L'uso combinato di forbici e pinze laser consente dieffettuare delicate manipolazioni a livello subcellula-re. Nella procedura illustrata, che dovrebbe essererealizzabile entro una decina d'anni, due fasci chefungono da pinze (in rosa) trattengono strettamentela cellula. Un fascio forbice (in blu chiaro) penetranella cellula per eliminare un gene difettoso (in ros-so). Un secondo fascio forbice (in blu scuro) crea nellamembrana cellulare un foro attraverso il quale potràentrare una sequenza genica appropriata (punti neri).Si potranno poi ottenere cloni della cellula modificatache saranno trapiantati a scopo terapeutico.

Forbici e pinze laserNuove tecniche laser per studiare e manipolare le cellule

e i loro minuscoli componenti aprono nuove stradeper modificare le strutture biologiche a livello microscopico

di Michael W. Berns

G

li intensi, puri fasci di luce deilaser sono ormai parte inte-grante di oggetti di uso quoti-

diano come i lettori di compact disc ole stampant; ma la presenza quotidianadi questi dispositivi non significa che illoro ruolo si riduca a compiti banali.

Immaginiamo per esempio di indiriz-zare un fascio laser in modo estrema-mente preciso su un organello di unacellula vivente. Ora immaginiamo cheil fascio possa letteralmente afferrare etenere ferma questa minuscola struttu-ra. Poi, mentre questo «microraggio»agisce da pinza, un secondo funzionada bisturi o da forbice, consentendo dieffettuare delicate operazioni chirurgi-che sull'organello.

Perfino in un mondo ormai abituatoai laser, queste considerazioni hanno sa-pore di fantascienza. Eppure, come ichirurghi effettuano operazioni quasinon invasive manovrando pinze e forbi-ci miniaturizzate con l'endoscopio, cosìi biologi cellulari possono usare «pin-ze laser» e «forbici laser» per compieremanipolazioni sulla cellula vivente e suisuoi organelli. Le prime a comparire fu-rono le forbici laser. Circa 30 anni orsono, Donald E. Rounds e io (all'epocaalla Pasadena Foundation for MedicalResearch) suggerimmo l'utilizzo dei la-ser per analizzare la struttura e la fun-zione di cellule e organelli (si veda l'ar-ticolo Chirurgia cellulare con il laser diMichael W. Berns e Donald E. Roundsin «Le Scienze» n. 22, giugno 1970). Lenostre prime ricerche si concentraronosui parametri del fascio da utilizzare(come la lunghezza d'onda e la duratadi esposizione); poi tentammo di stabili-re quali organelli potessero essere mani-polati con successo con fasci laser, te-nendo conto che questi potevano avereeffetto su regioni intracellulari di dia-metro inferiore a 0,25 micrometri.

Negli anni seguenti, con i miei colle-ghi scoprii che le forbici laser potevanoessere utilizzate per studiare organelli

del nucleo, come i cromosomi e il fusomitotico che li separa durante la divi-sione cellulare. I laser inoltre hanno fa-cilitato lo studio di componenti del ci-toplasma, in particolare di mitocondri,microfilamenti, microtubuli e centroso-mi, strutture coinvolte nel mantenimen-to dell'architettura cellulare e nel tra-sporto di molecole entro la cellula.

Sebbene in realtà non si sappia sem-

pre esattamente come i laser produ-cano specifiche modificazioni nei com-ponenti cellulari, sappiamo però che èpossibile generare alcune alterazioni inmodo riproducibile e senza compromet-tere la struttura del bersaglio e dell'am-biente che lo circonda. Per esempio,con i metodi classici di microscopia ot-tica ed elettronica si può osservare chele forbici laser causano particolari mo-dificazioni nei cromosomi. I primi studieffettuati dal nostro gruppo mostraronoche queste forbici potevano inattivareuna particolare regione cromosomicanelle cellule che si dividono: più preci-samente, quella che contiene i geni re-sponsabili della costruzione di un orga-nello nucleare chiamato nucleolo. Inol-tre l'alterazione si trasmetteva alla di-scendenza di queste cellule, sicché tut-ti i cloni da esse derivati possedevanoversioni inattive degli stessi geni.

