Genomica e modelli animalidi malattie umane

Mariateresa Mancuso

BIOTEC-MED

I giovedì della cultura scientificaI giovedì della cultura scientifica““Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica”Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica”

Piccole dimensioni:

facile da

manipolare, bassi

costi di

mantenimento

Similarità

fisiologica e

genetica con

l’uomo

Alto tasso di Alto tasso di

fertilità: progenie fertilità: progenie

multipla ottenibile multipla ottenibile

ogni 9 settimane ogni 9 settimane

Mus Musculus : organismo modello nella ricerca biomedica

Organismo Organismo

complessocomplesso

Confronto tra il genoma del topo e dell’uomo

14% più piccolo (2.5 bilioni di basi versus 2.9)

Entrambi contengono circa 30.000 geni codificanti proteineEntrambi contengono circa 30.000 geni codificanti proteine

80% dei geni in omologia80% dei geni in omologia

Il genoma del topo è facilmente manipolabile

> 90% di sintenia

350 regioni conservate

Topo UomoCromosomi di topo Cromosomi umani

TOPI INBRED

Accoppiamento tra Accoppiamento tra fratello-sorella per 20-fratello-sorella per 20-

30 generazioni 30 generazioni successivesuccessive

98.6% di omozigosi a tutti i loci Minima variabilità genetica in una popolazione Possibilità di fissare uno specifico fenotipo

Suscettibilità o resistenza

allo sviluppo di tumori spontanei

La suscettibilità e/o la resistenza all’insorgenza di un particolare tumore

può essere ottenuta tramite un programma di accoppiamento selettivo

bidirezionale mediante applicazione di un protocollo di cancerogenesi

chimica a due stadi

Selezione genetica delle linee Car-S e Car-R

F0

Car -R (F16 )Car -S (F1 9)

A D BA /2 P SWR SJL C B A BA L B /c C57BL/ 6

F 1 F 1 F 1 F 1

F 2 F 2

DMBA-TPA-

Basse dosi

DMBA-TPA-

Alte dosi

Differenza in termini di suscettibilità > di 100 volte

Alcuni geni coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza sono stati identificati

Mutazioni multiple casuali introdotte nella linea germinale mediante l’utilizzo di cancerogeni chimici permettono di

identificare singole mutazioni responsabili dell’insorgenza di un determinato fenotipo

…primi tentativi di manipolazione genetica del genoma murino

Primo modello animale utilizzato per studi quantitativi e meccanicistici dell’induzione di neoplasie intestinali

Topi Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) Min (Multiple intestinal neoplasia)

Ottenuti mediante mutagenesi germinale con ENU

C57Bl/6

Adenocarcinomi intestinali

Fenotipo primario trasmesso alla progenie

Poliposi adenomatosa familiare

Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino

Apc

Mutazione Min

Mutazione eterozigote del gene APC

(oncosoppressore)

Topi Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) Min (Multiple intestinal neoplasia)

Ottenuti mediante mutagenesi germinale con ENU

C57Bl/6

Adenocarcinomi intestinali

Fenotipo primario trasmesso alla progenie

Poliposi adenomatosa familiare

Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino

Apc

Mutazione Min

Mutazione eterozigote del gene APC

(oncosoppressore)

Impossibilità di controllare i geni bersaglio da modificare

Necessità di vasti programmi di allevamento

Difficoltà di identificare i fenotipi recessivi

Lo sviluppo delle nuove metodologie per manipolare il genoma murino

ha rivoluzionato la capacità di generare modelli animali di malattie

umane

Animali geneticamente modificati

Knockout

patologie dovute ad assenza di funzione

Transgenici

patologie dovute ad alterazione di funzione

Promotore ATG

P(A)

Gene/cDNA di interesse

TOPI FONDATORI

Il modello che meglio rappresenta la malattia umana deve essere selezionato osservando la progenie di vari topi fondatori

Possono differire per numero di copie inserite (2-50)Effetto posizionaleAlterazione dell’espressione di un gene endogeno

TOPI TRANSGENICI Patologie dovute ad alterazione di funzione

Femmina balia

Microiniezione

In grado di trasmettere il carattere per via ereditaria

Analisi del DNA

Neo

Costrutto

TOPI KNOCKOUT Patologie dovute ad assenza di funzione

Selezione delle cellule KO mediante trattamento

con la neomicina

Microiniezione

Knockout omozigote(-/-) Impianto in

una femmina

balia

Chimera

Knockout eterozigote

(+/-)

