Genetica molecolare dell’autismo

La ricerca dei fattori genetici di rischio

W W W.FISIOKINESITERAPIA.BIZ

Autismo infantilecaratterizzato da sintomi in 3 diverse aree:1. compromissione della comunicazione verbale e non

verbale2. problemi nell’interazione sociale3. attività, modalità di comportamento ed interessi

ristretti, ripetitivi e stereotipati» I sintomi insorgono nella prima infanzia (entro i 3 anni) e

perdurano per tutta la vita

Parte di uno spettro più ampio di disturbi fra cui la Sindrome di Asperger e altri Disturbi Generalizzati delloSviluppo (PDD)

Prevalenza nella popolazione• ~ 5/10000 ->stima generalmente riportata • Studi recenti hanno indicato una prevalenza più alta:

• 1-3/1000 definizione stringente di autismo• 6/1000 disturbi dello spettro autistico

La prevalenza dell’autismo sta aumentando?Cambiamento graduale nei criteri diagnostici e negli strumenti diagnosticiMaggiore conoscenza del disturbo

Rapporto maschi/femmine ~ 3-4:1Ritardo mentale presente in ~ 75%

Fattori genetici

La prima descrizione risale a L.Kanner (1943)L’importanza di fattori genetici alla base dell’autismo non venne riconosciuta fino alla metà anni ‘70

»Assenza di trasmissione verticale»Basso tasso di autismo nei fratelli di individui affetti (≈ 3%)

Importanza di fattori genetici:

STUDI DI RICORRENZA FAMILIARE: RISCHIO RELATIVO λREsprime il grado di aggregazione familiare di un carattere

λs = rischio nei fratelli/sorelle di un affettorischio nella popolazione generale

CONCORDANZA IN GEMELLI MONOZIGOTICI/DIZIGOTICIPermettono di stabilire se l’aggregazione familiare e’ dovuta all’ambiente familiare in comuneoppure a fattori geneticiMZ = 100% geni in comuneDZ = 50% geni in comuneUna maggiore concordanza in gemelli MZ e’ indice di fattori genetici. Tuttavia:

• Tendenza a trattare i gemelli MZ in modo piu’ simile dei DZ• Differenze genetiche fra gemelli MZ (geni sistema immunitario, mutazioni somatiche,

pattern inattivazione X)

STUDIO DI INDIVIDUI ADOTTATIAltro metodo per individuare il contributo di fattori ambientali ed effetti genetici

Studi di gemelli

•grossa disparità fra i tassi di concordanza dei gem. MZ e DZ: importanza di fattori genetici

•Concordanza molto bassa nei DZ: azione epistatica di più geni

•Concordanza per un più ampio spettro di disturbi socio-cognitivi in forma meno grave che nell’autismo: “broader phenotype”

•Eterogeneità clinica

Bailey et al, 1995

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MZ (n=25) DZ (n=20)

Con

cord

ance

rate

Cognitive disorder

Social disorder

Social and cognitivedisorderAutism

(same sex)

Studi di ricorrenza familiare

•Frequenza nei fratelli di probandi ≈ 3% (~ 6% per PDD)

•Maggiore rischio di ricorrenza rispetto alla prevalenza nella popolazione

• λs = 10-50•“broader phenotype”•Relazione diretta fra gravitàdell’autismo e broader phenotype nei familiari

Bolton et al, 1994

0

5

10

15

20

25

AUTISM DOWN'S

% in

sib

lings

of p

roba

nd

Any one of three keyaereasAny two of the three keyareasCommunication and socialdeficitAsperger's/PDD

Autism

Studi epidemiologici: conclusioni

• Forte componente genetica • La predisposizione genetica si estende oltre la

diagnosi classica di autismo, includendo il broader phenotype

• Escluso modello Mendeliano monogenico• L’autismo è un disturbo genetico multifattoriale,

cioè non riconducibile a mutazioni di un singolo gene, ma dovuto all’azione di varianti in più geni e all’interzione e con l’ambiente

Mutazioni e polimorfismiactcgggctaaactttcggggcccaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc

actcgggctaaactttcggggccTaaactacgactagctagctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc

actcgAgctaaactttcggggcccaaactacgactagctaCctactagctagctaacttcggatcggatcggatcggatc

Polimorfismi varianti di 1 tratto di DNA presenti nella popolazione con frequenze non trascurabili (>1%). In genere non patogeniche

