Monica Muratori

Sezione di Medicina della Sessualità e Andrologia, Università di Firenze

FRAMMENTAZIONE DEL DNA SPERMATICO

Il manuale WHO 2010 per l’esame del liquido seminale: luci e ombre

Bologna 29 Gennaio 2011

FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEGLI SPERMATOZOI

• Ha un’origine probabilmente multifattoriale:

• Presenza di tagli a singola e doppia elica nel DNA degli spermatozoi

• E’ un anomalia genomica frequentemente rinvenuta nei pazienti sub e infertili (Gorczyca et al, 1993)

- apoptosi abortiva (nucleasi apoptotiche)

- difetti nella maturazione

cromatinica (topoisomerasi)

- stress ossidativo (ROS)

Determinare la frammentazione del DNA nel seme fornisce maggiori

informazioni sullo stato di fertilità maschile rispetto a quelle

ottenute con lo spermiogramma ?

I livelli di frammentazione nel seme predicono gli esiti della

riproduzione?

Spermiogramma

Limiti di predittività clinica

Necessità di nuovi parametri

La frammentazione del DNA si propone come candidato

a nuovo parametro predittivo della fertilità maschile

FRAMMENTAZIONE DEL DNA E QUALITA’ DEL SEME

Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000; Muratori et al, 2000

Sperm DNA Fragmentation

FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE

Studi sull’animale: netto impatto negativo della frammentazione sugli indici riproduttivi e salute della progenie (Fatehi et al, 2006;

Fernandez Gonzalez et al, 2009).

impatto sul rate di fertilizzazione (Tarozzi et al, 2007):IVF: discussoICSI: inesistente

Controversa è l’associazione con:lo sviluppo embrionale, l’impianto, il tasso di gravidanza (Zini and Sigman 2009, Zini 2010)

Soggetti infertili hanno maggiori livelli di frammentazione del DNA rispetto a soggetti fertili (Sergerie et al, 2005; Evenson et al, 1999)

Invece c’è un buon accordo nel ritenere che aumentati livelli di danno al DNA spermatico causino un aumento degli aborti

(Zini et al, 2008)

FRAMMENTAZIONE ED IMPATTO SULLA RIPRODUZIONE

LE TECNICHE

Rivelano lo stesso tipo di danno?

I dati sono confrontabili?

SCSA

TUNEL

ISNT

Sperm Chromatin Structure Assay

(TdT)-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling

In Situ Nick Translation

Acridine Orange Test

Sperm Chromatin Dispersion Test

COMET

AO Test

SCD test (Halosperm)

Single Cell Gel Electrophoresis assay

DNA Fragmentation

TUNELterminal deoxynucleotidyl transferase–mediated

fluorescein–dUTP nick end labeling

•- Microscopia a fluorescenza e Citofluorimetria•- Risultati come percentuale di cellule frammentate

SCSASperm Chromatin Structure Assay

DFI

DNA denaturato

DNA totaleDFI=

Fluorescenza rossa =DNA denaturato

Flu

ore

scenza

verd

e =

DNA n

ativo

Arancio di Acridina

•- Citofluorimetria•- Risultati come percentuale di cellule frammentate

COMETo SCGE, Single Cell Gel Electrophoresis

•Inclusione degli spermatozoi in gel di agarosio, lisi ed elettroforesi in elevate concentrazioni saline

•Microscopia a fluorescenza•Elevata sensibilità (50 single-strand breaks per cell)•Percentuale di cellule danneggiate e misura del danno/cellula

Cellula frammentata

Cellula non frammentata

TUNEL

Mancanza di standardizzazione delle procedure

Shen et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Frydman et al. 2008; Pecou et al. 2009Subtraction method

Cohen-Bacrie P 2009; Muratori et al. 2000 and 2008a; Domínguez-Fandos D 2008; Zhang et al. 2008Threshold setting methodFLOW CYTOMETRY

DATA ANALYSIS

Muratori et al. 2008a, Sepaniak 2006; Frydman et al. 2008; Martin et al. 2005; Sergerie et al. 2005; Varum et al. 2007; Stronati et al. 2006; Ramos et al. 2008; Younglai et al. 2001; O'Flaherty et al. 2008

