FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA

PRISCILA RAMOS DE OLIVEIRA

EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE AS RESPOSTAS DA

AORTA À ANGIOTENSINA II EM RATOS NORMOTENSOS E

HIPERTENSOS 2R1C

MARÍLIA

2017

Priscila Ramos de Oliveira

Efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos

e hipertensos 2R1C

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado

Acadêmico em ”Saúde e Envelhecimento” da

Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do

título de Mestre. Área de concentração: Saúde e

Envelhecimento.

Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies.

Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia de Souza

Rossignoli.

Marília

2017

Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa,

desde que citada a fonte.

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília

Oliveira, Priscila Ramos de. Efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C / Priscila Ramos de Oliveira. - - Marília, 2017. 53 f. Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies. Coorientadora: Profa. Dra. Patrícia de S. Rossignoli. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.

1. Angiotensina II. 2. Aorta. 3. Hipertensão. 4.

Endotélio. 5. Exercício. 6. Óxido nítrico. 7. Superóxidos.

O48e

Priscila Ramos de Oliveira

Estudo dos efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos

normotensos e hipertensos 2R1C

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado

Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento” da

Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do

título de Mestre. Área de concentração: Saúde e

Envelhecimento.

Banca examinadora:

_________________________________________

Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies

Faculdade de Medicina de Marília

_________________________________________ Prof. Dr. Carlos Alberto Lazarini

Faculdade de Medicina de Marília

_________________________________________

Profa. Dra. Maricelma da Silva Soares de Souza

Universidade de Marília

Data da aprovação:___________________________

A Jeová Deus,

Ao meu marido Cido,

A minha filhinha Rayssa.

AGRADECIMENTOS

A Jeová Deus, por me dar o discernimento necessário para cumprir esta fase tão

importante da minha vida.

Ao meu marido e filha, por serem minha razão para tudo e obrigada por compreenderem quão

importante foi e sempre será para mim, esta jornada que estou findando.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Agnaldo, por ter me proporcionado este desafio, pela confiança

e pelo conhecimento que venho adquirindo.

A minha co-orientadora, Profa. Dra. Patrícia de Souza Rossignoli, que me proporcionou um

grande crescimento, sempre com muito profissionalismo, dedicação e paciência.

Aos meus amigos:

Priscilla, que é uma luz na minha vida, estando sempre ao meu lado de todas as formas;

Alisson, que sempre me ajudou prontamente e pacientemente;

Gabriela, que me inspira e me ajuda com seu conhecimento e carinho.

E a todos, que de alguma forma me ajudaram a fazer deste sonho, uma realidade.

“O amor é paciente, o amor é bondoso. Não

inveja, não se vangloria, não procura seus

interesses, não guarda rancor. O amor não se

alegra com a injustiça, mas se alegra com a

verdade.” (1 Coríntios 13:4-6)

RESUMO

O presente trabalho objetivou estudar os efeitos do exercício agudo e do treinamento sobre os

mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à angiotensina II (Ang II), em animais

submetidos ao modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip (2R1C). Logo, foi

proposto o estudo funcional das respostas de aortas torácicas à Ang II, nitroprussiato de sódio

e solução despolarizante em ratos machos Wistar normotensos (SHAM) e hipertensos

(2R1C), sedentários e treinados, estudados no repouso e após exercício agudo. Os desafios

com Ang II foram feitos na ausência e na presença de PD 123.319 (inibidor seletivo do

receptor AT2), L-NAME (inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase) indometacina

(inibidor não seletivo da cicloxigenase) e tiron (sequestrante de radicais livres). Algumas

preparações foram estudadas após remoção endotelial. Paralelamente, realizaram-se análises

bioquímicas para avaliação da peroxidação lipídica (FOX) e capacidade antioxidante do

plasma (FRAP). Observou-se que o treinamento atenuou as respostas da aorta à Ang II em

animais SHAM. Esta redução de resposta deixou de existir após a remoção endotelial e

tratamento com PD 123.319, L-NAME, indometacina e tiron. A exposição ao exercício agudo

atenuou a sensibilidade da aorta à Ang II em animais 2R1C, atenuação não mais observada

após remoção endotelial e tratamento com PD 123.319 e L-NAME. No entanto, na presença

de indometacina, a magnitude de resposta à Ang II foi reduzida para todos os grupos

experimentais. Adicionalmente, na presença de tiron, houve atenuação da resposta à Ang II

em animais expostos ao treinamento e ao exercício agudo. Curiosamente, o inverso ocorreu

com os animais treinados que foram re-expostos ao exercício. Não houve diferença no padrão

de resposta das aortas após desafio com nitroprussiato e solução despolarizante, tanto em

animais SHAM quanto 2R1C, sedentários e treinados, expostos ou não ao exercício agudo. O

treinamento e/ou o exercício agudo também não alteraram as concentrações plasmáticas de

FOX e FRAP nos animais SHAM e 2R1C. O presente estudo demonstra que, em animais

SHAM, as respostas da aorta à Ang II são moduladas, em animais expostos ao treinamento,

por óxido nítrico de origem endotelial, liberado em consequência da ativação de receptores

AT2. Nos animais 2R1C, este mecanismo endotelial modulador é suprimido pela elevada

concentração tecidual de ânion superóxido que leva a um estado de estresse oxidativo.

Palavras-chave: Angiotensina II. Aorta. Hipertensão. Endotélio. Exercício. Óxido Nítrico.

Superóxidos.

ABSTRACT

The present work aimed to study the effects of acute exercise and training on the local

mechanisms that modulate the aorta responses to angiotensin II (Ang II), in animals submitted

to the two kidney, one clip (2K1C) renovascular hypertension model. Therefore, the

functional study of the thoracic aorta responses to Ang II, sodium nitroprusside and

depolarizing solution were proposed in normotensive (SHAM) and hypertensive (2K1C) male

Wistar rats, sedentary and trained, studied at rest and after acute exercise. The challenges with

Ang II were made in the absence and presence of PD 123.319 (selective AT2 receptor

inhibitor), L-NAME (nonselective inhibitor of nitric oxide synthase) indomethacin (non-

selective cyclooxygenase inhibitor) and tiron (free radical scavenger). Some preparations

were studied after endothelial removal. At the same time, biochemical analyzes were

performed to evaluate lipid peroxidation (FOX) and plasma antioxidant capacity (FRAP). The

training attenuated the responses of the aorta to Ang II in SHAM animals. This reduction in

response ceased to exist after endothelial removal and treatment with PD 123.319, L-NAME,

indomethacin and tiron. Exposure to acute exercise attenuated the sensitivity of the aorta to

Ang II in 2K1C animals, attenuation no longer observed after endothelial removal and

treatment with PD 123.319 and L-NAME. However, in the presence of indomethacin, the

magnitude of response to Ang II was reduced for all experimental groups. Additionally, in the

presence of tiron, there was attenuation of response to Ang II in animals exposed to training

and acute exercise. Interestingly, the inverse occurred with trained animals that were re-

exposed to exercise. There was no difference in the response pattern of the aortas after

challenge with nitroprusside and depolarizing solution, both in SHAM and 2K1C animals,

sedentary and trained, exposed or not to acute exercise. Training and/or acute exercise also

did not alter the plasma concentrations of FOX and FRAP in SHAM and 2K1C animals. The

present study demonstrates that in SHAM animals, the responses of the aorta to Ang II are

modulated, in animals exposed to training, by nitric oxide of endothelial origin, released as a

consequence of the activation of AT2 receptors. In 2K1C animals, this modulating endothelial

mechanism is suppressed by the high tissue concentration of superoxide anion leading to a

state of oxidative stress.

Keywords: Angiotensin II. Aorta. Hypertension. Endothelium. Exercise. Nitric Oxide.

