corso di Genomica a.a. 2010-2011lezione 37-38

• laurea magistrale Biotecnologia Industriale

giovedì 27 Gennaio 2011

aula 6Aorario : Martedì ore 14.00 - 16.00

Giovedì ore 13.00 - 15.00

D. Frezza

Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 MarzoLezioni fino al 10 Febbraio

Mouse Igh cluster Chromosome 12

Human Igh cluster Chromosome 14

12F1

14q32.33

mta1

mta1

JDV

JDV

mta1 crip2

crip1

hole

mta1 crip2

crip1

hole

a

b

J D V

J D V

elk 2.1

hs4 hs1.2

hs3 20bp 1

3’1

hole

elk 2.2

hs4 hs1.2

hs320bp2

3’2

hs 4

hs

3B hs 1,2

hs 3A

hs 4

hs 1,2

hs 3

hs 4

hs 1,2

hs 3

3’2 3’1

BAC199M11(AF450245)

86,035,000

86,040,000

86,045,000

86,050,000

86,055,000

86,065,000

86,070,000

86,075,000

86,060,000

85,894,500

85,904,500

85,914,500

85,924,500

85,934,500

85,944,500

85,954,500

centromero telomero

trascrizione

IgH3’RR-1

IgH3’RR-2

(cloni instabili)

cluster Ig topo-uomo (duplicazione)

TOR VERGATA

Tra topo ed uomo qualcosa cambia ma gli enhancers sono gli stessiCambia l’architettura, ma non il tipo di funzione

- c’è stata una duplicazione, ma i geni (o esoni) delle regioni costanti sono gli stessi, ci sono due catene “alfa” e nel topo ce ne è una sola,

- ci sono due regioni regolative con 3 enhancers anziché 4 - resta la regione palindromica

Differenti strutture: cosa cambia?

se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ?

3 domande + 1:

è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ?

nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si allevano male)

- dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ?

- hanno tempi di attivazione diversi?

perchè due 3’RR ? sono ridondanti ?

- si attivano e disattivano in fasi diverse della vita del linfocita B?

TOR VERGATAU

QuickTime™ e undecompressore TIFF (LZW)

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Confronti RR nei mammiferi

Palindrome interna duplicazione umana

duplicazione ma anche inversione dx - sin (speculare)

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Confronto specie RR palindrome

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Panda 13584bp rabbit 14657 mouse 31827 dog 19442

La palindrome servirà a qualcosa ?

Stiamo cercando strutture secondarie 3D

Ex-post : se c’è servirà

Ma in che modo? dalla struttura alla funzione

Topi transgenici deleti: delezione completa e delezioni parziali

palindrome 3’RR

TOR VERGATA

solo HS1.2 è polimorfica

gli enhancer HS3 ed HS4 non sono polimorfici

HS1.2 è centrale e sta all’interno di una duplicazione

non si conosce molto delle funzioni al di là delle regioni conservate contenenti gli enhancers

le regioni intermedie sono poco conservate nelle specie anche all’interno dei mammiferi

è possibile studiare le assoociazioni nell’uomo tra polimorfismi, funzioni e patologie

se regola la risposta immunitaria

sul topo molti lavori indicano i meccanismi in cui la 3’RR si inserisce: BCR expression, Ig germline transcription, class switch, B cell maturation (molec e cell biol, topi transgenici)

nell’uomo lavori di biologia cellulare-molecolare confermano il ruolo importante delle 3’RR, ma sono due invece di una

possibili differenze

sull’uomo si studiano i polimorfismi non possibili su topo

cosa sono i polimorfismi di HS1.2

polimorfismo HS1.2 umana

CCCCCCGCCCCCTCCCCCAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA

CACCCCCCCACCACCTCCAGATTCGGGGACA

CACCCCCCCACCACCACCCCCCCACCAC

Sp1

CTCCAGATTCGGGGA

NF-B

b

12mer 40mer

*1*2*3*4

CAGGCAGGCAGGCAGG

End18mer

--------------------------------

-------------------------CTCCAGATTCGGGGA AGGACAAGGACAAGGACA

AGGACA

AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACAAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA

CCCCCCCCCCCCAACCCCCCCCCCCCCAAC AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC

AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGC

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

18mer 40mer 15mer 40mer

*1*2*3*4

NF-B

NF-B

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ -------------------------------------------CACCCCCCGCCCCCTCCCCC

CTCCACCTGCAGCTGCAGCCGCCACCCACCC

---GGCACATGCAAATGG---GGCACATGCAAATGG---GGCACATGCAAATGG---GGCACATGCAAATGG AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGA

CCCCCCGCCCCCTCCCCC----------------------------------------------------------------------------------------------------------CCCCCCGCCCCCTCCCCC----------------------------------------------------------------------------------------------------------CCCCCCGCCCCCTCCCCC----------------------------------------------------------------------------------------------------------

Oct1 18mer

40merSp1 core 29mer

*1*2*3*4

CTTGCACGATT

CTTGCACGATT

CTTGCACGATTCTTGCACGATT

NF-B

AGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACAAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACAAGTGTGGCCAGGCTGGCCCAGGCCTCCAGATTCGGGGACA

CCCCCCGCCCCCTCCCCCCCCCCCGCCCCCTCCCCCCCCCCCGCCCCCTCCCCC

enhancer HS1,2339 bp

287 bp

465 bp

393 bp

EcoRI

Oct1

NF-B

Sp1

*2

*1

*3

*4

a lle

les

a lle

les

3’RR-1 3’RR-2 HS3 HS1.2 HS4

a chrms 14q32 23 1 2 4

jV D region

1E centromere

HS3 HS1.2 HS4

TOR VERGATA

Internal spacers

Conserved sequence Unit

Selective amplification of HS1,2-B downstream C2

(IgH3’RR-2)H

2m

HS 3

B B H

HS 1,2

E B

SA2.5

A2R A2F

HS1,24420 bp

ALLELE 3B

ALLELE 4B

Poly A site

HPoly A site

1m

B

HS 3

B B H* B

5402 bp

SA2.5 A2R

HS1,2HS 3

Selective amplification of HS1,2-A downstream

C1 (IgH3’RR-1)

ALLELE 1AHS1,2

P3Frw D3Rev

EcoRI

ALLELE 2A

ALLELE 3A

ALLELE 4A

HS 1,2

A B

BE

Core of enhancer HS1,2 External element - 31 bp

Repeated element - 38 bpExternal element -17 bp

EcoRI

EcoRI

EcoRI

Ua1

R1 R2

U1 U5

U4U2

U3 R3 rR3

U6 U7

U8 U1 R1

U2

Ub1

UU3 4

U5

U6

R3 R3U8 r

U4-5

U7r R3r

U6rU5r

Ub2

R4

14bp 16bp 20bp

P3Frw

HS1,2

D3Rev

EcoRI

EcoRI

i polimorfismi

TOR VERGATA

6 alleli Figure 3 polymorphism of HS1,2A

Sites for : SP1; IK2; MZF1

Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)

Sites for : AP4; E47; MYOD; E5

Sites for : NF-kB

Sites for : CMYB

ALLELE *4

20bp Sp.

17bp El. END HS1,2

CORE enhancer17bp El. 38bp Rp

14bp Sp.

ALLELE *1A 287

ALLELE *2A 339

472

16bp Sp. ALLELE *2B 360

ALLELE *3A

31bp El

393

31bp El 20bp Sp.