Flow cytometry

Chohan et al. 2006; R. Smith et al. 2006; Tesarik et al. 2004; Borini et al. 2006; Young et al, 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Smith et al. 2006; Tunc et al. 2008; Caglar et al. 2007

Fluorescence microscopyDETECTION

Varum et al. 2007; Sargerie et al. 2005; Piasecka et al. 2007; Younglai et al. 2001; Frydman et al. 2008; Muciaccia et al. 2007; Long et al. 2007; Martin et al. 2005; Zini et al. 2001

Indirect labeling Many commercial kits

O'Flaherty et al. 2008; Zhang et al. 2008; Aoki et al. 2006; Torregrosa et al. 2006; Young et al. 2003; Muratori et al. 2008a;.Greco et al. 2005; Paasch et al. 2004; Brugnon et al. 2006; Donelly et al. 2000

Direct labeling Many commercial kits

LABELLING

Chohan et al. 2006; Aoki et al. 2006; Caglar et al. 2007; Varum et al. 2007; Muratori et al. 2008a and 2009; Tunc et al. 2008; Frydman et al. 2008; Avendaño et al. 2009a and 2009b

Present 0.1; 1; 0.5 and 2% Triton X at different times

Martin et al. 2005; O'Flaherty et al. 2008; Young et al. 2003; Said et al. 2006Absent PERMEABILIZATION with detergents

Muratori et al. 2003; Caglar et al. 2007; Tarozzi et al. 2009; Domínguez-Fandos et al. 2008; Young et al. 2003; Avendaño et al. 2009a and 2009b; Stronati et al. 2006; Ramos et a. 2008; Tesarik et al. 2004

Formaldeyde At 1; 2; 3.5; 3.7%

Muciaccia et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009; Tunc et al. 2008; Martin et al. 2005

Alcohols EtOH, MeOH, MeOH-EtOH

FIXATION

Ramos et al. 2008; Avendaño et al. 2009a; Pecou et al. 2009Cryopreserved With or without cryoprotectant

Bian et al. 2004; Xia et al. 2005; Sepaniak et al. 2006; Stronati et al. 2006; Long et al. 2007; O'Flaherty et al. 2008

Frozen At -20°C, -70°C, -80°C

Muratori et al. 2000; Sergerie et al. 2005; Greco et al. 2005; Chohan et al. 2006; Smith et al. 2006; Domínguez-Fandos et al. 2008; Varum et al. 2007; Piasecka et al. 2007; Zhang et al. 2008; Cohen-Bacrie et al. 2009

Fresh

SAMPLE

REFERENCESVARIANTSSTEPS

Muratori et al, SBRM 2010

21.2±16.4Data analysis

26.0±16.0Labelling kit

(TMR vs FITC)

22.7±11.2Time storage

(0 vs 24 h)

15.1±11.2PFA concentration

(1% vs 3.7%)

CV%Effect of:

Intra-assay CV=4.3±1.4%, n=12

Muratori et al, J Androl, 2009

2.36±1.37%, n=29Younglai et al, 2001

39.82 ± 23.75%, n=66Domínguez-Fandos D et al, 2007

Letteratura 2000-2009, valori del TUNEL nel seme di soggetti subfertili

EFFETTO DELLE VARIANTI DEL TUNEL

Parte d

ella confli

ttualit

à della

letteratu

ra

può ris

iedere

nell’eteroge

neità

e nella

manca

nza di

standa

rdizzaz

ione d

elle

tecniche

Colorazione May-Grunwald Giemsa

Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007

M540 Bodies:corpi apoptotici di probabile origine testicolare

Incidenza degli M540 Bodies nel seme di soggetti sub/infertili

N=Normozoospermici, AT= AsthenoteratozoospermiciT=Teratozoospermici, OAT=Oligoasthenoteratozoospermici