DNA

proteina

Mutazioni varianti rare di 1 tratto di DNA che hanno un effetto sul fenotipo

STOP

Caratteri genetici complessi

SUSCEPTIBILITY ALLELES

Numero di Fattori di RischioFr

eque

nza

Valore soglia

•Il carattere è influenzato da un certo numero di fattori di rischio•Individualmente ciascun fatt. di rischio ha un effetto moderato. La piena manifestazione del carattere è la risultante dell’azione combinata dei vari fattori di rischio

Caratteri genetici complessi

EterogeneitàA B C

Fenotipo

Patologie geneticheSclerosi tuberosaSindrome X-Fragile

Anomalie cromosomiche15q11-q13

1-3 %Duplicazioni interstiziali o [inv-dup 15] Ereditate per via materna

Associazione con condizioni genetiche conosciute

Non sappiamo ancora quanti siano i geni implicati nell’autismo e come questi interagiscano fra di loro e con altri fattori non genetici.

Solo in una minoranza dei casi (<10%) l’autismo è riconducibile ad una causa nota:

Fattori ambientali

Fattori di rischio prenatali» Esposizione in utero a talidomide o acido valproico» Infezione da virus rosolia

Fattori di rischio ambientali» Infezioni (cytomegalovirus, herpes)» Mercurio» Fattori nutrizionali» Vaccino trivalente (MMR)

Come identificare i geni?

• Screening dell’intero genoma umano analizzando un elevato numero di famiglie con almeno 2 individui affetti (multiplex) con metodi di LINKAGE non parametrici

• ASSOCIAZIONE ALLELICA (linkage disequilibrium mapping)

• Geni CANDIDATI

• Anomalie citogenetiche

Analisi di LINKAGE “tradizionale”(Metodi “parametrici” )

D1

+1

+2

+2

D1

+2

+3

+4

D2

+4

+2

+4

+1

+3

D1

+3

NR R RNR

• Dipende dalla specificazione di un modello di ereditarietà• Si contano gli eventi di ricombinazione fra due loci• Test: frazione di ricombinazione (θ) < 0.5

A,C B,D A,C E,G F,G F,H

A,B C,D E,F G,H

A,D A,H E,D

A,E D,H

Metodi di linkage ‘Non-parametrici’

2 alleli in comune

25%

40%

1 allele in comune

50%

55%

0 alleli in comune

25%

5%

Regione qualsiasi

Regione vicina ad un gene di “suscettibilità”

Si basano sulla condivisione di alleli di un marcatore da parte di individui affetti all’interno di una stessa famiglia

Famiglie con almeno 2 fratelli affetti

IMGSAC: International Molecular Genetic Study of Autism Consortium

Gran Bretagna, Olanda, Danimarca, Germania, Francia, Italia, U.S.A.Raccolta di >200 famiglie con almeno 2 fratelli (o altro tipo di parenti) affettiStrategia scelta: screening genomico con metodi non-parametriciIncertezza su quanto allargare i confini diagnostici del fenotipo -> criteri di inclusione stringenti

IMGSAC Genome scan / 152 sib-pairs

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Chromosome number

D2S

2188

D7S

477

D16

S310

2

HTT

INT2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X

Chromosome 2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Morgans

markersall sib-pairs (n=152)strict criteria only(n=127)

Problemi negli studi di linkage di malattie complesse

• Difficile stabilire la soglia di significativitàMLS > 3.6?

• Replicazione indipendente dei risultati positiviPer replicare un risultato positivo è necessario un campione di famiglie di dimensioni molto maggiori rispetto al campione originario

• Picchi di linkage molto larghi ed imprecisi rispetto alla posizione del locus malattia

Summary of genome screen results

Chr cM MLS cM MLS cM MLS cM HLOD cM NPL/GH cM MLS cM MLS cM HLOD1p 149 2.15 149 2.632q 206 3.74 192 0.64 192 2.39 * 198 1.303p 36 1.513q 190 4.315q 45 2.55(B)6q 109 2.237p 42 1.017q 104 2.27q 120 3.20 125 0.83 138 0.93 150 0.8 128 1.7 123 1.02* 170 3.04(B)7q 165 2.13*8q 1.66(B)13q 55 0.68 55 3.0015q 32 1.1 32 0.5416p 23 2.93 21 0.74 20 1.9117p 11 1.2117q 45 2.34 117 2.16(B)18q 94 0.62 100 1.0019q 41 1.37 59 1.2 52 2.4622qXq 60 2.5 82 2.67 52 1.89

cM: position in Kosambi centiMorgans based on the Genethon linkage map; * results from follow-up studies

FINLAND(Auranen etal

2002)(Barrett et

al 1999)(Buxbaum et

al2001)(Shao et al 2002)

(Liu et al 2001)

CLSA M.SINAI DUKE AGREIMGSAC PARIS STANFORD

2001(Philippe 1999)

(Risch etal 1999)

Convergenza dei risultati di linkage sul crom. 7

The shaded bars represent the linkage findings of different research groups.