L'alterazione del cromosoma - unalesione di grandezza inferiore a un mi-crometro - appare come una regionepiù chiara quando la cellula vivente èosservata con un microscopio ottico acontrasto di fase. Con il microscopioelettronico a trasmissione - con una po-tenza da 10 000 fino a 100 000 ingran-dimenti - si può osservare un'alterazio-ne strutturale molto ben definita, in cuiil materiale cromosomico circonda lalesione, mentre il citoplasma circostan-te resta apparentemente intatto. La re-gione che appare più chiara al micro-scopio ottico è in realtà dovuta alla mo-dificazione dell'indice di rifrazione, e

non alla asportazione di materiale. Il la-ser, in altre parole, ha cambiato le pro-prietà chimiche e fisiche del cromoso-ma senza causarne la distruzione.

È inoltre possibile studiare la mem-brana cellulare modificandone delicata-mente la fluidità. La membrana può an-che essere perforata: in questo caso illaser pratica un foro dell'ordine di unmicrometro che si richiude in una fra-zione di secondo. Con questa tecnica,chiamata optoporazione (ossia produ-zione di pori mediante strumenti ottici),quando il poro è aperto si possono fareentrare alcune molecole attraverso lamembrana senza causare danni perma-nenti alla stessa.

L'optoporazione può risultare parti-colarmente utile nella manipolazionegenetica della piante, che hanno pareticellulari rigide e relativamente imper-meabili rispetto alle flessibili membra-ne delle cellule animali. All'Universi-tà della California a Irvine, io e HongLiang abbiamo usato questa tecnica perintrodurre materiale genetico in singolecellule di riso che, modificate genetica-mente, hanno poi dato origine a interepiante in cui ogni cellula possedeva edesprimeva i geni che avevamo introdot-to. Da tutto ciò emerge come le forbicilaser possano essere utilizzate per inse-rire o eliminare geni specifici.

In Europa, la manipolazione di ga-meti (uova e spermatozoi) con forbicilaser è stata recentemente applicata incampo clinico, come parte di una pro-cedura chiamata «schiusa assistita». Leforbici vengono usate per assottigliareo rimuovere una piccola area della zonadi protezione (detta zona pellucida) diuova che sono state fecondate in pro-vetta. Gli embrioni nei primissimi sta-di sono poi reimpiantati nel grembomaterno, dove una zona pellucida piùsottile sembra favorirne l'impianto. Lostesso risultato si può ottenere con me-todi più convenzionali, ma la tecnicalaser ha il vantaggio di non richiedere

l'uso di sostanze chimipotrebbero danneggiare I

Nello studio clinico più esteso fieseguito, Severino Antinori e colleghidell'Istituto di riproduzione umana diRoma hanno osservato che la frequenzadi gravidanze è risultata più alta del 50per cento in 200 donne che avevano ri-cevuto embrioni trattati con la tecnicadell'assottigliamento laser, rispetto allepazienti che non avevano subito questaprocedura. Il primo studio multicentricosull'assottigliamento laser è appena ini-ziato negli Stati Uniti. Studi simili sonoin corso in Australia e attendono l'ap-provazione delle autorità in Israele.

In collaborazione con il gruppo diNancy L. Allbritton a Irvine, nel miolaboratorio stiamo usando le forbici la-ser per un altro scopo ancora: si trattadi aprire singole cellule per poterneanalizzare in ogni momento le compo-nenti chimiche. A questo fine sfruttia-mo quello che di solito è consideratoun effetto indesiderato delle forbici la-ser. Infatti, quando la luce è focalizzatasul vetrino su cui è posta la cellula, op-pure al di sopra di esso, si sviluppa unaminuscola nube di gas ionizzato che

microplasma. L'e-

ontrazione del micro-plasma generano uno stress meccanicoche, a sua volta, può causare la rotturadella cellula. Anche i medici sfruttanoun simile effetto su scala macroscopicaper polverizzare i calcoli renali e alcu-ne cataratte utilizzando l'onda d'urtocausata dal laser (si veda l'articolo Lachirurgia laser di Michael W. Berns in«Le Scienze» n. 276, agosto 1991).

Disponendo un sottile capillare divetro proprio sopra la cellula, abbiamocosì potuto raccoglierne e analizzarne ilcontenuto, ottenendo un'istantanea del-la biochimica cellulare. Potenzialmen-te, questa tecnica ha importanti applica-zioni in chimica analitica a livello dellesingole cellule.

I n tutte le applicazioni delle forbici la-ser, si cerca costantemente di rag-

giungere maggiore precisione e seletti-vità. Per precisione si intende la possi-bilità di dirigere il laser esattamente nelpunto voluto; la selettività consiste nelpoter modificare il bersaglio lasciandointatte le strutture che lo circondano.

Raggiungere un alto livello di preci-

sione è oggi relativamente facile, graziealla qualità che caratterizza gli elemen-ti ottici contenuti negli attuali micro-scopi. Gli obiettivi sono costruiti conestrema precisione e vengono correttidal punto di vista cromatico su tutto lospettro del visibile, cosicché tutte lelunghezze d'onda si focalizzano pres-soché nello stesso punto. I ricercatoriche utilizzano fasci laser multipli a di-verse lunghezze d'onda possono cosìessere certi di focalizzarli esattamente.

Le leggi fisiche che regolano la gran-dezza del punto focale del laser fannosì che, con un moderno microscopioprovvisto di un obiettivo a immersionea 100 ingrandimenti, questo punto ri-sulti leggermente più piccolo della lun-ghezza d'onda del fascio stesso. Un la-ser a cristalli di neodimio-ittrio-allumi-nio (Nd:YAG), che funziona a una lun-ghezza d'onda di 532 nanometri, puòprodurre un punto focale della grandez-za di 499 nanometri. La precisione puòanche essere migliore di quanto non ap-paia a prima vista. Il laser che usiamopiù di frequente produce una distribu-zione gaussiana di energia; in altre pa-role l'energia che forma il punto focale

32 LE SCIENZE n. 358, giugno 1998

LE SCIENZE n. 358, giugno 1998 33

Una delle operazioni che si possono effettuare con le forbici laser è l'incisione disolchi (a sinistra) nella zona pellucida di un uovo fertilizzato di topo (nel riquadro)per facilitarne l'impianto. Un'altra operazione consiste nella rimozione di un cu-neo a forma di V dal cromosoma (a destra) di una cellula vivente di ratto canguro.Nel punto più largo, il cuneo di materiale genetico misura circa un micrometro.

CREAZIONE DI ONDE DI STRESS MECCANICOLe forbici possono rompere le cellule,

*e •i cui componenti possono essereraccolti e analizzati

GENERAZION-DEL PLASMA

Le forbici possonoeffettuare

_l'optoporazione(creazione di poritemporanei nellamembrana cellulare)

ROTTURA DILEGAMI MOLECOLARILe forbici possonoassottigliare la zonapellucida intornoagli oociti (peraumentare la fertilità)

RISCALDAMENTOLe forbici possonomicrodissezionareminuscole regionidei cromosomi

,.Pper l'analisi genetica

INTRAPPOLAMENTOLe pinze possonoafferrare gli spermatozo

, INDUZIONE DI REAZIONI

2ZFOTOCHIMICHEFormazione di legami chimici,

\ come il crosslinking del DNASS

SS

SS

SS

SS

1012

103

100

1 0-3

-310-15

10-12

10-9 10-6

10o

10 10 3

TEMPO DI ESPOSIZIONE (SECONDI)

può essere descritta da un grafico a for-ma di campana. Dato che solo il piccodel grafico possiede un'energia suffi-ciente a produrre modificazioni in unorganello bersaglio, il punto effettivo diazione può essere molto più piccolo delpunto focale misurato.

Benché le applicazioni che sono sta-te sviluppate finora dimostrino che èpossibile uno stretto controllo delle al-terazioni, ancora non si sa come garan-tire questa selettività in molte applica-zioni nuove (a parte il fatto di constata-re empiricamente che il procedimentofunziona) perché non si conoscono afondo le interazioni fra la luce laser e ibersagli biologici. Una situazione delgenere non è rara nella scien-za: si è usata l'aspirina per unsecolo prima che si scoprisseil suo meccanismo d'azionemolecolare. In ogni caso, co-

L'energia trasferita a una cel-lula, che si misura in joule percentimetro quadrato, dipendedalla densità di flusso radiativodel laser e dalla durata di espo-sizione della cellula alla luce.(Le linee tratteggiate diagonalirappresentano dosi energetichecostanti.) Sono evidenziati al-cuni effetti che si possono otte-nere nelle cellule con svariatecombinazioni di flusso radiati-vo e tempo di esposizione. Il ri-scaldamento, anche se in diver-sa misura, è un effetto comuneper un largo spettro di energie.Il rosso scuro indica dove il ri-scaldamento costituisce il mec-canismo dominante.

ci, possono verificarsi diversi processifisici e chimici, scatenati dall'assorbi-mento di un singolo fotone o da quellosimultaneo di più fotoni.

L'assorbimento di un singolo fotonepuò semplicemente avere l'effetto di ri-scaldare il bersaglio, oppure può dare ilvia a una serie di reazioni chimiche cheproducono radicali liberi e altri prodottidannosi per la cellula. I fotoni di alta e-nergia (come quelli della radiazione ul-travioletta) possono anche rompere i le-gami chimici, spezzando le molecolenel processo chiamato fotoablazione. I-noltre più fotoni di bassa energia, assor-biti a brevissima distanza di tempo, pos-sono risultare equivalenti a un singolofotone di energia più elevata. Questo as-sorbimento multiplo può dare origine areazioni chimiche oppure causare disso-ciazione molecolare, come nel caso del-l'assorbimento di un singolo fotone ul-travioletto. Tutti questi meccanismi etutte le loro possibili combinazioni pos-sono agire su un bersaglio cellulare digrandezza inferiore al micrometro.

Oltre alle proprietà di assorbimentodel bersaglio, un altro fattore importan-te che determina l'effetto dei laser è ladensità di flusso radiativo della luce in-cidente (l'energia che raggiunge la su-perficie del bersaglio nell'unità di tem-po, misurata in watt per centimetro qua-drato). Se si utilizzano laser a impulsiche espongono il bersaglio alla luce perperiodi che vanno da microsecondi finoa pochi femtosecondi (10- 15 secondi), ladensità di flusso può essere enorme. Glieffetti del laser su un tessuto esposto perperiodi relativamente lunghi (da cente-simi di secondo a qualche minuto) sononoti: essi includono il riscaldamento -

che può provocare denaturazione dellemolecole, coagulazione o vaporizzazio-ne - nonché reazioni chimiche che ge-nerano prodotti dannosi. come i radicaliliberi. Siamo meno sicuri, invece, deglieffetti di un'elevata densità di flusso neivolumi in cui lavoriamo entro la cellula:una sfera di un micrometro di diametroha un volume inferiore a un femtolitro.

Una sfida importante è dunque quelladi stabilire entro quali intervalli un au-mento della densità di flusso radiativodel laser produca effetti diversi sul ber-saglio. Per esempio, si può cercare dicapire per quali valori si passi dal sem-plice riscaldamento alla generazione dionde d'urto indotte dal microplasma.Gli effetti della densità di flusso radiati-vo e gli intervalli di valori entro i qualiessi si producono sono ancora definiti inmodo incompleto, ma certamente sonoinfluenzati dalla durata dell'impulso la-ser e dalle proprietà di assorbimento siadel bersaglio sia del suo ambiente.

Lo studio di questi parametri è unsettore molto attivo, e il nostro grupposi concentra soprattutto sulle scale digrandezza inferiori al micrometro. Neiprossimi anni assisteremo probabil-mente a importanti progressi nella ca-ratterizzazione delle interazioni fra la-ser e bersaglio, che daranno l'opportu-nità di applicare il laser in modo ancorapiù fine a livello subcellulare.

Nonostante le incognite che ancora ri-mangono, è oggi possibile effettuareun'ablazione laser estremamente preci-sa, che ci permette di inattivare o di-struggere regioni specifiche del bersa-glio pressoché in tutti i componenti cel-lulari visibili al microscopio ottico. Nelprossimo futuro potremo perfino riuscirea superare le limitazioni visive. Peresempio, si possono utilizzare molecoleche assorbono la luce (LAM, da lightabsorbing molecule) in grado di legarsia una specifica sequenza di DNA del ge-ne che vogliamo manipolare. Non im-porta se questa sequenza è troppo picco-la per essere visualizzata, o se non cono-sciamo la sua posizione nel cromosoma.Colpendo l'intera cellula con luce dellagiusta lunghezza d'onda, si avrà l'effettodi eccitare le LAM, che a loro volta inat-tiveranno il gene a cui sono legate. (Conquesto processo si potrebbe anche atti-vare un gene, fornendogli energia peravviare una serie di reazioni chimiche osemplicemente inattivando un gene sop-pressore.) Il resto della cellula sarebbesottoposto alla luce per breve tempo enon riporterebbe alcun danno.

Con il loro breve e intenso impulsoluminoso, le forbici laser hanno apertola via verso la chirurgia microscopica sucellule e molecole. Più di recente, questistrumenti sono stati affiancati dall'equi-valente laser delle pinze chirurgiche.

Per chi non ha conoscenze approfon-dite di fisica, l'idea che la luce possacreare una forza in grado di muovere otener fermi gli oggetti sembra fantasiosaquanto il teletrasporto di Star Trek. Ep-pure, la luce possiede una quantità dimoto, o momento, che può essere tra-sferita a un bersaglio. Non avvertiamola minuscola forza che risulta quando,per esempio, la luce solare ci colpisce espinge impercettibilmente contro di noi;ma questa forza può essere sufficiente ainfluenzare i processi biologici a livellosubcellulare, dove le masse degli ogget-ti coinvolti sono infinitesime.