% M

540

bo

die

ssu

l to

tale

dei

bo

die

se

sper

mat

ozo

i

Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007

% M

540

bo

die

svs

sp

erm

ato

zoi

M540 Bodies: un interferenza nelle analisi citofluorimetriche degli spermatozoi

Muratori et al, 2004 ; Marchiani et al, 2007

TUNEL/PI

Frammentazione del DNA

PI

Frammentazione del DNA

Controllo negativo Campione test

Propidium Iodide,PI

Bright field

Muratori et al, 2008

Muratori et al, Hum Reprod 2008

Percentuale ricavata dal semplice TUNEL meno percentuale ricavata dal TUNEL/PI

SIMPLE TUNEL versus TUNEL/PI

Simple TUNEL underestimates

Simple TUNEL overerestimates-50 -40 -30 -20 -10 0 10

Muratori et al, Cytometry A, 2008

SPERM SORTINGby FACSAria

Unpublished results

PI

PIbr

PIdim

Diversa relazione con la qualità del seme

Muratori et al, 2008

DNA Fragmentation

PI La frammentazione nella PI dimmer si associa strettamente a scarsa qualità del seme

La frammentazione nella PI brighterè indipendente dalla qualità del seme

0.001-0.3775Normal

morphology

0.005-0.2975Progressive motility

0.050-0.1975Total motility

0.001-0.3575Sperm concentration

(sperm/ml)

0.016-0.2575Sperm count (sperm/ejaculate)

prho

% diframmentazionesul totale deglispermatozoinParameters

0.000-0.51

0.000-0.41

0.003-0.32

0.000-0.52

0.000-0.46

prho

% diframmentazione

nellaPI Dimmer

La vitalità cellulare è diversa nelle due popolazioni

Test SampleP

I fluorescence

Dead cells(L-23101 fluorescence)

Negative Control

Il danno nella popolazione brighter è indipendente dalla qualità del seme.

E’ il danno della popolazione brighter a fornire informazioni addizionali/alternative sullo stato di fertilità maschile rispetto allo spermiogramma?

Le cellule della popolazione dimmer sono morte

Sono gli spermatozoi frammentati della brighter ad impattare negativamente sulla riproduzione?

CONFRONTO FRA SOGGETTI FERTILI ED INFERTILI

unpublished data PATIENTS FERTILE MEN

n=29 n=28

02468

101214161820222426283032

NS

FRAMMENTAZIONE DIMMER

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

*p<0.00001

FRAMMENTAZIONE BRIGHTER

PATIENTS FERTILE MEN

n=29 n=28

0

10

20

30

40

50

60

70

*p<0.001

FRAMMENTAZIONE TOTALE

Fertili= concepimento entro l’anno dalla data del test

Pazienti= afferenti al laboratorio di Seminologia per l’esecuzione dello spermiogramma

E’il da

nno de

lla pop

olazione

brighte

r il

param

etro in

dipend

ente d

alla qu

alità d

el sem

e

che dis

crimina

fra fer

tili ed

infertili

FRAMMENTAZIONE DEL DNA NEI SOLI SPERMATOZOI VIVI

Mitchell et al, 2010

Aitken et al, 2010

Spermatozoi vivi frammentati

FRAMMENTAZIONE DEL DNA E DANNO OSSIDATIVO RIVELATO CON LA COMET

Simon et al, 2010

= 8-hydroxy, 2 deoxy guanosine(8-OHdG)

Formamidopyrimidine-DNA Glycosylase =FPG

COMET

FPG

FRAMMENTAZIONE DEL DNA +

DANNO OSSIDATIVO

RINGRAZIAMENTI

Prof. Elisabetta Baldi Prof. Gianni FortiProf. Mario Maggi

Dr. Sara MarchianiDr. Lara TamburrinoDr. Marta CambiDr. Margarita MontoyaFrancesca Di FilippoDr.Erminio FilimbertiDr. Selene Degl’Innocenti

Dpt di Ginecologia, Perinatologiae Riproduzione Umana:

Prof. Ivo Noci

Azienda U.S.L. 3 di Pistoia

Presidio Ospedaliero di Pescia

Dr. Ilaria Natali

Dpt Fisiopatologia Clinica,

sz. Medicina della Sessualità e Andrologia: