi
protistsprotozoa
invertebrates
Page 516
Tree of life from David Hillis’ lab (based on ~3000 rRNAs)
animalsplants
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http://www.zo.utexas.edu/faculty/antisense/Download.html
fungi
protists
bacteriaarchaea
Noi Siamo quì
Tree of life from David Hillis’ lab (based on ~3000 rRNAs)
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Cos'è il genoma?
• Il genoma è l'intero patrimonio genetico di un orga nismo vivente. Si può paragonare ad un'enorme enciclopedia in cui sono contenute le istruzioni che regolano lo sviluppo e il contenute le istruzioni che regolano lo sviluppo e il funzionamento dell'organismo
• Il genoma è "scritto" in un composto chimico chiama to DNA (DeoxyriboNucleic Acid, acido desossiribonucleico)
• Il DNA è identico per tutte le cellule di un individuo ed è contenuto nel nucleo
1976: first viral genomeFiers et al. sequence bacteriophage MS2 (3,569 base pairs,Accession NC_001417).
Chronology of genome sequencing projects
Accession NC_001417).
1977:Sanger et al. sequence bacteriophage φX174.This virus is 5,386 base pairs (encoding 11 genes).See accession J02482; NC_001422.
1981Human mitochondrial genome16,500 base pairs (encodes 13 proteins, 2 rRNA, 22 tRNA)
Chronology of genome sequencing projects
16,500 base pairs (encodes 13 proteins, 2 rRNA, 22 tRNA)Today (10/09), over 1800 mitochondrial genomes sequenced
1986Chloroplast genome 156,000 base pairs (most are 120 kb to 200 kb)
1995: first genome of a free-living organism,the bacterium Haemophilus influenzae
Chronology of genome sequencing projects
1996: first eukaryotic genome
The complete genome sequence of the budding yeast
Chronology of genome sequencing projects
The complete genome sequence of the budding yeastSaccharomyces cerevisiae was reported. We willdescribe this genome soon.
Also in 1996, TIGR reported the sequence of the firstarchaeal genome, Methanococcus jannaschii.
1997:More bacteria and archaeaEscherichia coli
Chronology of genome sequencing projects
Escherichia coli4.6 megabases, 4200 proteins (38% of unknown function)
1998: first multicellular organismNematode Caenorhabditis elegans97 Mb; 19,000 genes.
1999: first human chromosomeChromosome 22 (49 Mb, 673 genes)
2000:Fruitfly Drosophila melanogaster (13,000 genes)
Chronology of genome sequencing projects
Plant Arabidopsis thaliana
Human chromosome 21
2001: draft sequence of the human genome(public consortium and Celera Genomics)(public consortium and Celera Genomics)
• La grandezza totale del genoma umano aploide è di 3.070.000.000 basi di cui 2.843.000.000 sono di basi di cui 2.843.000.000 sono di eucromatina
1 245,203,898 218,712,898
2 243,315,028 237,043,673
3 199,411,731 193,607,218
4 191,610,523 186,580,523
5 180,967,295 177,524,972
6 170,740,541 166,880,540
7 158,431,299 154,546,299
8 145,908,738 141,694,337
9 134,505,819 115,187,714
10 135,480,874 130,710,865
11 134,978,784 130,709,420
12 133,464,434 129,328,332
13 114,151,656 95,511,656
14 105,311,216 87,191,216
15 100,114,055 81,117,055
16 89,995,999 79,890,791
17 81,691,216 77,480,855
18 77,753,510 74,534,531
19 63,790,860 55,780,86019 63,790,860 55,780,860
20 63,644,868 59,424,990
21 46,976,537 33,924,742
22 49,476,972 34,352,051
X 152,634,166 147,686,664
Y 50,961,097 22,761,097
Human Genome Human Genome
Genes
(exons)
1.5-2 %
CNCs
1-3%
1.5-2 %
sea3093
95.0%
CNC= conserved non coding sequences
Il metodo Sanger
Nel sequenziamento a terminazione di catena nella reazione serve:
• uno stampo a singola elica
• un innesco specifico della reazione di sequenza (primer)
• la sintesi della catena con un dNTP* marcato, di solito con 35S
• miscela di ddNTP (A,C,G,T), uno per ogni reazione di sequenza• miscela di ddNTP (A,C,G,T), uno per ogni reazione di sequenza
5’- A T C T T T T A G A G T A C C3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
PRIMER DNA Polimerasi
Sintesi del filamento marcato
5’- A T C T T T T A G A G T A C C T G A G* A G A T G A T A G * A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
DNA Polimerasi
PRIMER
La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegueindefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro
distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossi nucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento
perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
Terminazione della catena
perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G A G A T G A T A G A
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
DNA Polimerasi
PRIMER
+ ddNTP ( per es. ddATP)
STOP
5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G A G A T G A T A G A T G T ddA
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni dATP
ddATPddATP
ddATPddATP
ddATPddATP
DNA stampo asingola elica
3’-GGCTAAC
3’-GGCTAAC5’ 3’
Ibridazione con
Il primer
+
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
+[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Sequenasi
ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP
-CCG ddA -ddC-C ddC
-CC ddG-CCGATT ddG
-CCGA ddT
-CCGAT ddTA C G T
-CCGATT ddG
Sequenza: 5’-CCGATTG
-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC
-ddC
GT
TAGCC Direzione di
lettura
4 Coloranti - 1 Corsia
Unica reazione ed unica corsa;
Sequenziamento automatico
Ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione:
ddATP
ddTTP
ddGTP
ddCTP
Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa
ddCTP
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggioe caricare il tutto in un solo pozzetto di gel
ddA
ddT
ddC
ddT
ddG
Metodi di Marcatura
� Marcatura dei Primers
primers progettati con “tag” colorati a:
Sequenziamento automatico
primers progettati con “tag” colorati a:
Fluorescenza UV
Fluorescenza IR minore Background
maggiore Sensibilità
� Marcatura dei Terminatori� Marcatura dei Terminatori
ddNTPs marcati con fluorofori o differenti coloranti
Terminatori BigDye
Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker
Sequenziamento automatico
accettore e donatore legati da un linker
Vantaggi:
Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità maggiore, facilità interpretativa per A e G
attigue D Aattigue D A
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore
diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
OMICS is a general term for a broad discipline of science and engineering for analyzing the interactions of biological information objects in various omes.
The Proteome is the totality of proteins (expressed genes) in an organism, tissue type or cell, and proteomics is now well-established as a term for studying the proteome. Interactome is the study of molecular interactions in a holistic fashion. The Glycome is the total list of sugar (carbohydrate) molecules in an organism, and glycomics (sometimes glycobiology) has become an established term.Ligandome is the whole set of ligands in biological cells, tissues or species. The Transcriptome is the mRNA complement of an entire organism, tissue type, or cell; the associated field is Transcriptomics; The Metabolome is the totality of metabolites in an organism; the associated field is metabolomics; The Metabolome is the totality of metabolites in an organism; the associated field is metabolomics; The Lipidome is the totality of lipids; the associated field is Lipidomics; *The Localizome. The whole set of localization information of protein domains and proteins. The Spliceome (see spliceosome) is the totality of the alternative splicing protein isoforms; the associated field is spliceomics. Textome: The body of scientific literature which can be analysed by text mining. Textomics: The study of the textome. Kinome: The totality of protein kinases in a cell. Kinomics: The study of the kinome. Publications exist. * Glycosilome: Related to glycosylation. Glycosilomics: The associated field of study. Physiome: Related to physiology. Physiomics: The associated field of study. MetabolomeNeurome: The complete neural makeup of an organism. Something a neurobiologist might be heard to say in the Neurome: The complete neural makeup of an organism. Something a neurobiologist might be heard to say in the future. Neuromics: The study of the neurome. See Neurome.ORGPatentome (Patentomics): The whole set of sequences and structured patented. Predictome: A complete set of predictions. Reactionome : The complete set of biological reactions in cells, biological tissues or organisms. Reactome: A Knowledgebase of Biological Processes. Sociome and sociomics: a proposed new name for sociology. Econome: an economy (see economics).Epigenomics:
DNARNA PROTEINA
Trascrizione Traduzione
SplicingmiRNA
Trascrizione Traduzione
Modificazioni post-traduzionali
• Acetilazione, • Metilazione• Fosforilazione• Fosforilazione• Glicosilazione (enzimatica)• Glicazione (non enzimatica)• Nitrazione/denitrazione• Cleavage• Tagging
La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei proteomi completi, mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine.
Le tre domande più importanti della proteomica sono :
1) Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto?
2) Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse (network)?
3) Come appare una particolare proteina (struttura)?
• Valutazione di marcatori diagnostici in fluidi corporei
• Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione
SCOPO DELL’APPROCCIO PROTEOMICO
• Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione
di nuovi target proteici per trattamenti farmacologici e
“drug profiling”
• Studi di tossicità
• Glicosilazioni, fosforilazioni o processamenti proteici
• Analisi tissutali in situazioni patologiche
Tools of proteomics
�Database
�Mass spectrometry
�Softwares�Softwares
�Analytical protein-separation technology
TECNOLOGIA LEGATA ALLA PROTEOMICA
• Elettroforesi bidimensionale
• Rilevazione degli “spot” proteici
• Analisi di immagine
• Excisione degli “spot” proteici
• Digestione enzimatica
• Spettrometria di massa
• Bioinformatica