Dagli studi di linkage all’identificazione dei geni di suscettibiltà…E’ probabile la presenza di fattori genetici di rischio per l’autismo sui cromosomi 2, 7, 16, 17, 15, …

Esame più in dettaglio delle regioni cromosomiche identificate:sono molto ampie e contengono centinaia di geni: ciascuno di essi potrebbe essere ilresponsabile

Aumentare il numero di famiglie studiateAnalisi combinata dei dati di diversi gruppi di ricerca

Studio di individui affetti con anomalie cromosomiche che coinvolgono queste regioni

Studio di geni candidatiStudi di associazione allelica / Linkage disequilibrium

mapping

Studi di associazione allelica

Casi-controlli

Studio se un particolare allele è piùfrequente nei casi rispetto ai controlli, scelti dalla stessa popolazione

Alleli dei genitori:Trasmessi -> A CNon trasmessi -> B D

A B C D

A C

Transmission Disequilibrium TestTDT

Studio se un particolare allele ètrasmesso dai genitori al figlio affetto più frequentemente del 50%

Cause di associazione allelica1. Effetto diretto della variante

genetica sul fenotipo

2. Linkage disequilibrium(dovuto alla vicinanza di due loci sul cromosoma)

3. Associazioni “spurie” dovute a diversi eventi: per es. presenza di stratificazione nella popolazione

Linkage Associazione

marcatore

Allele di suscettibilità

Linkage Disequilibrium

LD = associazione non casuale degli alleli appartenenti a due loci vicini fra loro sul cromosoma

A

B

a

b

A

b

a

B

D = f(AB) - f(A) x f(B) D’ = |D | Dmax

Linkage Disequilibrium

NF1E1D1C1B1A1

G1H1I1J1K1

Mutazione N -> D

DF1E1D1C1B1A1

G1H1I1J1K1

DF1E1D1C2B2A2

G1H1I2J2K2

DF1E1D1C1B1A1

G1H1I1J1K1

10generaz.

90generaz.

In una popolazione il LD decresce in funzione del num di generazioni (t) e della frazione di ricombinazione (r) Pattern di LD lungo il genoma è variabile e complesso e influenzato da un insieme di fattori demografici, molecolari ed evolutivi. Ancora oggetto di studio

Geni candidatiGeni candidati

Che tipo di geni possono essere coinvolti nell’autismo?Geni che sono attivi nel cervelloGeni coinvolti nello sviluppo del cervello, nella migrazione neuronale, nel metabolismo dei neurotrasmettitori…

Attualmente diversi gruppi di ricerca stanno esaminando alcuni di questi geni per identificare varianti della sequenza di DNA che costituiscanodei fattori di rischio per l’autismo

METODO:•Screening di varianti di sequenza in individui affetti (DHPLC)•Test delle varianti identificate:

•Casi-controlli•TDT

DHPLC

DNA sample is heated and cooled, but by cooling slowly under optimal hybridization conditions, bothhomoduplex and heteroduplex PCR products will form. The sample is then run through a high permformance liquid chromatography (HPLC) system, and OD260 peaks are resolved as they are elutedfrom the column under gradient conditions.