Superoxide.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fluxograma do protocolo experimental.....................................................................22

Figura 2 - Massas corporais obtidas de animais SHAM e 2R1C..............................................26

Figura 3 - Massas úmidas cardíacas obtidas em animais SHAM e 2R1C................................26

Figura 4 - Desempenho em esteira dos animais SHAM e 2R1C..............................................27

Figura 5 - Valores de pressão arterial sistólica de ratos SHAM e 2R1C..................................27

Figura 6 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta

intactas e deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença PD 123.319 10-6

M, L-

NAME 10-4

M ou indometacina 10-5

M, provenientes de animais

SHAM.......................................................................................................................................29

Figura 7 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta

intactas e deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6

M, L-

NAME 10-4

M ou indometacina 10-5

M, provenientes de animais

2R1C.........................................................................................................................................31

Figura 8 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta

intactas tratadas com tiron 10-4

M, provenientes de animais SHAM e 2R1C..........................33

Figura 9 - Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio obtidas em preparações

de aorta intactas provenientes de animais SHAM e 2R1C.......................................................34

Figura 10 - Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio obtidas em preparações de

aorta deendotelizadas provenientes de animais SHAM e 2R1C...............................................35

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas e

deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6

M, L-NAME

10-4

M ou indometacina 10-5

M, provenientes de animais SHAM.............................................30

Tabela 2 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas e

deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6

M, L-NAME

10-4

M ou indometacina 10-5

M, provenientes de animais 2R1C................................................32

Tabela 3 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas na

presença de Tiron 10-4

M, provenientes de animais SHAM e 2R1C.........................................33

Tabela 4 - Valores plasmáticos (µM/L) das análises bioquímicas do balanço redox (FOX e

FRAP) em animais SHAM e 2R1C..........................................................................................34

Tabela 5 - Valores de pEC50 para nitroprussiato de sódio e cloreto de potássio, determinados

em aortas provenientes de animais SHAM e 2R1C..................................................................35

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACh Acetilcolina

AMPc Adenosina-3’,5’-monofosfato cíclico

Ang II Angiotensina II

ANOVA Análise de Variância

Basal Aferição da pressão arterial sistólica antes da cirurgia

BHT

CaCl2

HidroxiTolueno Butilado

Cloreto de Cálcio

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais

COX Ciclo-oxigenase

CO2 Gás Carbônico

ECA Enzima Conversora de Angiotensina

EC50 Concentração molar do agonista responsável por 50% do efeito máximo

EET Ácido epóxi-eicosatrienóico

Emax

Endo -

Efeito desencadeado pela concentração supra máxima do agonista

Deendotelização

eNOS Óxido Nítrico Sintase endotelial

E.P.M. Erro Padrão da Média

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

FAMEMA Faculdade de Medicina de Marília

FeCl3.6H2O Cloreto Férrico hexahidratado

Fe2+

Íon Ferroso

Fe3+

Íon Férrico

Final Aferição da pressão arterial sistólica quatro semanas após a cirurgia

FOX Complexo Fe3+

- Xilenol Laranja

FRAP Poder Antioxidante de Redução do Ferro

GMPc Monofosfato de Guanosina cíclico

HAS Hipertensão Arterial Sistêmica

HCl Ácido Clorídrico

H2SO4 Ácido Sulfúrico

KCl Cloreto de Potássio

KH2PO4 Fosfato de Potássio

Km/h Quilômetro por hora

LOX Lipo-oxigenase

L-NAME N-nitro-L-arginina-metil-ester

M Molar

mg/dia Miligrama por dia

mg/kg Miligrama por quilo

MgSO4.7H2O Sulfato de Magnésio heptahidratado

mL Mililitro

mmHg Milímetro de mercúrio

mM Milimolar

min. Minuto

mol/L Molar

NaCl Cloreto de Sódio

NADPH Fosfato de Dinucleotídeo de Adenina e Nicotinamida

NaHCO3 Bicarbonato de Sódio

Nm Nanômetro

nM Nanomolar

NO Óxido Nítrico

NOR Noradrenalina

NOS Óxido Nítrico Sintase

ONOO- Peroxinitrito

O2 Gás Oxigênio

O2-

Ânion Superóxido

P Probabilidade de significância

PA

PAS

Pressão Arterial

Pressão Arterial Sistólica

PD 123.319 Bloqueador de receptor AT2 da Angiotensina II

pEC50 Negativo do logarítmo da EC50

pH Escala para medida do potencial Hidrogeniônico

PGI2

PGH2

Prostaciclina

Prostaglandina H2

RPM Rotações Por Minuto

SE Sedentário Exercício

SHAM Normotenso

SNS

SOD

Sistema Nervoso Autônomo Simpático

Superóxido Dismutase

SR Sedentário Repouso

SRAA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona

TE Treinado Exercício

TPTZ 2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine

TR Treinado Repouso

V/V Volume por volume

μL Microlitro

Μmol Micromol

2K1C Hypertensive by renovascular hypertension model 2 Kidney – 1 Clip

2R1C Hipertenso pelo modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip

°C grau Celsius

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 14

1.1 Controle do tônus vascular ............................................................................... 14

1.2 Exercício físico e mecanismos que controlam o tônus vascular ...................... 17

1.3 Hipertensão arterial e controle do tônus vascular ........................................... 18

1.3.1 Exercício e controle do tônus vascular na hipertensão ......................................... 19

2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 20

2.1 Geral .................................................................................................................. 20

2.2 Específicos ......................................................................................................... 20

3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 21

3.1 Delineamento Experimental ............................................................................. 21

3.2 Protocolo de distribuição dos animais nos grupo experimentais .................... 21

3.3 Protocolo de exercício/treinamento .................................................................. 22

3.4 Modelo de hipertensão 2R1C ........................................................................... 22

3.5 Medida da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda

(“tail cuff”) ........................................................................................................ 23

3.6 Eutanásia dos animais e coleta de material ...................................................... 23

3.7 Estudo funcional de reatividade vascular ........................................................ 23

3.8 Quantificação da peroxidação lipídica ............................................................. 25

3.9 Avaliação da capacidade antioxidante do plasma ........................................... 25

3.10 Análise Estatística ............................................................................................. 25

4 RESULTADOS ................................................................................................. 26

4.1 Massas corporais e cardíacas ........................................................................... 26

4.2 Desempenho em esteira..................................................................................... 27

4.3 Pressão Arterial Sistólica .................................................................................. 27

4.4 Reatividade vascular à angiotensina II ............................................................ 28

4.5 Análises bioquímicas ......................................................................................... 33

4.6 Reatividade vascular ao nitroprussiato de sódio e à solução despolarizante

de cloreto de potássio... ..................................................................................... .34

5 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 36

6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 41

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 42

APÊNDICES .............................................................................................................. 49

14

1 INTRODUÇÃO

O envelhecimento é um fator de risco para doenças cardiovasculares, que constituem a

principal causa de morbimortalidade na sociedade moderna. Mundialmente as doenças

cardiovasculares são responsáveis por cerca de 30 % de todas as mortes, sendo que a

hipertensão arterial sistêmica (HAS) é a mais comum. Cabe ressaltar que a incidência destas

doenças cardiovasculares tende a aumentar drasticamente nos próximos anos. Neste sentido,

torna-se necessário um maior aprofundamento acerca dos mecanismos fisiopatológicos

relacionados à HAS, bem como a identificação de possíveis estratégias, tanto medicamentosas

quanto não medicamentosas, que podem ser empregadas para o tratamento desta doença.1,2

1.1 Controle do tônus vascular

A pressão arterial (PA) é produto do débito cardíaco pela resistência total periférica e,

dessa forma, modificações nos mecanismos que regulam o tônus vascular estão envolvidas na

gênese e/ou manutenção da HAS. O tônus vascular é controlado primeiramente pela ação do

sistema nervoso autônomo simpático (SNS). Já está bem estabelecido que as terminações

nervosas do SNS liberam noradrenalina (NOR) e esta, atuando sobre os adrenoceptores

presentes na musculatura lisa vascular (predominantemente os α1-adrenoceptores) leva à

vasoconstrição.3 Em paralelo, a noradrenalina atua em receptores presentes no endotélio

vascular, sobretudo nos α2 e β2-adrenoceptores, levando à liberação de mediadores endoteliais

que acabam por modular a vasoconstrição mediada pela estimulação dos α1-adrenoceptores

presentes na musculatura lisa vascular.4 Com efeito, isto indica que as ações do SNS sobre os

vasos precisam ser moduladas pelo endotélio vascular a fim de que a homeostasia circulatória

seja mantida.

O endotélio reveste todo o vaso, sendo considerado um extenso tecido endócrino.

Diversos autores pontuam que o endotélio vascular exerce a função de sensor de alterações do

fluxo sanguíneo e é um importante modulador do tônus vascular.5,6,7,8

A modulação endotelial

sobre o tônus vascular fisiológico se dá através da produção equilibrada de substâncias tanto

vasodilatadoras quanto vasoconstritoras.9,10

Dentre as substâncias vasodilatadoras liberadas

pelo endotélio, destaca-se o óxido nítrico (NO), uma molécula muito pequena, extremamente

lipossolúvel e instável. Sua síntese acontece através de uma família de enzimas denominadas

óxido nítrico sintase (NOS), sendo que a isoforma endotelial (eNOS) é talvez a principal

produtora de NO em condições fisiológicas. A eNOS está constitutivamente presente no

endotélio vascular e é ativada pelo aumento da concentração intracelular de cálcio, que se dá

pela ação de mediadores endógenos como a angiotensina II (Ang II) ou por estímulos físicos

15

como o cisalhamento exercido pelo fluxo sanguíneo sobre a superfície endotelial.7,11,12