Ametà degli anni ottanta, ArthurAshkin degli AT&T Bell Labora-

tories scoprì che un fascio laser a im-pulso continuo e di bassa potenza (infe-riore a un watt) poteva «intrappolareotticamente» singoli batteri e protozoi.Con i suoi colleghi dimostrò - dappri-ma con un laser ad argon di lunghezzad'onda blu-verde e poi con il laser in-frarosso Nd:YAG. al quale le cellule ri-sultano più trasparenti - che intere cel-lule e i loro organelli potevano essereafferrati e spostati.

In seguito Steven Chu, premio Nobelper la fisica nel 1997, e colleghi dellaStanford University mostrarono che lepinze laser potevano servire per afferra-re molecole. Essi legarono microsferetrasparenti di polistirene alle estremitàdi molecole di DNA «nudo» avvolte suse stesse e utilizzarono forze ottiche peresercitare una trazione sulle sfere e «sti-rare» il DNA in tutta la sua lunghezza(si veda l'articolo Intrappolamento la-ser di particelle neutre di Steven Chu in«Le Scienze» n. 284, aprile 1992). Ste-ven M. Block della Princeton Univer-sity e Michael P. Sheetz della Duke U-niversity hanno sfruttato l'intrappola-mento ottico delle molecole per studiarele strutture cellulari di tipo proteico che

Un laser può «afferrare» un oggettosfruttando principi fisici semplici, co-me la conservazione della quantità dimoto. La rifrazione di una qualsiasicoppia di raggi simmetrici del fascio la-ser produce forze. Nell'esempio, la cop-pia di raggi A e B produce le forze F„ eF „ che derivano dalla reazione del ber-saglio al cambiamento della quantità dimoto dei raggi. Se il punto focale si tro-va prima del centro del bersaglio, lasomma di una coppia di queste forze èuna forza totale (freccia verticale F)che attira il bersaglio verso il fascio. Seil punto focale è oltre il centro del ber-saglio, questo viene spinto lontano dalfascio. Se invece il punto focale è a de-stra o a sinistra del centro, il bersaglioviene spostato lateralmente.

regolano l'azione dei flagelli o della co-da degli spermatozoi e che permettonolo spostamento di particelle e organellientro la cellula.

Un oggetto abbastanza piccolo e rela-tivamente trasparente alla luce laser diuna certa lunghezza d'onda rifrange ilfascio laser incidente, piegando la luce.La rifrazione provoca un trasferimentodi quantità di moto dalla luce al bersa-glio. Quando la geometria della disposi-zione dei fasci e del bersaglio è corretta,la quantità di moto trasferita a quest'ul-timo lo tira nella direzione del raggio in-cidente, sicché il laser può tenere fermol'oggetto (si veda l'illustrazione qui sot-to). Muovendo il fascio, si può trascina-re l'oggetto da un punto all'altro.

Le forbici e le pinze sono caratteriz-zate da fasci laser molto diversi fra loroper intensità e durata. Mentre le forbiciutilizzano brevi impulsi ad alta densitàdi flusso radiativo, le pinze fanno usodi fasci continui a bassa densità di flus-so. Il bersaglio deve risultare trasparen-te alle pinze, affinché i fasci attraversi-no l'oggetto senza che vi sia un signifi-cativo assorbimento di energia che cau-serebbe riscaldamento o produzione dicomposti dannosi.

Anche se un singolo fascio può affer-rare una cellula o un organello, c'è sem-pre la possibilità che l'oggetto si muovaun poco: un secondo fascio può blocca-re il bersaglio sul posto, in una morsa diluce. Le pinze laser utilizzano normal-mente una lunghezza d'onda compresafra 0,7 e 1,06 micrometri e una potenzacompresa fra 25 e 500 milliwatt in un'a-rea focale di 0,5-1,0 micrometri di dia-metro. Questi fasci generano forze mi-nuscole, ma più che sufficienti per bloc-care le cellule e spostare gli organelliall'interno e all'esterno di esse.

noscere meglio il funzionamento di unfarmaco o di una tecnica non può cheaiutare a sviluppare migliori applicazio-ni. Perciò, come è logico, gli scienziatistanno lavorando intensamente per cer-care di capire le complesse interazionifra la luce laser e le cellule viventi.

Stabilire quali siano gli effetti del la-ser è difficile per diversi motivi. Misu-rare e registrare eventi che accadono inuna singola cellula a scale di grandezzainferiori al micrometro è una sfida for-midabile, come pure controllare l'ener-gia del fascio in volumi così piccoli.Nonostante gli ostacoli, da studi a scalamacroscopica sappiamo che, quando ilaser interagiscono con i tessuti organi-

LE SCIENZE n. 358, giugno 1998 3534 LE SCIENZE n. 358, giugno 1998

La polarità dei linfociti T è evidenziatada uno studio condotto con pinze laser.Linfociti B, che causano il rilascio dicalcio da parte dei linfociti T, sono statidisposti con precisione presso questi ul-timi tramite pinze laser. Quando illinfocita B era collocato a un'estremitàdi un linfocita T quiescente, non si os-servavano cambiamenti: il colorantefluorescente all'interno del linfocita Trimaneva rosso (in alto). Quando illinfocita B toccava l'altra estremità dellinfocita T, si aveva rilascio di calcio,evidenziato dalla fluorescenza gialla.

Le pinze laser consentono esperimen-ti mai tentati in precedenza. I miei colle-ghi a Irvine, Michael Cahalan, Bruce J.Tromberg, Xunbin Wei, Tatiana Krasie-va e Paul Negulescu, hanno di recenteanalizzato con queste tecniche la rela-zione tra struttura e funzione dei linfoci-ti T. La presentazione di molecole estra-nee, o antigeni, da parte dei linfociti Bdà inizio a una cascata di reazioni, fracui l'aumento della concentrazione diioni calcio nei linfociti T, il quale, a suavolta, porta alla specializzazione e allaproliferazione di queste cellule vitali nelprocesso immunitario. I linfociti T han-no un aspetto polarizzato, determinatodalla loro forma e dalla direzione di mo-to. Usando laser al titanio-zaffiro comepinze, si è riusciti a intrappolare linfocitiB e a disporli in diversi punti della su-perficie dei linfociti T. Quando il linfo-cita B era posto nella parte posterioredel linfocita T (rispetto alla direzionedel moto) non c'era alcuna reazione, ela cellula B si staccava dalla T in pochiminuti. Al contrario, quando era siste-mato nella parte anteriore del linfocitaT, il linfocita B stimolava un rapido au-

mento della concentrazione intracellula-re di ioni calcio, indicando che la casca-ta di reazioni era in corso. Queste osser-vazioni concordano perfettamente conl'idea che la migrazione dei linfociti T edi altri globuli bianchi verso una speci-fica direzione dipenda almeno in parteda segnali captati da recettori situati nel-la parte anteriore della cellula.

Le pinze laser possono intrappolareanche cellule molto mobili. Come han-no dimostrato i miei colleghi Yona Ta-dir, Gregory J. Sonek e William H.Wright (ora alla SRI International diMenlo Park, in California), con le pinzelaser si possono afferrare e manipolarea piacere singoli spermatozoi umani.Riducendo gradualmente la forza del la-ser bloccante fino a che gli spermatozoiriuscivano a sfuggire, abbiamo potutostudiare la capacità natatoria di questecellule. Queste misurazioni hanno forni-to un metodo per esaminare la relazionefra la forza natatoria, la velocità e il tipodi movimento. Una scoperta interessan-te è stata che gli spermatozoi che nuota-no a zig-zag si muovono con più for-za di quelli che nuotano in linea retta.Questo fatto potrebbe spiegare una seriedi osservazioni cliniche secondo le qua-li gli uomini in cui un'alta proporzionedi spermatozoi si muove a serpentinasono quelli maggiormente fertili.

Un'altra scoperta realizzata con lepinze laser è che gli spermatozoi rimos-si chirurgicamente dall'epididimo (do-ve essi maturano e sono immagazzinatiprima dell'eiaculazione) di uomini in-capaci di eiaculare nuotano con unaforza che è pari a solo un terzo di quel-la di spermatozoi normali. La piena ca-pacità natatoria sembra quindi richiede-re la maturazione completa, che avvie-ne nell'epididimo. Questi risultati aiu-tano a spiegare perché la fecondazionein vitro risulta più efficace quando glispermatozoi del paziente vengono di-rettamente iniettati nell'oocita, anzichéposti con esso in una capsula di Petri;in questa situazione, infatti, il successodella fecondazione dipende dalla capa-cità natatoria degli spermatozoi. Misu-rare la forza natatoria di questi ultimipotrebbe dunque essere un test utile perstabilire se una bassa fertilità sia causa-ta da scarsa motilità degli spermatozoi,nonché per valutare cure mirate ad au-mentare questa motilità.

L'applicazione delle pinze laser inqueste ricerche dovrà però essere moltoprudente, perché l'esposizione al fasciopotrebbe avere di per sé effetti negativisulla motilità degli spermatozoi, a cau-sa di inevitabili effetti termici o foto-chimici. In pratica, il riscaldamento èun problema maggiore per le pinze la-ser che per le forbici, a causa del fasciocontinuo che viene usato nelle prime.

Misure del calore generato dalle pin-ze laser sono state eseguite da Trom-berg, Sonek e Yagang Liu (ora allaBeckman Instruments di Fullerton, inCalifornia), che hanno registrato l'innal-zamento della temperatura in varie zonedelle cellule irradiate. Per far ciò hannolegato una molecola sensibile al caloresia a membrane artificiali (liposomi) siaa cellule ovariche di criceto cinese incoltura, e hanno misurato le variazionidell'intensità della fluorescenza e dellalunghezza d'onda delle emessioni.

Questo «microtermometro» cellulareha misurato un innalzamento di 1,15--1,45 gradi Celsius ogni 100 milliwattdi potenza laser nel punto focale. Datoche le pinze laser possono sviluppareuna potenza anche dieci volte superiorea questa, se il calore non è dissipato inmodo efficiente si rischia di modificarein modo deleterio la velocità delle rea-zioni biochimiche, di inattivare le pro-teine sensibili al calore (compresi glienzimi) e perfino di provocare la mortecellulare. Queste misure costituisconoun notevole progresso nelle conoscenzesulle interazioni fra laser e bersaglio.

e forbici e le pinze laser sono di peri sé strumenti potenti, ma le tecnicheche fanno uso di entrambe, contempo-raneamente o in sequenza, permettonodi effettuare manipolazioni e alterazionidelle cellule ancora più creative e sofi-sticate. La prima applicazione combina-ta di forbici e pinze laser si deve aRomy Wiegand-Steubing, la quale uti-lizzò un laser a infrarosso Nd:YAG co-me pinza per avvicinare due cellule dimieloma umano, e un impulso ultravio-letto prodotto da un laser ad azoto comeforbice per tagliare le membrane giu-stapposte. Le due cellule si unirono cosìa formare una singola cellula ibridacontenente il genoma di entrambe. Lecellule derivate da fusione possonocombinare insieme attributi utili, comela capacità di una cellula di generare uncerto prodotto e quella dell'altra di divi-dersi indefinitamente.

Proseguendo il lavoro sull'intrappo-lamento degli spermatozoi, un gruppoeuropeo guidato da Karin Schtitze delCentro Harlaching per le applicazionilaser di Monaco ha utilizzato pinze ainfrarossi per afferrare e guidare singolispermatozoi di bovino in un foro prati-cato nella zona pellucida dell'oocitacon forbici laser. Questa tecnica ha per-messo di ottenere fecondazione, anchese in una piccola percentuale di casi, eun esperimento simile condotto nei topiha dato risultati comparabili.

Un simile approccio, ammesso che ri-sulti efficace e sicuro, potrebbe costitui-re una valida alternativa alle attuali tec-niche di manipolazione dei gameti nel-

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l'uomo e certamente troverà applicazio-ne nell'allevamento animale. Anche sele nuove sperimentazioni devono ovvia-mente essere improntate alla massimaprudenza e rispettare scrupolosamentele direttive governative, gli studiosi del-la riproduzione assistita hanno mostratoun grande interesse per le forbici e lepinze laser. Due società hanno già ini-ziato a commercializzare stazioni di la-voro laser per usi multipli, compresa lacura dell'infertilità. La micromanipola-zione di spermatozoi e oociti con il laserdovrebbe risultare più rapida e conve-niente rispetto alle tecniche tradizionali.