L’assenza di funzione di un gene è

spesso incompatibile con la vita

Cellule ES

ElettropolazioneRicombinazione

Cellula ES con

un gene mutato

La speranza è che il topo mutante esibisca

sintomi simili ai soggetti umani e che la

patogenesi sia simile in entrambe le specie

Studiare gli stadi precoci prima della comparsa dei

sintomi

Possibilità di individuare in vivo i bersagli di

farmaci in via

di sperimentazione

Malattie metaboliche e ormonali Fibrosi cisticaIpercolesterolemia familiareArteriosclerosi

KK,TK

CftrLdlrFmr1

Malattie immunologiche ed ematologicheEmofilia ATalessemia Talessemia

KKK

C/8HbaHbb

Malattie della vista e dell’uditoRetinite pigmentosaDegenerazioni della retina

TT

RhoPrph2

Disfunzioni della cresta neuraleAlbinismo oculocutaneoSindrome di Waardenburg

TK

TyrMitf mi

Malattie neurologiche e neuromuscolariMorbo di AlzheimerAtaxia telangiectasiaSindrome X fragile

K,TKK

AppAtmFmr1

Sindromi familiari di predisposizione al tumore

Retinoblastoma familiarePoliposi adenomatasa del colonSindrome di Li-fraumeniSindrome di Gorlin

KKKK

RbApcp53Ptch

Sono centinaia i modelli animali di malattie umane a carattere

monogenico attualmente disponibili

SINDROME DI GORLIN

Predisposizione alla tumorigenesi spontanea e

radioindotta

Medulloblastoma (10%)

Sarcomi

Fibromi ovarici

Basalioma (dopo irraggiamento)

Malattia ereditaria autosomica dominante con una incidenza stimata pari a 1/50.000-150.000. Difetto costituzionale in una delle due copie di un gene soppressore tumorale (Patched1)

BASALIOMA

MEDULLOBLASTOMA

RI Identificazione e caratterizzazione molecolare delle lesioni preneoplastiche Dipendenza dall’età al momento dell’irraggiamento Possibilità di identificare la cellula bersaglio Sperimentare terapie farmacologiche e geniche

Numerose anomalie nello sviluppo

Ritardo mentaleCrescita eccessiva del corpo

Ptch1 -/- letale

Ptch1 +/-

fenocopia della sindrome di Gorlin

Cre è una ricombinasi sito-specifica che

riconosce la sequenza lox P del fago P1.

Quando due siti lox P vengono inseriti nel

DNA, la proteina Cre promuove la

rimozione del frammento di DNA

compreso tra i lox P.

Questa strategia viene utilizzata per produrre modelli knockout condizionali in cui è possibile accendere o spegnere

l’espressione di un gene in un determinato tipo cellulare.Estremamente vantaggiosa quando sono coinvolti geni la cui

mutazione risulterebbe letale.

Incrociando un topo che porta il gene di

interesse, fiancheggiato da due sequenze lox P,

con uno in cui il gene Cre si trova sotto il

controllo di un promotore tessuto-specifico, si

ottiene un organismo in cui il gene verrà rimosso

solo nelle cellule che esprimono Cre.

TOPI KNOCKOUT CONDIZIONALI: il sistema Cre/lox P

Nel 50% dei casi di tumore mammario familiare sono state riscontrate mutazioni del gene Brca1.

La mancanza di Brca1 causa una

precoce mortalità embrionale

Mutante condizionale in cui si determina la rimozione dell’esone 11 di Brca1 solo nelle cellule epiteliali

del tessuto mammario

Tumore mammarioBassa frequenzaLunga latenza

Quali altri geni sono coinvolti nello sviluppo del tumore mammario ?

Mutanti condizionali per Brca1 e p53 +/- : il 73% sviluppa il tumore

La perdita di p53 accelera lo sviluppo tumorale delle ghiandole mammarie di topi che presentano una specifica delezione di

Brca1

MUTANTI CONDIZIONALI PER LO STUDIO DEL TUMORE MAMMARIO

CONCLUSIONI

La progressione della malattia può essere seguita in ambiente altamente controllato

Ci permettono di studiare la malattia in numerosi individui con un background omogeneo.

Anche quando il modello animale non ricapitola pienamente la malattia umana, può comunque fornire importanti indicazioni delle differenze interspecifiche e della suscettibilità individuale

Disporre di un modello animale premette di testare l’azione di nuovi farmaci e pone le basi per una possibile terapia genica

Malattie a carattere poligenico: obiettivo primario nel futuro della ricerca biomedica

Come fareste senza di me?