A

eNOS produz pequenas quantidades de NO, que difunde-se para a musculatura lisa vascular e

interage com o grupo heme da guanilato ciclase solúvel.13

Como resultado, há formação do

monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), cuja função é diminuir o nível intracelular de íon

cálcio. Assim, haverá ativação da proteína quinase e consequente abertura dos canais de íon

potássio, ocasionando o relaxamento da musculatura lisa.14

No endotélio vascular ocorre também a produção de prostanóides. A produção destes

prostanóides se dá através de uma via bioquímica que tem início pela ativação da enzima

fosfolipase A2, responsável pela produção de ácido araquidônico a partir de fosfolípideos de

membrana. O ácido araquidônico presente no citoplasma é substrato tanto para as enzimas

ciclo-oxigenases (COX) quanto para as lipo-oxigenases (LOX).15

A ação da prostaciclina

(PGI2), considerada um importante mediador vasodilatador endotelial, se dá pela ativação de

receptores P. A ativação destes receptores, que são acoplados à proteína G, leva à ativação da

enzima adenilato ciclase e à consequente elevação das concentrações intracelulares de

adenosina-3’,5’-monofosfato cíclico (AMPc) que, por sua vez, ativa a proteína quinase A para

promover a vasodilatação.9,16,17

Cabe ressaltar, por fim, que a PGI2 não é o único prostanóide

vasodilatador.15

O endotélio vascular também libera prostanóides vasoconstritores, tais como a

prostaglandina H2 (PGH2).6 A ação da PGH2 se dá através da ativação do receptor TP

acoplado à proteína G, que ativa a fosfolipase C levando à síntese de diacilglicerol e

inositoltrifosfato, ativando a proteína quinase, que ocasiona o aumento intracelular de íons

cálcio e consequentemente vasoconstrição.17,18,19

Mesmo a PGI2, considerada um prostanóide

vasodilatador, pode apresentar ações vasoconstritoras sobre alguns leitos vasculares em

determinadas situações fisiopatológicas.20

Cabe ressaltar, por fim, que outras substâncias de

origem endotelial, além do NO e dos prostanóides, podem exercer papel decisivo no controle

do tônus vascular.16,21

Paralelamente ao SNS, o controle do tônus vascular também envolve a ação do

sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA). Nesse sistema, destaca-se como um dos

principais efetores a Ang II, um potente peptídeo vasoconstritor. A Ang II é formada por meio

da clivagem enzimática da angiotensina I, que se dá principalmente pela ação da enzima

conversora de angiotensina (ECA). Vale ressaltar que as ações vasculares da Ang II também

devem ser moduladas pelos mecanismos endoteliais mencionados anteriormente, a fim de que

a homeostasia circulatória seja garantida.22

16

As ações cardiovasculares da Ang II se dão pela ativação tanto dos receptores AT1

quanto AT2, que geralmente resulta em efeitos opostos. Esta ação simultânea da Ang II em

AT1 e AT2 favorece a homeostasia circulatória.22-27

Por meio da ativação do receptor AT1, a

Ang II promove a vasoconstrição, indução do aumento da contratilidade e hipertrofia

cardíaca, aumento da atividade simpática e da secreção de aldosterona e vasopressina, entre

outros efeitos.9

A ativação dos receptores AT1 também leva à expressão/ativação da enzima fosfato de

dinucleotídeo de adenina e nicotinamida (NADPH) oxidase no endotélio vascular,

considerada a principal geradora de espécies reativas de oxigênio, sendo a Ang II um potente

ativador deste complexo. Ao ativar o receptor AT1, utiliza vias sinalizadoras intracelulares e

estimula a expressão de genes responsáveis pela ativação deste complexo, que culmina com a

formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente o ânion superóxido (O2-),

responsável por 70% dos efeitos deletérios da Ang II. O O2-

pode atuar como um agente

redutor e, ao doar elétron ao NO, contribui para a formação de peroxinitrito (ONOO-). Por sua

vez, esta sequência de eventos ativa fatores de transcrição nuclear, levando à expressão de

genes pró-inflamatórios e consequente remodelamento vascular, causando dano tecidual por

estresse oxidativo.6,28,29

O estresse oxidativo ocasionado indiretamente pela Ang II causa diminuição da

biodisponibilidade de NO endotelial, além de vasoconstrição induzida pelo próprio O2- e das

consequências deletérias do ONOO-. Com isso, são reforçadas a vasoconstrição, a inflamação

vascular e o remodelamento celular, desencadeados diretamente pela Ang II.30

A perda da

integridade vascular expõe as células da musculatura lisa vascular à ação de substâncias

vasoconstritoras que estimulam a proliferação celular, causando hiperplasia e hipertrofia da

célula muscular lisa, além de disfunção endotelial, um marcador precoce das doenças

cardiovasculares.6,31

Dessa forma, a Ang II participa tanto da homeostasia circulatória quanto

de processos fisiopatológicos como a HAS e danos cardiovasculares relacionados a esta

doença.9,16,23

Por outro lado, tem sido demonstrado que as ações da Ang II em receptores AT2 se

contrapõem aos efeitos vasoconstritores mediados pelos receptores AT1,22,32-34

levando à

atenuação da inflamação, fibrose e apoptose, além de promover ações vasodilatadoras em

diversos leitos vasculares.35

Verificou-se em artérias renais e mesentéricas de ratos que estas

ações vasodilatadores mediadas por AT2 envolvem liberação de bradicinina e/ou NO, com

consequente aumento de GMPc nas células musculares.22,24-27

A ativação deste receptor

também pode ter ação vasodilatadora direta devido a ação do citocromo P450 sobre o ácido

17

araquidônico com consequente formação do ácido epóxi-eicosatrienóico (EET), fenômeno

observado em arteríolas eferentes de coelhos.8

1.2 Exercício físico e mecanismos que controlam o tônus vascular

Durante o exercício físico, ocorre um importante aumento da demanda metabólica,

sobretudo na musculatura cardíaca e na musculatura esquelética em atividade.36,37

Com isso,

ocorre um aumento no fluxo sanguíneo para o coração, diafragma e musculatura esquelética

envolvida na locomoção à custa de uma diminuição de fluxo para pele, estômago, intestinos,

pâncreas, fígado, rins, baço e musculatura esquelética em repouso.38,39

Estas modificações

circulatórias, que recebem a denominação genérica de "redistribuição circulatória", podem

influenciar ou ser influenciadas pelos diversos mecanismos reguladores do tônus vascular.

Para uma compreensão mais aprofundada destes processos é necessário considerar que a

redistribuição circulatória acarreta um aumento do cisalhamento exercido pelo fluxo

sanguíneo sobre a camada endotelial das artérias.40

Com isso, pode ocorrer um aumento da

expressão de eNOS e uma maior produção endotelial de NO41-44

e/ou prostanóides.45,46

Neste

sentido, tanto o exercício agudo47

quanto o treinamento48-52

parecem aumentar a liberação

endotelial de NO que, por sua vez, modula o tônus em diversos leitos vasculares. De fato, já

foi demonstrado que NO e prostanóides atenuam a vasoconstrição induzida pela estimulação

α-adrenérgica em território vascular da musculatura esquelética humana envolvida no

exercício.53

Curiosamente, estas adaptações endoteliais relacionadas ocorrem sobretudo em

territórios vasculares de regiões recrutadas durante o exercício.48

Dessa forma, é cabível

afirmar que a ação destes mecanismos vasomotores pode dirigir o fluxo sanguíneo para os

leitos vasculares envolvidos no suprimento de demandas metabólicas teciduais que foram

elevadas pelo exercício.

Adaptações promovidas pelo exercício sobre os mecanismos locais que regulam o

tônus vascular já foram descritas em diversos estudos anteriores. Estas adaptações geralmente

melhoram a função endotelial e favorecem a homeostasia circulatória.54-56

Cabe ressaltar, no

entanto, que os efeitos do exercício físico não se dão apenas sobre as ações cardiovasculares

do SNS. Evidências prévias sugerem que as ações do SRAA sobre o sistema cardiovascular

também podem ser influenciadas pelo exercício.57

De fato, exposições repetidas ao exercício

podem levar à modificações nos mecanismos locais de controle do tônus vascular e, como

consequência, influenciar a capacidade de resposta de diversos leitos vasculares à Ang II. De

fato, foi demonstrado que ratos submetidos a exposições repetidas ao exercício de natação,

apresentaram redução na capacidade de resposta das aortas e das artérias mesentéricas à Ang

18

II.58

Além disso, em animais submetidos ao exercício, prostanóides vasodilatadores passam a

cooperar com o NO para manter reduzidas as respostas à Ang II em veia femoral59

e em veia

mesentérica60

de ratos. O treinamento também reduz os níveis plasmáticos de Ang II61

e

diminui a vasoconstrição mediada por este peptídeo em aorta de ratos.62

1.3 Hipertensão arterial e controle do tônus vascular

Modificações no funcionamento endotelial, acompanhadas ou não de alterações nas

células musculares lisas ou da matriz extracelular dos diferentes vasos que integram o sistema

cardiovascular podem levar à HAS e/ou contribuir para a sua manutenção. Isto porque estas

modificações, que geralmente envolvem aumento da produção de O2-, fatores de crescimento

e moléculas de adesão, favorecem o aumento do tônus vascular e, mas tardiamente, as

alterações estruturais dos vasos sanguíneos.10,28,34,63

Para que se possa melhor compreender a

HAS, estes mecanismos de controle vascular também devem ser adequadamente

compreendidos. Neste sentido, é indispensável o emprego de modelos experimentais que

simulam a HAS dos seres humanos. Existem diferentes modelos experimentais de

hipertensão, que reproduzem com algum grau de confiabilidade as diversas etiopatogenias da