L'uso combinato di forbici e pinzelaser ha permesso di manipolare gli or-ganelli e le cellule in modo prima inim-maginabile. In collaborazione con Ed-ward D. Salmon dell'Università dellaNorth Carolina a Chapel Hill e Conly L.Rieder del Wadsworth Center for Labo-ratories and Research di Albany, abbia-mo avviato studi a livello di organelliutilizzando forbici laser per tagliare icromosomi in fase di mitosi (divisionecellulare). Mediante pinze laser abbia-mo poi spostato i frammenti all'internodella cellula allo scopo di studiare leforze esercitate dal fuso mitotico (l'ap-parato cellulare che durante la divisioneattrae i cromosomi replicati verso le e-stremità opposte della cellula). Inaspet-tatamente, siamo riusciti a muovere confacilità i frammenti esterni al fuso mi-totico, ma non abbiamo potuto spostarequelli che erano nel citoplasma all'in-terno del fuso. Questo conferma l'esi-stenza di una «gabbia», costituita dalfuso, che blocca l'accesso a materialeestraneo, come frammenti di cromoso-ma prodotti ex novo. Dato che la mitositrasferisce il materiale genetico alla ge-nerazione successiva, è sensato che l'e-voluzione abbia sviluppato un sistemail cui scopo è impedire a materiale in-desiderabile di entrare nel fuso.

Sfruttando ancora questa tecnica, Rie-der e collaboratori hanno dimostrato chele pinze laser possono immobilizzare iframmenti di cromosoma che già si tro-vano entro il fuso. Infine, con questi me-

38 LE sciENzE n. 358, giugno 1998

todi, è possibile studiare in modo noninvasivo le forze che agiscono all'inter-no del fuso mitotico di una singola cel-lula. Dal momento che il fuso mitoticosvolge un ruolo fondamentale nella divi-sione cellulare, scoprire il suo funziona-mento può aiutarci a comprendere me-glio le malattie in cui la divisione cellu-lare è anormale, come il cancro o alcunemalformazioni.

Nell'ambito del programma LaserMicrobeam and Medical Biotechnolo-gy Resource dei National Institutes ofHealth, abbiamo recentemente messo apunto una stazione di lavoro che com-prende due fasci laser da usare comepinze e una forbice laser incorporati inun microscopio a fluorescenza a laserconfocale. I laser sono regolabili allalunghezza d'onda desiderata. Grazie al-la combinazione di queste caratteristi-che, la nostra stazione di lavoro potràsoddisfare le molteplici esigenze deibiologi cellulari. Si potranno infatti os-servare le cellule o gli organelli in fluo-rescenza con il microscopio, sia duran-te sia dopo la manovra delle pinze edelle forbici laser. Questo sistema diintrappolamento e ablazione confocale(CATS), controllato da un joystick, po-trà essere impiegato in diversi studi cel-lulari e subcellulari, e potrà perfino ser-

Il sistema a microfasci per forbici laserunisce un microscopio a contrasto difase e un laser a impulsi. Gli impulsi,della durata di 10 nanosecondi, sonovisibili come lampi discreti di luce lun-go il cammino del fascio laser. Il siste-ma qui mostrato è il predecessore delsistema di intrappolamento e ablazioneconfocale, in cui i fasci sono racchiusinella struttura e perciò non visibili.

\Afe a migliorare i metodi che si usa-no per ottenere il sequenziamento delDNA (cioè per decifrare l'ordine esattodelle coppie di basi che compongonoun frammento di DNA e che ne codifi-cano l'informazione genetica).

I miei colleghi di Irvine BarbaraHamkalo e Al Jasinskas stanno attual-mente utilizzando questa tecnica per ri-tagliare il centromero del cromosoma(la regione alla quale si fissano i micro-tubuli del fuso mitotico). Non è anco-ra chiaro se il centromero sia genetica-mente attivo, e gli studi sono complica-ti dal fatto che questa regione è partico-larmente difficile da isolare e analizza-re separatamente alla ricerca di sequen-ze di geni attivi. È probabile che le pin-ze e le forbici laser possano aiutare a ri-solvere questo enigma.

Sono passati più di 80 anni da quan-do Albert Einstein pose i presuppostiteorici dell'esistenza dei laser. All'ini-zio degli anni sessanta, questo disposi-tivo era già diventato una realtà. Oggi ilaser possono essere incorporati in stru-menti ottici per trasformare i biologicellulari in chirurghi cellulari che ana-lizzano e manipolano cellule e organel-li. Siamo così di fronte a una tecnologianuova che prospetta enormi applicazio-ni in campo medico, nella biologia del-lo sviluppo, nello studio della strutturae della funzione della cellula, e infinenella decifrazione e manipolazione delnostro patrimonio genetico.

MICHAEL W. BERNS è professore all'università della California a Irvine, pres-so il Beckrnan Laser Institute and Medical Clinic di cui è presidente e cofondatoreinsieme con l'industriale Arnold O. Beckman. Le sue ricerche riguardano la geneti-ca, il movimento cellulare e le applicazioni cliniche del laser. L'autore desidera de-dicare questo articolo a Beckman, che in aprile ha compiuto 98 anni.

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