FERMENTAZIONE

Il termine fermentazione andrebbe comunemente riferito alla

produzione di alcool e deriva dal latino fervere (ribollire), usato

Dal punto di vista strettamente chimico, la fermentazione è un

processo ossidativo anaerobico svolto da numerosi organismi

a carico di carboidrati (o raramente di aminoacidi) per la

produzione di energia.

per indicare l'aspetto del mosto durante la preparazione del vino.

Nel linguaggio comune, il termine fermentazione è stato

ampiamente usato per indicare una qualsiasi trasformazione

catalizzata da un microorganismo ed in genere viene usato in

relazione a tutti i processi che permettono la moltiplicazione in

grande quantità dei microorganismi e l’ottenimento dei loro

prodotti metabolici.1

Gli elementi necessari per la realizzazione di un processo

biotecnologico sono:

• I ceppi (che devono essere geneticamente stabili per fornire in

modo costante ed uniforme il prodotto desiderato).

• I terreni di coltura (nutriente ottimale).• I terreni di coltura (nutriente ottimale).

• I fermentatori (bioreattori).

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Uno schema di processo fermentativo deve prevedere le

seguenti fasi:

1. Si parte da un ceppo conservato (liofilizzato o in azoto liquido)

e se ne effettua la riattivazione del metabolismo.

2. Fase vegetativa, durante la quale si ha aumento della

concentrazione delle cellule e verifica della funzionalità del

ceppo. Si prepara quindi l’inoculo, cioè una sospensione ceppo. Si prepara quindi l’inoculo, cioè una sospensione

densa di cellule.

3. Produzione.

4. Trattamento della massa che esce dal fermentatore per

recuperare il prodotto desiderato.

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Un brodo di fermentazione è una miscela acquosa complessa di

cellule, prodotti extracellulari solubili, prodotti intracellulari, substrato

non metabolizzato, e altri componenti non utilizzabili.

La sequenza di operazioni attraverso le quali si arriva dal materiale

contenuto nel bioreattore al prodotto finale puro, può essere suddivisa

in 4 fasi:

RECUPERO DEI PRODOTTI

1. Rimozione del particolato (solidi sospesi).

2. Separazione primaria.

3. Purificazione.

4. Isolamento del prodotto finale.

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Un’operazione preliminare che può rendersi necessaria per

recuperare un prodotto intracellulare è la disintegrazione del

materiale cellulare.

Ciò può realizzarsi:

• meccanicamente (taglio, macinazione, ecc.);

• per lisi della parete e della membrana cellulare sfruttando

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• per lisi della parete e della membrana cellulare sfruttando

l’azione di opportuni enzimi.

Esiste una correlazione inversa fra il prezzo di vendita di un prodotto

e la sua concentrazione nel brodo di coltura.

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1. RIMOZIONE DEL PARTICOLATO

I solidi sospesi vengono separati dalla soluzione, usando le tecniche

classiche della filtrazione, centrifugazione e sedimentazione, secondo

le proprietà iniziali del brodo di fermentazione e della densità finale

desiderata del solido recuperato.

La miscela che esce dal reattore può avere proprietà che rendono

difficile la separazione solido/liquido: spesso è molto viscosa o

gelatinosa e il particolato è molto disperso.gelatinosa e il particolato è molto disperso.

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Quando la miscela ha proprietà che rendono difficile la

separazione, si rendono necessari dei pretrattamenti. I più comuni

includono una stagionatura, che consente alle cellule di aggregarsi

durante l’ultima parte della fase stazionaria, il riscaldamento, la

variazione del pH e l’aggiunta di flocculanti (polielettroliti, cloruro

di calcio, ecc.)

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FILTRAZIONE

La miscela solido/liquido viene separata facendo passare il fluido

attraverso una barriera porosa (tessuto di cotone o altre fibre, reti

metalliche, carta, metalli sinterizzati, prodotti porosi di carbone, ecc.)

che trattiene il solido:

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vuoto

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CENTRIFUGAZIONE

La sospensione si muove sotto l’azione della forza centrifuga.

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SEDIMENTAZIONE

Le particelle sedimentano sotto l’azione della forza gravitazionale.

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2. SEPARAZIONE PRIMARIA

Durante questa fase viene molto aumentata la concentrazione del

prodotto desiderato.

Fra le tecniche più usate: estrazione con solventi, adsorbimento,

precipitazione ed ultrafiltrazione.

Estrazione con solventi:

Sfrutta la diversa ripartizione di un soluto fra due fasi liquide

immiscibili (acqua/solvente organico): il composto apolare si ripartisce immiscibili (acqua/solvente organico): il composto apolare si ripartisce

preferenzialmente nel solvente organico (apolare).

L’uso di solventi organici non è invece adatto per il recupero di quelle

molecole che, come gli enzimi, e altre proteine, non abbiano affinità

per i solventi apolari o siano da questi danneggiati.

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L’estrazione con solventi organici è largamente impiegata per la

separazione di molti antibiotici, in particolare per le penicilline,

che hanno struttura:

A pH intorno a 7 il gruppo carbossilico è dissociato e la penicillina

è solubile in acqua (in forma di sale). Acidificando a pH 2-3, il

gruppo COO- viene protonato a COOH e la molecola diventagruppo COO- viene protonato a COOH e la molecola diventa

prevalentemente apolare, e quindi estraibile con un solvente

organico apolare (amilacetato o butilacetato).

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amilacetato

Trattando con una soluzione acquosa neutra/alcalina il solvente

organico contenente la penicillina, questa viene riportata in fase

acquosa.

Attraverso più stadi di estrazione si realizza anche la

purificazione del prodotto.