HAS humana.64

Dentre estes, o modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip (2R1C) é

o que mais se assemelha à hipertensão renovascular humana.65

Este modelo de hipertensão é

causado pela estenose da artéria renal através da implantação de um clip de prata.66

Como

resultado da diminuição do fluxo renal, ocorre liberação de renina na corrente sanguínea

levando à formação de Ang II pela ativação do SRAA. Assim, na hipertensão 2R1C, ocorre

uma intensa ativação do SRAA que culmina com a elevação dos níveis circulantes de Ang

II.67,68

Na fase aguda da hipertensão 2R1C, entre 4-5 semanas de estenose, os níveis

circulantes de Ang II são altos, predominando sua função endócrina. Porém, a partir da 6ª

semana de indução, os níveis plasmáticos de Ang II são atenuados, e por este motivo suas

ações autócrina e parácrina passam a ser predominantes.66

Devido a sua ação endócrina, a

Ang II aumenta a PA mediante aumento da retenção de sódio e água pela aldosterona e

também aumenta a atividade simpática. E com a ativação do SRAA há hipertrofia das células

musculares lisas e remodelamento vascular.69

Neste modelo, a Ang II também ativa o

complexo enzimático NADPH oxidase, com consequente formação de EROs e aumento do

estresse oxidativo.68,70

Como já foi apresentado, esta concentração de EROs no endotélio

reduz a biodisponibilidade de NO e atenua a vasodilatação dependente do endotélio.71,72

A

presença de EROs também pode regular a expressão/atividade das fosfolipases A2 e,

19

consequentemente, a produção de prostanóides.73

Esta disfunção endotelial desencadeada pela

hipertensão 2R1C foi observada tanto nas artérias de condutância como aorta72

e artéria

caudal,74

quanto em artérias de resistência, como a artéria coronária.75

1.3.1 Exercício e controle do tônus vascular na hipertensão

A literatura é abundante em estudos que mostram adaptações cardiovasculares

promovidas pelo exercício em animais normotensos. Todavia, existem poucos estudos que

analisam os efeitos vasculares do exercício na hipertensão 2R1C. Estes poucos estudos, no

entanto, demonstram que o exercício agudo promove benefícios cardiovasculares nos animais

2R1C.25,76

Tem sido descrito que o treinamento aumenta o vasorrelaxamento dos anéis de

aorta torácica, além de atenuar a rigidez arterial decorrente da hipertensão renovascular em

ratos 2R1C, devido à melhora na capacidade de relaxamento vascular em consequência de

uma maior atividade dos canais de potássio.77

O treinamento também reverte à disfunção

endotelial causada pela hipertensão 2R1C e, por conta disso, atenua a resposta vasoconstritora

à fenilefrina, em aorta de ratos 2R1C.70

Com base nesta revisão é possível afirmar que o exercício agudo e o treinamento

promovem adaptações benéficas ao sistema cardiovascular dos animais 2R1C. Existem

evidências de que a função endotelial e o balanço redox podem ser melhorados pelo exercício

agudo nos animais 2R1C.76

Contudo, esta mesma revisão de literatura também sugere que o

controle do tônus vascular envolve diversos mecanismos locais que podem modular de forma

distinta as ações do SNS e do SRAA. Assim, se por um lado existem evidências de que o

treinamento promove modificações vasculares que levam a uma atenuação das ações

vasoconstritoras da fenilefrina, por outro, pouco se sabe a respeito de seus efeitos sobre as

ações vasculares da Ang II. Neste sentido, o presente estudo preenche uma importante lacuna

de conhecimento na medida em que aprofunda a compreensão dos efeitos do exercício sobre

os mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C.

20

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Estudar as respostas da aorta torácica à Ang II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C na

fase aguda, bem como os efeitos do exercício agudo e do treinamento sobre estas respostas.

2.2 Específicos

2.2.1 Investigar a participação dos mecanismos moduladores endoteliais relacionados ao

NO e aos prostanóides, bem como o envolvimento dos receptores AT2, em eventuais

modificações de respostas à Ang II induzidas pelo exercício agudo e/ou treinamento em aorta

de animais normotensos e hipertensos 2R1C.

2.2.2 Verificar se alterações no balanço redox podem estar envolvidas em eventuais

modificações de respostas à Ang II induzidas pelo exercício agudo e/ou treinamento em aorta

de animais normotensos e hipertensos 2R1C.

21

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Delineamento Experimental

Foram utilizados 123 ratos machos Wistar, com 8 semanas de idade, provenientes do

biotério central da Faculdade de Medicina de Marília (Famema). Durante todo o período de

experimento, os animais permaneceram no biotério de apoio, ligado ao laboratório de

Farmacologia. Esses animais foram mantidos em gaiolas coletivas (4 animais/caixa),

submetidos à dieta (APÊNDICE A) e água ad libitum em ambiente com temperatura

controlada (23-25°C) e ciclo claro-escuro de 12 h. Para evitar discrepância no peso, o

crescimento dos animais foi monitorado de forma que, tanto os sedentários quanto os

submetidos ao exercício agudo ou treinamento, pesassem entre 400 e 450 g no dia do estudo

funcional das respostas vasomotoras. Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de

Ética no Uso de Animais (CEUA) com o número de protocolo 300/14.

3.2 Protocolo de distribuição dos animais nos grupos experimentais

A distribuição dos animais nos grupos experimentais foi realizada levando em

consideração a capacidade de exercício inata de cada animal, utilizando a estratégia proposta

por Melo, Martinho e Michelini.78

Brevemente, ratos de 8 semanas de idade foram treinados

diariamente (sessões de 10 minutos) para andar em esteira (Movement Technology LX 170)

com velocidade de 0,3 a 0,5 Km/h, sem inclinação. Ao final deste período, no 10° dia, estes

animais foram submetidos a um teste de esforço para a capacidade individual de corrida na

esteira. Neste teste os animais foram colocados em esteira com velocidade de 0,3 Km/h. Em

seguida, a cada 3 minutos, a velocidade da esteira foi aumentada em 0,3 Km/h até que o

animal apresentasse sinais de exaustão (parar de correr mesmo quando estimulados por leve

pressão na cauda). Para cada animal, foi registrado o tempo que este conseguiu correr até a

exaustão na escala de acréscimo de velocidade acima mencionada (capacidade máxima de

exercício). Ao final do teste de esforço, os animais foram distribuídos nos grupos, de acordo

com a capacidade máxima de exercício de cada um. Assim, os animais foram alocados em

quatro grupos: dois sedentários, estudados no repouso (grupo sedentário repouso – SR) e

imediatamente após uma sessão de exercício (grupo sedentário exercício – SE) e dois

treinados, estudados em repouso (grupo treinado repouso – TR) e imediatamente após uma

sessão de exercício (grupo treinado exercício – TE). Com base no teste de esforço, calculou-

se também a velocidade média de cada grupo, utilizada para o treinamento. A sessão de

exercício, no dia eutanásia, a qual o grupo SE foi submetido durou 15 minutos (tempo de

exercício previsto para o primeiro dia de treinamento) e a sessão de exercício do grupo TE

22

durou 60 min., com velocidade de 60% da capacidade máxima de exercício média de cada um

dos grupos.

Figura 1: Fluxograma do protocolo experimental

3.3 Protocolo de exercício/treinamento

Foi utilizada a metodologia de treinamento descrita em Melo, Martinho e Michelini,78

segundo a qual o grupo a ser treinado iniciou o programa de treinamento físico a uma

velocidade da esteira correspondente a 60% da média das velocidades máximas obtida pelos

animais pertencentes a este grupo no teste de esforço. Este programa de treinamento consistiu

em sessões diárias de exercício (1 hora), 5 dias/semana durante 10 semanas. Nas 3 primeiras

semanas, o tempo de exercício foi progressivamente aumentado de 20 minutos para 1

hora/dia, em esteira não inclinada (APÊNDICE B).

Na sexta semana de treinamento, o teste de esforço foi repetido e a velocidade da

esteira foi ajustada de acordo com o ganho do grupo em termos de desempenho. O

desempenho dos animais neste teste de esforço também serviu para indicar indiretamente a

efetividade do protocolo de treinamento utilizado. O peso dos animais também foi monitorado

no decorrer do treinamento. Por fim, a massa úmida do coração foi verificada no dia da

eutanásia (ao final das 10 semanas de treinamento).

3.4 Modelo de hipertensão 2R1C

A hipertensão renovascular 2R1C foi induzida em ratos por meio do modelo descrito

por Goldblatt et al.,66

com algumas adaptações, sendo que a cirurgia para a colocação do clip

foi realizada no decorrer do período de treinamento – 4 semanas antes do sacrifício dos

animais para os experimentos (APÊNDICE C). Para tanto, os ratos foram anestesiados com

Tribromoetanol (Sigma; 250 mg/kg, por via intraperitoneal) para depois serem submetidos a

uma laparotomia na linha média. Em seguida, a artéria renal esquerda foi isolada e, nesta, se

23

implantou um grampo de prata (clip) de 0,25 mm de diâmetro. Os animais normotensos

(SHAM) foram submetidos à laparotomia, porém sem a colocação do clip na artéria renal. No

pós-operatório, a analgesia foi feita com Dipirona Sódica (Farmace; 100 mg/dia, por 2 dias,

via subcutânea) e o antimicrobiano utilizado foi o Enrofloxacino (Bayer; 0,01 mg/dia, por 2

dias, via subcutânea). Após a cirurgia, os animais permaneceram em gaiolas isoladas por 4

dias. Neste período, os animais pertencentes aos grupos destinados ao treinamento (TR e TE)

foram poupados do exercício.

3.5 Medida da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda (“tail cuff”)

A pressão arterial sistólica (PAS) foi aferida por pletismografia de cauda. Para isso, os

ratos foram aquecidos a uma temperatura média de 40°C por 20 min., para a dilatação da

artéria caudal. Em seguida, os animais foram cuidadosamente acondicionados em um

contensor apropriado ao seu tamanho, e seu campo visual foi reduzido com o auxílio de uma

toalha vermelha, proporcionando assim um ambiente de estresse controlado.79

Na cauda de

cada animal, foi colocado um manguito acoplado a um sensor de fluxo para o registro das

pressões sistólicas com auxílio de um Powerlab 8/30 data acquisition system®

(Australia

ADInstruments). As aferições de pressão foram realizadas antes da cirurgia (Basal) e quatro

semanas após a cirurgia (Final), sempre no período da manhã. Foram considerados

hipertensos (2R1C) os animais que obtiveram um aumento maior que 20 mmHg na aferição

de PAS final em relação à PAS basal. Cabe ressaltar que os animais que não atingiram esse

aumento da PAS foram excluídos do estudo.

3.6 Eutanásia dos animais e coleta de material

Os animais foram eutanasiados em câmara de gás carbônico (CO2), em uma

concentração aproximada de 40% de CO280

, e imediatamente exsanguinados através da

punção da veia cava com auxílio de agulha/seringa heparinizada. O sangue obtido neste

procedimento foi centrifugado para a coleta do plasma, que foi congelado para posterior

análises bioquímicas, conforme o método preconiza. Paralelamente, após toracotomia, a aorta

torácica destes animais foi cuidadosamente dessecada e removida para um béquer contendo

solução de Krebs-Henseleit (APÊNDICE D).

3.7 Estudo funcional de reatividade vascular

Segmentos da aorta torácica foram transferidos para uma placa de Petri recoberta com

parafina e solução de Krebs-Henseleit, e sob lupa foram separados dos tecidos adjacentes e

24

seccionados em anéis de 2-3 mm. Estes anéis foram montados entre 2 ganchos de metal

inseridos no lúmen. Em seguida, essas preparações foram colocadas em cubas para estudo de

órgão isolado com capacidade para 2 mL, em solução de Krebs-Henseleit, pH 7,4, gaseificada

com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) e aquecida a 37°C. Nestas cubas, um dos

ganchos foi fixado no fundo e o outro, no transdutor isométrico de força para a detecção de

modificações do tônus vascular. Modificações de tônus vascular foram registradas em

Powerlab 8/30 data acquisition system®

(Australia ADInstruments) (APÊNDICE E). As

preparações permaneceram em repouso durante 60 minutos, sob uma tensão basal de 1,5 g

para estabilização. Neste período, a solução nutritiva foi substituída a cada 20 minutos.

A integridade do endotélio das preparações foi avaliada funcionalmente. Para isso,

preparações pré-contraídas com NOR 10-5

M, no platô da resposta, foram desafiadas com

acetilcolina (ACh) 10-4

M. O relaxamento igual ou superior a 80% da contração inicial foi

considerado indicativo de integridade endotelial. Algumas preparações tiveram o endotélio

removido mecanicamente (preparações deendotelizadas) antes da montagem nas cubas de

órgão isolado. Neste caso, a ausência de relaxamento induzido por ACh 10-4

M foi indicativa

da efetividade de remoção endotelial.

Para o estudo da reatividade vascular, as preparações foram desafiadas

cumulativamente com Ang II (Sigma; 10-11

- 10-6

Mol/L), solução despolarizante de cloreto de

potássio (Sigma; 4,7x10-3

– 12x10-3

M, compensado pela redução do sódio em solução) e

nitroprussiato de sódio (Sigma; 10-9

– 10-4

Mol/L). Os desafios com Ang II foram feitos na

ausência e na presença de PD 123.319 (Sigma; 10-6

M; inibidor seletivo do receptor AT2), N-

nitro-L-arginina-metil-ester (Sigma; L-NAME 10-4

M; inibidor não seletivo da NOS),

indometacina (Sigma; 10-5

M; inibidor não seletivo da COX) e tiron (Sigma;10-4

M;

sequestrante de radicais livres). Todos estes inibidores foram administrados diretamente ao

banho 20 minutos antes do início dos desafios, e as respostas vasomotoras produzidas foram

expressas graficamente como curvas concentração-resposta. A partir destas curvas

concentração-resposta, foram obtidos o pEC50, que consiste no negativo do logarítmo da

concentração molar do agonista responsável por 50% do efeito máximo (EC50) e o Emax, que

consiste no efeito desencadeado pela concentração supra máxima do agonista. Para o cálculo

da EC50, os valores determinados nos registros foram normalizados pela máxima resposta

(maior valor da curva). Em seguida, fez-se o cálculo da EC50 por regressão não linear através

do programa Prisma®

(GraphPad Software Corporation).

25

3.8 Quantificação da peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica, que indica o grau de estresse oxidativo do meio biológico, foi

estimada pela análise do consumo do Complexo Fe3+

- xilenol laranja (FOX), segundo a

técnica descrita originalmente por Jiang e Cols.81

e adaptada para plasma e soro por Arab e

Steghens.82

Este método se baseia na oxidação do íon ferroso (Fe2+

) a íon férrico (Fe3+

) na

presença de hidroperóxidos lipídicos e formação de complexos de Fe3+

com o xilenol laranja,

gerando uma cor característica, a qual pode ser medida espectrofotometricamente.

Para a determinação do grau de estresse oxidativo no plasma, amostras de sangue

foram colhidas em seringas heparinizadas e posteriormente centrifugadas a 3000

RPM/5min./4°C. Em seguida, 20 μL do plasma coletado foram acrescidos a 180 μL do

reagente de trabalho (metanol absoluto 81%; xylenol orange 100 μmol; ácido sulfúrico -

H2SO4 25 mM; hidroxi tolueno butilado - BHT 40 mM; sulfato ferroso 250 μmol). Por fim,

procedeu-se a leitura das absorbâncias a 560 ηm, em paralelo a uma curva padrão de peróxido

de hidrogênio (8,8 M), por meio de um espectrofotômetro.

3.9 Avaliação da capacidade antioxidante do plasma

Esta avaliação foi feita pelo método do FRAP (poder antioxidante de redução do

ferro). Para isso foram preparadas três soluções: A (tampão acetato: 300 mM, pH 3,6 e ácido

clorídrico - HCl 40 mM), B (2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine - TPTZ - 10 mM) e C (cloreto

férrico hexahidratado - FeCl3.6H2O - 20 mM), formando o reagente de trabalho A+ B + C na

proporção 10:1:1 (V/V). O sangue dos animais foi coletado em seringa heparinizada e

posteriormente centrifugado a 2500 RPM/10 min./4° C. Em seguida, 0,8 mL do plasma obtido

foram adicionados a uma mistura de água deionizada (2,4mL) com o reagente de trabalho

(0,25mL). Depois, esta solução foi colocada em microplaca e as absorbâncias foram lidas a

593 nm, em paralelo a uma curva padrão de sulfato ferroso, por meio de um

espectrofotômetro.83

3.10 Análise Estatística

Os dados obtidos foram expressos pela média ± erro padrão da média (E.P.M.). A

análise estatística dos resultados foi realizada por análise de variância (ANOVA) de duas vias

(treinamento e exposição ao exercício) e ANOVA de medidas repetidas, seguida pelo pós-

teste de Bonferroni. Diferenças nos valores de p<0,05 foram consideradas estatisticamente

significativas. Para realização dos testes estatísticos foram utilizados os programas Prisma® e

SPSS®.

26

4 RESULTADOS

4.1 Massas corporais e cardíacas

Os dados obtidos mostram que nem os diferentes protocolos de exercício aos quais os

animais foram expostos, tampouco a elevação da PAS induzida pelo modelo de hipertensão

utilizado, causaram modificações significativas de massa corporal (Figuras 2A e 2B). As

massas úmidas cardíacas também não foram significativamente diferentes entre os grupos

estudados (Figuras 3A e 3B).

Figura 2 - Massas corporais obtidas em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e

treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE,

respectivamente), determinadas durante o protocolo de treinamento. Valores expressos em média ± erro padrão

da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).

Figura 3 - Massas úmidas cardíacas obtidas em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos

sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e

TE, respectivamente), determinadas no dia da eutanásia. Valores expressos em média ± erro padrão da média

(E.P.M). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

300

350

400

450

500

SR (14 )

SE (15 )

T R (14 )

T E (16 )

SHAMA

Semanas de Pro toco lo

Ma

ss

as

Co

rp

ora

is (

g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

300

350

400

450

500

SR (16 )

SE (16 )

T R (16 )

T E (16 )

2R 1CB

Semanas de Pro toco lo

Ma

ss

as

Co

rp

ora

is (

g)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

SR (14 )

SE (15 )

T R (14 )

T E (16 )

SHAMA

10° Semana de Pro toco lo

Ma

ss

as

Úm

ida

s C

ard

íac

as

(g

)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

SR (16 )

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T R (16 )

T E (16 )

2R 1CB

10° Semana de Pro toco lo

Ma

ss

as

Úm

ida

s C

ard

íac

as

(g

)

27

4.2 Desempenho em esteira

Os dados obtidos demonstram que, após 6 semanas de treinamento, os animais

pertencentes aos grupos treinados (TR e TE) apresentam um desempenho na corrida em

esteira significativamente maior em relação aos animais que nunca foram expostos a

treinamento (SR). Esta melhora no desempenho foi observada tanto nos animais SHAM

(Figura 4A) quanto nos animais 2R1C (Figura 4B).

Figura 4 – Desempenho em esteira dos animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e

treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE,

respectivamente), determinado antes de iniciar o protocolo (Inicial) e na 6ª semana de protocolo (Final). Valores

expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes

(n). *indica diferença significativa (p<0,001) em relação aos valores basais do mesmo grupo (ANOVA de

medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

4.3 Pressão arterial sistólica

Os resultados obtidos mostram que o procedimento cirúrgico para o acesso à artéria

renal esquerda, por si, não eleva significativamente a PAS em nenhum dos grupos estudados

(Figura 5A).

Figura 5 - Valores de pressão arterial sistólica obtidos em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos

grupos sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de

exercício (SE e TE, respectivamente), determinados na 5ª semana de protocolo de exercício (Basal - uma semana

antes da cirurgia) e na 10ª semana de protocolo de exercício (Final - quatro semanas após a cirurgia), Valores

expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes

(n). * indica diferença significativa (p<0,001) em relação aos valores basais do mesmo grupo (ANOVA de

medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

Inicial Final0

5

10

15

20

25SR (14)

SE (15)

T R (14)

T E (16)

* *

SHAMA

Te

ste

de

Es

forç

o (

min

uto

s)

Inicial Final

0

5

10

15

20

25SR (16)

SE (16)

T R (16)

T E (16 )

2R1C

* *

B

Te

ste

de

Es

forç

o (

min

uto

s)

Basal Final

50

100

150

200

250

SR (14 )

SE (15 )

T R (1 4 )

T E (1 6 )

SH AMA

Pre

ss

ão

Art

eri

al

Sis

tólic

a

(mm

Hg

)

Basal Final50

100

150

200

250

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SE (1 6 )

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T E (16 )

2R1CB

* * * *

Pre

ss

ão

Art

eri

al

Sis

tólic

a

(mm

Hg

)

28

Por outro lado, quatro semanas após a implantação do clip na artéria renal esquerda, houve

um significativo aumento da PAS nos animais pertencentes a todos os grupos experimentais

(Figura 5B).

4.4 Reatividade vascular à Angiotensina II

O treinamento, seguido ou não de exposição ao exercício agudo, atenuou as respostas

da aorta à Ang II em animais SHAM, levando a uma redução significativa dos valores de

Emax, sem contudo modificar significativamente os valores de pEC50. Observou-se também

que a exposição ao exercício agudo não modificou significativamente os perfis de resposta à

Ang II nas aortas dos animais sedentários (Figura 6A; Tabela 1). Esta redução significativa de

Emax para Ang II, que foi observada nas preparações obtidas de animais treinados, re-

expostos ou não ao exercício, deixou de existir após a remoção endotelial. Com efeito, os

valores de Emax para Ang II, assim como os valores de pEC50, obtidos nestas preparações,

não diferiram significativamente daqueles obtidos nas preparações de animais sedentários

(Figura 6B; Tabela 1). Reduções de Emax para Ang II, induzidas pelo treinamento, também

não foram observadas em preparações intactas na presença do PD123.319, tampouco foram

observadas alteração nos valores de pEC50 (Figura 6C; Tabela 1). Por conta disso, não mais se

constatou aquela atenuação de resposta induzida pelo treinamento que havia sido observada

em preparações não tratadas (Figura 6A). Fato semelhante foi observado quando as

preparações intactas foram estudadas na presença de L-NAME. Nestas condições,

preparações obtidas dos animais submetidos ao treinamento mostraram um padrão de resposta

à Ang II semelhante aos demais. Desta forma, não foram observadas diferenças significativas

de Emax ou pEC50 para Ang II entre os diferentes grupos de animais estudados (Figuras 6D;

Tabela 1). Por fim, na presença de indometacina, as respostas à Ang II foram reduzidas nos

animais sedentários. Com isso, não se observou redução de Emax para Ang II induzida pelo

treinamento, semelhante àquela que havia sido observada em preparações não tratadas (Figura

6E). Nesta condição também não foram observados valores diferentes de pEC50 para Ang II

entre os diferentes grupos de animais estudados (Tabela 1).

Quando animais 2R1C sedentários foram expostos ao exercício agudo, observou-se

um deslocamento da curva concentração-resposta à Ang II, com redução significativa do

pEC50. Estas preparações também mostraram redução de Emax, porém não estatisticamente

significativa.

29

Figura 6 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas (A) e

deendotelizadas (Endo -) na presença de salina (B), bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M (C), L-

NAME 10-4M (D) ou indometacina 10-5M, provenientes de animais SHAM sedentários e treinados estudados no

repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores

expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes

(n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários estudados no repouso (ANOVA

de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SR (09)

SE (09)

TR (07)

TE (06)

SHAM (SALINA)

*

A

*

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SR (09)

SE (10)

TR (10)

TE (09)

SHAM (SALINA Endo -)

B

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SR (08)

SE (07)

TR (09)

TE (05)

SHAM (PD 123.319)

C

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SR (07)

SE (08)

TR (10)

TE (07)

SHAM (L-NAME)

D

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SR (07)

SE (09)

TE (10)

TR (07)

SHAM (INDOMETACINA)E

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

30

Tabela 1 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas provenientes de

animais SHAM

pEC50

SR SE TR TE

Salina

Intactas

8,30 ± 0,05

(09)

8,09 ± 0,16

(08)

8,34 ± 0,09

(07)

8,39 ± 0,07

(07)

Deendotelizadas

7,81 ± 0,12

(08)

7,76 ± 0,15

(10)

8,13 ± 0,08

(08)

8,19 ± 0,12

(09)

PD 123.319 (10-6

M)

Intactas

8.96 ± 0,23

(07)

8,46 ± 0,12

(09)

8,33 ± 0,09

(09)

8,42 ± 0,21

(05)

L-NAME (10-4

M)

Intactas

7,95 ± 0,06

(07)

8,05 ± 0,12

(08)

8,00 ± 0,09

(10)

7,96 ± 0,18

(07)

Indometacina (10-5

M)

Intactas

7,92 ± 0,10 (07)

8,03 ± 0,06 (09)

8,04 ± 0,13 (10)

8,22 ± 0,07 (07)

Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de

exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre

parêntesis, número de determinações independentes (n).

Em contrapartida, o treinamento, seguido ou não de re-exposição ao exercício, não

promoveu modificações significativas no padrão de resposta à Ang II nestas preparações

obtidas de animais 2R1C (Figura 7A; Tabela 2).

Após a remoção endotelial, contudo, as respostas à Ang II não apresentaram

diferenças acentuadas entre grupos experimentais estudados. Com efeito, os valores de Emax

e pEC50 também não diferiram significativamente entre grupos (Figura 7B; Tabela 2). Na

presença PD123.319 também não foram observadas modificações no padrão de resposta das

preparações à Ang II, em consequência do exercício agudo e/ou do treinamento (Figura 7C;

Tabela 2). A presença do L-NAME elevou muito discretamente as respostas à Ang II em

preparações obtidas de animais 2R1C, pertencentes aos diferentes grupos experimentais

estudados (Figura 7D). Estas elevações de resposta à Ang II, embora discretas, resultaram na

supressão da redução do pEC50 que havia sido observada em preparações obtidas de animais

sedentário-exercício tratadas apenas com salina (Tabela 2). Por fim, a magnitude de resposta à

Ang II foi reduzida nas preparações provenientes de todos os grupos experimentais, quando

tratadas com indometacina (Figura 7E). Estas reduções, contudo, não evidenciaram qualquer

diferença significativa de Emax ou pEC50 entre os grupos experimentais (Tabela 2).