Geni candidati analizzati da IMGSACA. NEURONAL DEVELOPMENT C. BRAIN INVOLVEMENTChromosome 2 Chromosome 2CAMP-GEFII cAMP-regulated guanine nucleotide

exchange factorCHN1 Chimerin 1

HOXD1 Homeo box D1 GAD1 Glutamate decarboxylase 1 (brain, 67kDa)Chromosome 7 Chromosome 7NCAM Neuronal cell adhesion molecule CHRM2 Cholinergic receptor, muscarinic 2RELN Reelin COPG2 Coatamer protein complex, subunit gamma 2VGF Nerve growth factor inducible SRPK2 Serine/Arginine rich protein kinase 2LAMB1 Laminin beta-1 chain precursor SYPL Synaptophysin-like proteinLRNN1 Leucine-rich repeat protein, neuronal 1 GRM8 Glutamate receptor, metabotropic 8

PTPRZ1 Protein tyrosine phosphatase receptor-type Z, polypeptide 1

KCND2 Potassium voltage-gated channel, Shal-related subfamily, member 2

WNT2 & WNT16 Wingless-type MMTV integration site family members 2 and 16 Chromosome 16

A2BP1 Ataxin 2-binding protein

B. TRANSCRIPTION FACTORS ABAT 4-Aminobutyrate aminotransferase

Chromosome 2 CREBBP CREB binding protein ATF2 Activating transcription factor 2 GRIN2A Glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-

aspartate 2ADLX1 & DLX2 Distal-less homeobox genes 1 & 2 KIAA1243 KIAA1243 proteinNEUROD1 Neurogenic differentiation 1 D. HOUSEKEEPINGTBR1 T-box, brain, 1 Chromosome 2Chromosome 7 FRZB Frizzled-related proteinCUTL1 Cut-like 1 CED-6 CED-6 proteinDLX5 & DLX6 Distal-less homeobox genes 5 & 6 Chromosome 7FOXP2 Forkhead box P2 CPA1 & CPA5 Carboxypeptidase isoform 1 & 5Chromosome 16 MEST Mesoderm specific transcript homologTBX6 T-box 6 Chromosome 16UBN1 Ubinuclein 1 BFAR Bifunctional apoptosis regulator

EMP2 Epithelial membrane protein 2SSTR5 Somatostatin receptor 5

ReelinRuolo fondamentale nella regolazione della migrazione di diversi tipi di neuroni durante lo sviluppo del cervello. Espressa anche nel cervello adulto, dove puo’ avere un ruolo nella plasticità sinaptica

Topi reeler (reln-/reln-):sintomi neurologici (atassia, tremore) ealterazioni citoarchitettoniche in diverse aree del cervello (corteccia, ippocampo e cervelletto) simili a quelle descritti in studi post-mortem di indiv. autisticiTopi eterozigoti reeler (reln-/+): deficit in alcuni test comportamentali; ridotta densità spine dendridiche, deficit di GAD67, riduzione post-natale del num di cell Purkinje solo nei maschi Nell’uomo: mutazioni recessive causano lissencefalia

Reelin

I II III IV V VI VII VIIIF-spondin-like charged C-terminus

Reelin domain

5’UTR 3’UTR

AAAAAA m RNA

(GGC)n

IMGSAC families (Bonora et al, Mol Psych 2003)Ex 25 N1159KEx 35 V1762I Ex 35 V1762I Ex 44 R2290H Ex 51 T2718A

Ex25 Ex35 Ex44 Ex51

protein

Trinucleotide (GGC): trasmissione preferenziale degli alleli ‘lunghi’(Persico et al, 2001)

The search for susceptibility genes…

Conclusioni e prospettive

L’identificazione di fattori genetici di rischio:• Permetterà di comprendere i meccanismi patofisiologici alla base dei disturbi dello

spettro autistico e dei fattori che ne influenzano l’espressività.• Permetterà l’identificazione di target per interventi farmacologici• Costiturà la base per lo sviluppo di nuovi approcci di diagnosi ed intervento, e

forse anche di prevenzione e cura.

Progressi nell’identificazione di regioni cromosomiche dove sono probabilmente localizzati fattori genetici di rischio per i disturbi dello spettro autisticoLa complessità genetica ha reso difficile l’identificazione di geni. Fino ad oggi, un significativo coinvolgimento nell’autismo non è stato ancoradimostrato per nessun gene

•Meta-analisi•Studio del ‘broader phenotype’ nei parenti di individui affetti

Acknowledgements

Wellcome Trust Centre forHuman Genetics - Oxford

Janine LambGabrielle CookeElena BonoraAngela MarlowAnthony Monaco

Dipartimento di Biologia Evol. Sper.Bologna

Francesca BlasiElena BacchelliElena Maestrini

THE INTERNATIONAL MOLECULAR GENETIC STUDY OF AUTISMCONSORTIUM

http://www.well.ox.ac.uk/~maestrin/iat.html

Department of Psychiatry, University of OxfordAnthony Bailey