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Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

La struttura della cromatina

Istoni e nucleosomi


La cromatina• Il DNA all’interno del nucleo eucariotico è associato

a delle proteine. Il complesso DNA-proteina si chiama cromatina.

• Se nuclei interfasici vengono sospesi in una soluzione a bassa forza ionica, si rigonfiano e si rompono rilasciando le fibre di cromatina.

• In alcune regioni, le fibre sono altamente condensate.• In altre regioni le fibre hanno una struttura più estesa,

e si può vedere che sono formate da particelle discrete: i nucleosomi.

• In regioni di struttura particolarmente estesa, si vedono i nucleosomi uniti da un sottile filamento: una doppia elica di DNA.

• Una doppia elica ininterrotta di DNA collega tra di loro una lunga serie di particelle nucleosomiche.

• I singoli nucleosomi possono essere ottenuti trattando la cromatina (in maniera molto prolungata) con una endonucleasi, che degrada il filamenti di DNA tra unnucleosoma e l’altro. I singoli nucleosomi appaiono come delle particelle compatte.


I nucleosomi• Ogni nucleosoma contiene 200 paia di basi di DNA

associate ad un complesso di 8 proteine chiamate istoni:– due copie di H2A, H2B, H3 e H4.

• Gli istoni H3 ed H4 sono tra le proteine più conservate che si conoscano

– ciò suggerisce che hanno la stessa funzione• Forme diverse dell’istone H1 esistono nei diversi tessuti

di uno stesso organismo e c’è molta variabilità tra le specie (nel lievito è addirittura assente).

• La quantità di H1 presente nel nucleo è la metà di quella di uno degli altri istoni e H1 può essere estratto facilmente dalla cromatina.

Tutto l’istone H1 può essere rimosso senza alterare la struttura del nucleosoma, il che suggerisce che si trova all’esterno della particella. Il nucleosoma ha la forma di un cilindro alto 6 nm, con un diametro di 11 nm ed una circonferenza di 34 nm. Il DNA associato al nucleosoma ha una lunghezza di 67 nm (2 volte il diametro): il DNA fa due giri attorno all’ottamero. Il DNA si associa e lascia il nucleosoma in due punti vicini uno all’altro: sito di legame dell’istone H1.


La struttura dei nucleosomi

• Dei 6 nm di altezza del cilindro, 4 sono occupati dai due avvolgimenti di DNA (200 paia di basi).

• Ci vogliono 80 paia di basi per fare ungiro attorno all’ottamero– due regioni di DNA che siano separate di

80 paia di basi nella doppia elica insoluzione si trovano invece una vicina all’altra sulla superficie del nucleosoma

• conseguenze funzionali


Il DNA è associato ai nucleosomi in maniera compatta

• Frazionamento su gradiente di saccarosio dimostra che monomeri, dimeri ecc. di istoni legati al DNA: nel nucleo c’è ben poco DNA libero tra unistone e l’altro.

• La scaletta è considerata prova che il DNA è associato a istoni

• Più del 90% del DNA delnucleo è assemblato su istoni

Se il DNA fosse associato all’ottamero in maniera blanda una breve digestione con la nucleasi produrrebbe tutti frammenti da 200 paia di basi.

Invece si genera una scaletta–multipli di 200 paia di basi


La struttura proteicadel nucleosoma

• Gli istoni non sono proteine globulari, ma sono interdigitati gli uni negli altri.

• Le parti N-terminali degli istoni non sono ben definite nella struttura cristallografica.

• Però queste regioni sono importanti perchè vengono modificate reversibilmente.– metilazione ed

acetilazione avvengono durante la fase S


L’organizzazione dei nucleosomi nella fibra di cromatina

• E’ una fila continua di nucleosomi.• Si ottiene in condizioni di bassa forza ionica e non

necessita della presenza dell’istone H1.• Non è chiaro se questo genere di struttura esiste in vivo

(nel nucleo della cellula) oppure se si genera in vitrocome conseguenza della procedura di estrazione della cromatina.

Quando la cromatina è analizzata al microscopio elettronico si possono osservare due tipi di fibre:quella da 10 nm e quella da 30 nm (in funzione deldiametro della fibra).

La fibra da 10 nm


La fibra da 30 nm • In condizioni di maggiore forza ionica lacromatina appare come una fibra da 30 nm.

• Per ottenere questa struttura è necessaria lapresenza dell’istone H1.

• La fibra si avvolge su se stessa, con una periodicità di 6 nucleosomi per ogni giro, che corrisponde ad un rapporto di condensazione di 40

• La fibra da 30 nm è la struttura di base sia della cromatina interfasica che di quella mitotica.

Probabilmente loorientamento dei nucleosomi allo interno della fibra èquello del solenoide: inucleosomi sono ruotati di60° uno rispetto all’altro.L’istone H1 è probabilmente localizzato all’interno.Non conosciamo in dettaglio le strutture di ordine superiorein cui la fibra da 30 nm si organizza nel nucleo interfasicoe nel cromosoma mitotico.


I geni trascritti dalla RNA polimerasi sono associati a nucleosomi?

• Un esempio classico sono i geni per l’RNA ribosomale che formano delle strutture chiamate “alberi di Natale”.

• La lunghezza misurata del segmento di DNAtrascritto (l’asse del cosiddetto “albero di Natale”) è circa 85% di quella calcolata sulla base della struttura a doppia elica: ciò vuol dire che il DNA è quasi completamente in forma estesa.

• Il minicromosoma del virus SV40 può essere estratto da cellule infettate in fase di attiva trascrizione, ed è complessato con nucleosomi.Ovviamente, il minicromosoma di SV40 ètrascritto con una frequenza inferiore rispetto ai geni per l’RNA ribosomale.

Il DNA trascritto in maniera estremamente intensa sembra essere in conformazione molto estesa (troppo, per essere associato a nucleosomi).


Come fa la RNA polimerasi a trascrivere un gene se è associato a nucleosomi?

• La RNA polimerasi II è un complesso di molte subunità con un peso molecolare di >500 kD– più grande del nucleosoma

• Il DNA fa due giri attorno alnucleosoma

• La polimerasi lega 50 paia di basi,aprendone 12

• Ci deve essere qualche forma di riarrangiamento

• Probabilmente il nucleosoma è spiazzato temporaneamente dal passaggio della polimerasi, ma si riforma subito dopo.


Endonucleasi di restrizione

• Ogni molecola di DNA può essere tagliata inpunti precisi, e la distanza tra i punti di taglio può essere determinata in maniera accurata. Itagli specifici avvengono grazie alla capacità che hanno le endonucleasi di restrizione di riconoscere corte sequenze di DNA come siti bersaglio.

• Quando il DNA viene trattato con un enzima di restrizione, è tagliato in una serie di frammenti discreti. Questi frammenti possono essere separati in base alla loro taglia tramite elettroforesi.

• Il DNA così tagliato viene messo all’estremità di un gel fatto di agarosio o di poliacrilammide.

• Quando viene applicato al gel un campo elettrico, ogni frammento si muove verso il polo positivo con una velocità che è inversamente proporzionale al logaritmo del suo peso molecolare. Questo movimento produce una serie di bande. Ogni banda corrisponde ad un frammento di taglia discreta.


Siti suscettibili alla DNAasi• Sono

caratteristici di regioni del DNAparticolarmente attive

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