14bp Sp

ALLELE *3B

31bp El

414

20bp Sp

17bp El

20bp Sp

TOR VERGATA

Immunology 2001, 103: 35-40

Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’ enhancer HS1,2 and its relation to gene expression

TOR VERGATAU

HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (2b, 3,

,) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific manner. (Ong et al, 1998)

Symergic effects

TOR VERGATA synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4

Chromosome 14

IgH3’RR-2SF AL928742 (40 kb)

H

2

B

HS3

B

U2 U4

U5

B

R3

H

HS1,2

E

R3rU5rU1

R1

U3 U6

U7

U8r

B

U6r

HS4

Ub1 U4-5

R3 U7r

Ub2

B H

R4U9

R5

Ub3

U10

R5

U11

U12

R6

SA2.5 A2R A2F

Alu

U15 U16

H

LTR

END OF HOMOLOGY WITH ALFA1

U14U13

Ub4

H

1

B

HS3

B

U2U4

U5

B

R3

H*

HS1,2

E

R3r U5r

U1R1

Ua1

R2

U3

U6 U7 U8

B

U6r

HS4

B H

Ua2

R4

Ua3

U9 Ua4

R5U10

U11

R5

U12

R6

U13

SA2.5

A2R

Alu

U15 U16

H

LTR

END OF HOMOLOGY WITH ALFA2

K10 retrovirus

ELK2

H

U14

Ua5

A

B

centromero

3 1 2 41 2

clone CHR77(35.616 kb)

Poly A site

Poly A site

IgH3’RR-1

TOR VERGATA

M2M1

ALLELE 1

ALLELE 4ALLELE 3ALLELE 2

G RR-1

RR-2 G RR-1 RR-2

CM11 CM 4 CM 5

G RR-1 RR-2

100 bp

400 bp

200 bp

300 bp

gel genomico e selettivo degli alleli

amplificazione G=genomica o selettiva RR-1; RR-2

nell’amplificazione genomica si vedono gli alleli delle 2 regioni senza PCR selettiva applicata invece per amplificare selettivamente A o B.

TOR VERGATAU

i due alleli *2a, *2b e *3a, *3B

QuickTime™ and aTIFF (LZW) decompressor

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avevamo visto che nel locus 3’RR-B l’allele *3 aveva l’elemento 31mer rispetto al 17mer del locus 3’RR-Aadesso abbiamo (ho) visto che anche l’allele *2 esiste nelle due forme con il 17mer ed il 31mer, cambiano le consensus!

allele *4allele *3allele *2aallele *2ballele *1

465 bp393 bp360 bp339 bp287 bp

amplificazioni da DNA genomico dalle due 3’RR senza selezione

Evoluzione di HS1,2in diverse specie dimammifero e di primati

il core dell’enhancer è più conservata (rosa) ed il 31mer (arancio) potrebbe essere la forma ancestrale

stiamo cercando di clonare le forme polimorfiche di altre specie (topo macaco, scimpanzè) per confrontare la funzionalità in cellule di topo e uomo

allineamentiTOR VERGATAU

conservazione in altre specie

Homo s.; Gorilla; Orango; Homo s. allele 4; Cavia; Macaca;Callitrix; Canis; Equus; Felis; Pteropus; Rattus; Mus; Bos; Sus; Callicebus; Monodelphis (opossum);Capra; Gallus.

platirrine - catarrine 40 Mya

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evoluzione della IgH 3’RR

strutture conservate di HS1.2

species core 17bp (5')31bp (5') 38 bp 17bp (3')low similarity

(wrong sequence)allele 1 (Homo sapiens) x x x x

Cavia porcellus x x x x

Monodelphis domestica x x x

Macaca mulatta x x x x

Bos taurus x x

Callicebus moloch x x

Callithrix jacchus x x x x

Canis familiaris x x x x

Capra hircus x x x

Equus caballus x x x x

Felis catus x x x x

Gallus gallus x x x

Gorilla gorilla x x x x

Mus musculus x

Pan troglodytes x x x x

Pteropus vampyrus x

Rattus norvegicus x

Sus scrofa x x

manca la sequenza di Panda uscita il 13 Dicembre 2009

evoluzione di HS1.2

TOR VERGATA

quali altre analisi ?il polimorfismo si può studiare dal punto di vista funzionale

struttura e modelli in “silicio” (transcr. fact.; 3D models)

CHIP chromosome immuno-precipitation

EMSA electrophoretic mobility shift assay:-incubazione della sonda con le consensus con estratti nucleari-corsa elettroforetica-competizione con anticorpi o con consensus che sottraggono la formazione del complesso e fanno sparire il segnale