L’estrazione viene condotta portando in intimo contatto i due

liquidi immiscibili e quindi separando le due fasi.

Separatore-estrattore

Padbielniak.

La rapida rotazione

spinge i due fluidi

leggero (solvente) e

pesante (brodo) a

muoversi, a contatto,

in controcorrente

l’uno all’altro.

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Scambio ionico:

Le resine a scambio ionico sono polimeri reticolati che portano gruppi

ionizzabili acidi (-SO3-H+, -COO-H+) o basici (-NR3

+OH-, -NH3+OH-),

rispettivamente resine cationiche e anioniche.

I controioni H+ o OH- possono essere scambiati con ioni dello stesso

segno presenti nella soluzione con cui vengono a contatto:

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L’antibiotico streptomicina, nella cui struttura è contenuta un’ammina

ciclica (streptamina) ionizzabile, viene recuperata dal brodo di coltura

mediante una resina cationica carbossilica:

Resinan-(H+)n + strepromicinan+ -> Resinan- strepromicinan+ + nH+

Successivamente, la streptomicina viene recuperata mediante

eluizione con acqua acidula, invertendo lo stadio iniziale di

adsorbimento e rigenerando la resina.

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adsorbimento e rigenerando la resina.

Il processo viene realizzato in colonne a letto fisso.

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Precipitazione:

Può essere ottenuta in diversi modi:

•Per aggiunta di un precipitante che reagisca col soluto formando un

prodotto insolubile, spesso un sale. Per esempio:

Solvente organico + streptomicina + H2SO4 ����streptomicina solfato.2H2O↓↓↓↓

Acido citrico (aq) + Ca(OH)2 � citrato di calcio ↓2

Glutammato ammonico (aq) + acido � acido glutammico ↓

•Per aggiunta alla soluzione acquosa di solventi organici miscibili

(metanolo, acetone) si riduce la polarità del mezzo, riducendo anche la

solubilità delle sostanze (polari) da recuperare. 20

Il citrato di calcio (o dicitrato di

tricalcio tetratridrato) è il sale di

calcio dell'acido citrico.

C12H10Ca3O14 x 4 H2O

•Aggiunta di Sali (salting out) – il meccanismo di azione si basa

sulla sottrazione da parte del sale, ad elevata concentrazione,

dell’acqua di solvatazione delle biomolecole (polari), che

diventano perciò meno solubili.

•Aggiustamento del pH al punto isoelettrico, al quale la proteina

presenta un minimo di solubilità.

•Addizione di polielettroliti che agiscono come flocculanti

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•Addizione di polielettroliti che agiscono come flocculanti

(promuovono l’aggregazione e la sedimentazione di particelle

colloidali che altrimenti rimarrebbero stabilmente in

sospensione per molto tempo).

•Riscaldamento (caso tipico delle proteine): in questo modo la

proteina globulare si denatura, srotolandosi e presentando verso

l’esterno un maggior numero di residui idrofobi, diminuendo così

la sua solubilità.

ultrafiltrazione:

Passaggio del fluido sotto l’azione di pressioni piuttosto elevate,

attraverso una membrana, in genere finemente porosa, che ferma le

grosse molecole.

Applicata per la separazione di proteine (enzimi) e altre

macromolecole.

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3. PURIFICAZIONE

In questa fase si cerca di concentrare ulteriormente il prodotto oltre

che rimuovere la maggior parte delle impurezze residue. Le tecniche

più usate a questo scopo sono soprattutto l’adsorbimento e vari tipi di

cromatografia.

Precipitazione frazionata

Proteine con diversi punti isoelettrici possono essere separate Proteine con diversi punti isoelettrici possono essere separate

variando il pH.

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Cromatografia a setacci molecolari

Permette di separare molecole di diverse dimensioni. La colonna è

riempita con particelle di gel con pori di una dimensione caratteristica.

Le molecole di dimensioni maggiori non possono diffondere nel gel e

passano rapidamente attraverso la colonna, mentre le specie più

piccole penetrano nel gel e si muovono più lentamente.

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Cromatografia di affinità

Nella cromatografia di affinità (peculiare delle biotecnologie) si

sfrutta la specificità naturale che molte macromolecole

biologiche presentano per certe sostanze che, fissate su un

supporto, legano molto rapidamente e molto selettivamente la

propria “controparte”.

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ISOLAMENTO DEL PRODOTTO FINALE

Gli ultimi trattamenti servono ad ottenere il prodotto desiderato nella

forma più adatta alla sua commercializzazione.

Il prodotto, se commercializzato sotto forma di solido, può essere

cristallizzato da una soluzione, centrifugato per ridurne l’umidità ed

infine essiccato.

Cristallizzazione – si raggiunge la sovrasaturazione del soluto, conCristallizzazione – si raggiunge la sovrasaturazione del soluto, con

conseguente sua precipitazione, raffreddando la soluzione (nel caso

che la solubilità diminuisca al diminuire della temperatura) o

evaporando il solvente, eventualmente operando sotto vuoto per

abbassare la temperatura di ebollizione dello stesso.

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Cristallizzazione evaporativa a circolazione forzata

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Essiccamento

Generalmente viene realizzato facendo passare aria calda

attraverso il prodotto umido.

Liofilizzazione – è un metodo di essiccamento in cui il campione

viene prima congelato e poi sottoposto ad una forte

depressione che, per successivo blando riscaldamento, provocadepressione che, per successivo blando riscaldamento, provoca

la sublimazione dell’acqua.

La liofilizzazione è molto utile per essiccare tutte quelle sostanze

che non sono danneggiate dal congelamento, come per molti

microorganismi, vaccini, proteine, ecc. inoltre la struttura

porosa lasciata dalla sublimazione facilita la reidratazione.

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