31

Figura 7 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas (A) e

deendotelizadas (Endo -) na presença de em salina (B), bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M

(C), L-NAME 10-4M (D) ou indometacina 10-5M, provenientes de animais 2R1C sedentários e treinados

estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente).

Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações

independentes (n).

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8SR (12)

SE (11)

TR (10)

TE (11)

2R1C (SALINA)

A

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8SR (13)

SE (09)

TR (09)

TE (12)

2R1C (SALINA Endo -)

B

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8SR (08)

SE (07)

TR (08)

TE (08)

2R1C (PD 123.319)

C

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

TR (07)

TE (10)

SR (09)

SE (09)

2R1C (L-NAME)

D

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8SR (10)

SE (07)

TR (09)

TE (08)

2R1C (NDOMETACINA)

E

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

32

Tabela 2 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas provenientes de

animais 2R1C

pEC50

SR SE TR TE

Salina

intactas

8,30 ± 0,08

(12)

7,87 ± 0,08*

(11)

8,37 ± 0,10

(10)

8,25 ± 0,07

(11)

deendotelizadas

8,00 ± 0,06

(13)

8,06 ± 0,08

(09)

7,96 ± 0,13

(09)

8,18 ± 0,18

(12)

PD 123.319 (10-6

M)

intactas

8.30 ± 0,19

(08)

8,43 ± 0,19

(07)

8,43 ± 0,13

(08)

8,17 ± 0,20

(08)

L-NAME (10-4

M)

intactas

8,12 ± 0,05

(10)

8,06 ± 0,05

(10)

8,18 ± 0,09

(07)

8,12 ± 0,04

(10)

Indometacina (10-5

M)

intactas

8,21 ± 0,07 (10)

7,90 ± 0,16 (08)

8,20 ± 0,03 (09)

8,24 ± 0,07 (08)

Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de

exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre

parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos

animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

Preparações obtidas de animais SHAM, quando estudadas na presença do tiron, não

mostraram diferenças evidentes no padrão de resposta à Ang II entre grupos. Com efeito, não

se observou diferenças significativas de Emax ou pEC50 entre os diferentes grupos estudados,

nestas condições (Figura 8A; Tabela 3). Quando foram estudadas preparações obtidas dos

animais 2R1C, na presença de tiron, observou-se que o treinamento físico, por si, atenuou as

respostas das aortas destes animais à Ang II. Por conta disso, observou-se uma redução

significativa nos valores de Emax para Ang II nas preparações destes animais treinados em

relação aos sedentários, ambos estudados no repouso. Adicionalmente, a exposição dos

animais 2R1C sedentários ao exercício agudo resultou em uma diminuição das respostas de

suas aortas à Ang II, em relação aos animais sedentários que permaneceram no repouso, e

observou-se um deslocamento da curva concentração-resposta à Ang II, com redução

significativa do pEC50. Curiosamente, o inverso ocorreu com os animais treinados que foram

re-expostos ao exercício (Figura 8B, Tabela 3).

33

Figura 8 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas tratadas

com tiron 10-4M, provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso

(SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica

diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas

vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

Tabela 3 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas

provenientes de animais SHAM e 2R1C

pEC50

SHAM SR SE TR TE

Tiron 10-4

M intactas

8,15 ± 0,09

(08)

8,27 ± 0,12

(07)

8,09 ± 0,08

(07)

8,51 ± 0,29

(08)

2R1C

Tiron 10-4

M

intactas

8,98 ± 0,27 (07)

7,78 ± 0,08* (07)

8,49 ± 0,02 (09)

8,55 ± 0,04 (08)

Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão

de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre

parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,05) em relação aos

animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

4.5 Análises bioquímicas

O treinamento e/ou o exercício agudo não alteraram as concentrações plasmáticas de

FOX e FRAP nos animais SHAM e 2R1C (Tabela 4).

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SR (08)

SE (07)

TR (07)

TE (08)

SHAM (TIRON)A

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0

0.2

0.4

0.6

0.8

SE (07)

TR (09)

TE (08)

SR (07)

2R1C (TIRON)B

**

Angiotensina II Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

34

Tabela 4 – Valores plasmáticos (µM/L) das análises bioquímicas do balanço redox (FOX e

FRAP) em animais SHAM e 2R1C

SR SE TR TE

SHAM

FOX

569,17 ± 72,75 (14)

629,19 ± 92,90 (15)

538,86 ± 68,45 (14)

573,58 ± 67,18 (16)

FRAP

1,20 ± 0,07 (16)

1,25 ± 0,09 (16)

1,30 ± 0,09 (16)

1,43 ± 0,08 (16)

2R1C

FOX

440,78 ± 52,93 (14)

430,34 ± 50,46 (15)

399,88 ± 33,06 (14)

351,69 ± 25,49 (16)

FRAP

1,07 ± 0,06 (16)

1,23 ± 0,13 (16)

1,08 ± 0,08 (16)

1,08 ± 0,08 (16)

Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de

exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre

parêntesis, número de determinações independentes (n).

4.6 Reatividade vascular ao nitroprussiato de sódio e à solução despolarizante de cloreto

de potássio

Nos animais SHAM e 2R1C, o treinamento e a exposição ao exercício agudo não

alteraram os valores de Emax e pD2 das curvas concentração-resposta para nitroprussiato de

sódio, em anéis de aorta pré-contraídos com NOR 10-4

M (Figuras 9A e 9B; Tabela 5).

Figura 9 – Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio obtidas em preparações de aortas intactas provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR,

respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em

média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -30.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

SR (08)

SE (08)

TR (07)

TE (07)

SHAM (SALINA)A

Nitroprussiato de sódio Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -30.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

SR (08)

SE (09)

TR (06)

TE (06)

2R1C (SALINA)B

Nitroprussiato de sódio Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

35

Da mesma forma, não houve diferença no padrão de resposta da aorta à solução

despolarizante de cloreto de potássio em animais SHAM e 2R1C, sedentários e treinados,

expostos ou não ao exercício agudo (Figura 10A e 10B; Tabela 5).

Figura 10 - Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio obtidas em preparações de aortas

deendotelizadas (Endo -) provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente).

Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações

independentes (n).

Tabela 5 - Valores de pEC50 para nitroprussiato de sódio e cloreto de potássio, determinados

em aortas provenientes de animais SHAM e 2R1C

pEC50

SR SE TR TE

SHAM

Nitroprussiato de

sódio

6,93 ± 0,38

(08)

7,09 ± 0,16

(08)

7,08 ± 0,12

(07)

7,26 ± 0,27

(07)

Cloreto de potássio

1,85 ± 0,02

(08)

1,94 ± 0,01

(09)

1,93 ± 0,03

(06)

1,92 ± 0,03

(06)

2R1C

Nitroprussiato de

sódio

7,03 ± 0,15

(07)

7,54 ± 0,66

(07)

6,89 ± 0,27

(08)

6,87 ± 0,24

(08)

Cloreto de potássio

1,85 ± 0,08

(06)

2,12 ± 0,32

(05)

2,13 ± 0,13

(08)

2,03 ± 0,10

(05)

Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão

de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). Os valores de pD2 para nitroprussiato de sódio e cloreto

de potássio foram obtidos em preparações intactas e deendotelizadas, respectivamente.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

SR (07)

SE (07)

TR (08)

TE (08)

SHAM (SALINA Endo -)A

Cloreto de Potássio Log [mol/L]

Te

nsã

o (

g)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

SR (06)

SE (05)

TR (08)

TE (05)

2R1C (SALINA Endo -)B

Cloreto de Potássio Log [mol/L]T

en

sã

o (

g)

36

5 DISCUSSÃO

A proposta central do presente estudo foi investigar os efeitos do exercício sobre os

mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C. Vale

ressaltar que os efeitos do exercício sobre as respostas de aortas a diversos agentes

vasoconstritores, inclusive Ang II, já foram descritos em animais normotensos.58,61,62

Paralelamente, Kumral e Cols.70

mostraram as ações do exercício sobre as respostas de aorta a

diferentes agentes vasomotores em animais 2R1C, porém nunca se estudou as respostas à Ang

II. Todavia, o fato deste estudo focar as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C o torna

inédito. Neste sentido, entendemos que o presente estudo permite uma melhor compreensão

dos mecanismos mobilizados pelo exercício, que podem ser úteis na profilaxia e/ou

tratamento da HAS.

Optou-se, no presente estudo, por estudar os animais 2R1C na fase aguda do modelo.

Na verdade, esta opção deveu-se ao fato de estudos anteriores relatarem aumentos nas

concentrações plasmáticas de Ang II nesta fase do modelo 2R1C.67,68

Assim, eventuais

modificações de respostas das aortas destes animais à Ang II teriam um significado biológico

mais claro. Contudo, a dosagem de Ang II no plasma destes animais não mostrou níveis

circulantes aumentados deste peptídeo em comparação aos animais normotensos (dados não

apresentados). Concentrações plasmáticas de Ang II semelhantes entre animais SHAM e

2R1C, como as observadas no presente estudo, já foram relatadas por outros autores.22,84

Segundo estes autores, não se pode dizer que a Ang II deixa de ser importante já na quarta

semana do modelo 2R1C, mas pode-se dizer sim que, nesta fase, o SRAA tecidual já

prepondera em relação ao circulante.

Para que fosse possível estudar os efeitos do treinamento sobre aortas de animais

2R1C foi necessário verificar a eficácia do protocolo de treinamento e do modelo de

hipertensão. Neste sentido, analisou-se primeiramente o ganho de peso de todos os animais

incluídos no estudo. Estes dados mostram que os protocolos de exercício aos quais os animais

foram expostos não promoveram modificações significativas no ganho de peso corporal, tanto

nos animais SHAM quanto nos animais 2R1C. O treinamento também não promoveu

aumento da massa úmida cardíaca, tanto nos animais SHAM quanto 2R1C. Com efeito, estes

dados sugerem que o exercício praticado durante o treinamento foi de intensidade leve a

moderada.78

Também não foram observadas modificações significativas da massa corporal em

conseqüência do treinamento. A efetividade do treinamento, contudo, foi comprovada pelo

aumento do desempenho em esteira, que foi observado na sexta semana de protocolo de

treinamento. Os dados obtidos também mostram que o modelo de hipertensão empregado no

37

presente estudo foi bem sucedido. Isto porque houve um aumento significativo na PAS dos

animais considerados 2R1C, quatro semanas após a cirurgia para a promoção da estenose

renal.

Uma vez que a hipertensão 2R1C é uma variável central do presente estudo, no seu

delineamento experimental, optou-se por investigar as respostas à Ang II tanto em animais

SHAM quanto naqueles 2R1C, simultaneamente. Com isso, pode-se dizer que as alterações

observadas são realmente decorrentes da implantação bem sucedida do modelo de hipertensão

renovascular 2R1C, quando comparadas às respostas provenientes dos animais SHAM.

Nos experimentos de reatividade vascular observou-se que, em animais SHAM, o

treinamento promoveu uma redução da magnitude das respostas das aortas à Ang II. Esta

redução de resposta, contudo, não foi observada frente ao exercício agudo. Possivelmente, as

adaptações promovidas pelo exercício sobre os mecanismos que regulam o tônus vascular

instalam-se permanentemente à medida que o animal é exposto continuamente às sessões de

exercício durante o treinamento.54-56

Em preparações sem endotélio esta redução de resposta

induzida pelo treinamento não foi observada. Isto sugere que o treinamento mobiliza

substâncias vasodilatadoras provenientes do endotélio para atenuar as respostas contráteis à

Ang II. A atenuação das respostas à Ang II, observada em animais treinados, também deixou

de existir na presença do PD123.319, um bloqueador de receptor AT2. Isto sugere que a

mobilização de substâncias vasodilatadoras endoteliais, responsáveis pela atenuação das

respostas à Ang II em animais treinados, se dá através da estimulação de receptores AT2.

Além disso, os resultados obtidos também sugerem que esta substância vasodilatadora,

liberada pela estimulação de AT2, pode ser o NO. Isto porque a inibição da NOS pelo L-

NAME suprimiu a redução de resposta que havia sido observada nas preparações dos animais

treinados. Estes dados são corroborados por estudos anteriores nos quais observou-se que o

treinamento promove redução das respostas vasculares à Ang II por meio de mecanismos

vasodilatadores endoteliais relacionados ao NO.40-44

A participação dos receptores AT2 na

mobilização do NO, antagonizando assim os efeitos vasoconstritores provenientes mediados

por AT1, também tem sido proposta.8,22-27

Paralelamente, foi observado que os prostanóides também são importantes na

modulação do tônus vascular das preparações estudadas. Contudo, estes mediadores locais

aparentemente são essenciais na manutenção do tônus destas preparações. De fato, a inibição

da COX pela indometacina atenua as respostas destas preparações à Ang II, marcadamente

nos animais sedentários. Nos animais treinados, provavelmente pelo fato destas respostas já

estarem minimizadas pela ação do NO, não se observou efeitos importantes da indometacina.

38

Coincidentemente, estudos anteriores já demonstraram a participação dos prostanóides

vasoconstritores na manutenção do tônus vascular, e que seus efeitos vasoconstritores podem

ser suplantados pelas ações vasodilatadoras do NO.45,73

Como vimos, os resultados obtidos em animais SHAM mostram modificações

induzidas por repetidas exposições ao exercício compatíveis com as descritas na literatura.

Por outro lado, adaptações semelhantes parecem não ocorrer nos animais 2R1C. Nestes

animais, não se observou a redução da magnitude das respostas da aorta à Ang II, que ocorre

nos animais SHAM mediante o treinamento. Ao invés disso, observamos apenas uma redução

na sensibilidade da aorta à Ang II, que ocorre após exposição aguda ao exercício. Vale

destacar que esta redução de sensibilidade à Ang II não foi observada em preparações

deendotelizadas, nem tampouco em preparações intactas, estudadas na presença de

PD123.319 ou L-NAME. Estes dados sugerem que, nestas preparações, o exercício agudo

promove um aumento da liberação endotelial de NO mediada por AT2. Por ser um fenômeno

agudo, supomos que esta maior liberação de NO seja decorrente de um aumento na atividade

da NOS, ao invés de um aumento na sua expressão, pois isto ocorreria mais tardiamente.

Neste sentido, estudos prévios demonstram que o exercício agudo pode aumentar a liberação

endotelial de NO em artérias, antagonizando assim as ações vasoconstritoras dos agonistas

simpatomiméticos.47,53

É curioso notar que esta redução de sensibilidade à Ang II foi

observada apenas em aortas de animais 2R1C, e não naquelas obtidas de animais SHAM.

Talvez este seja um mecanismo protetor desenvolvido em paralelo à hipertensão 2R1C,

visando garantir a homeostasia, sempre que estes animais são submetidos agudamente a um

esforço físico.

O dado mais relevante do presente estudo talvez seja a não observação de redução de

resposta à Ang II induzida pelo treinamento em preparações provenientes de animais 2R1C.

Esperava-se que também nestas preparações, a liberação de NO mediada por AT2 estivesse

aumentada. Possivelmente, como neste modelo de hipertensão pode haver uma exacerbação

da ativação do receptor AT1, isso levaria a uma maior ativação de enzimas NADPH oxidases,

culminando em um aumento na geração de O2-.68,70

Além disso, existem evidências que o

acúmulo de O2- no endotélio vascular ou em tecidos adjacentes pode reduzir a

biodisponibilidade do NO.29,71,72

Desta forma, é cabível supor que o acúmulo de O2- nestas

preparações de animais 2R1C, sobretudo naqueles treinados, possa ter comprometido a

vasodilatação NO dependente desencadeada pela ativação de AT2.

Supondo que uma concentração de O2- nos tecidos das aortas dos animais 2R1C tenha

suprimido a redução de resposta à Ang II nos animais treinados, estas preparações foram

39

estudadas também na presença do tiron, um análogo da superóxido dismutase (SOD) capaz de

eliminar O2-.85-87

. Nestas condições, preparações obtidas de animais 2R1C expostos ao

exercício agudo, bem como ao treinamento, tiveram suas respostas à Ang II reduzidas em

relação àquelas obtidas dos animais nunca expostos a qualquer tipo de exercício. Isto

corrobora a hipótese de que a modulação exercida pelo NO sobre as respostas da aorta à Ang

II não ocorre nos animais 2R1C treinados devido a uma elevada concentração tecidual de O2-.

O aumento do estresse oxidativo, contudo, não foi acompanhado por um aumento na

peroxidação lipídica no plasma colhido dos animais 2R1C. Possivelmente, os mecanismos

antioxidantes presentes no plasma tenham evitado modificações significativas no grau de

peroxidação lipídica nestes animais. Estas defesas antioxidantes, no entanto, não são aquelas

avaliadas pelo FRAP uma vez que também não se verificou qualquer modificação

significativa nos valores de FRAP determinados no plasma destes animais.

Esta redução de resposta à Ang II, no entanto, parece ser suprimida quando estes

animais 2R1C treinados são re-expostos ao exercício. Mecanismos vasoconstritores locais

devem ser melhor investigados na busca por compreender estas respostas apresentadas pelas

preparações obtidas de animais treinado-exercício.

A influência do O2- sobre as respostas da aorta à Ang II, contudo, não é um fenômeno

simples. Contrariando nossas expectativas, a presença do tiron elevou as respostas à Ang II

em aortas de animais SHAM submetidos ao treinamento. Com isso, a atenuação de resposta

da aorta à Ang II, que havia sido observada em animais treinados, deixou de existir na

presença do tiron. Com base nestes dados inferimos que, enquanto o excesso de O2- pode

comprometer a atenuação exercida pelos mecanismos endoteliais relacionados ao NO sobre as

respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C treinados, a presença de O2- é necessária para

que esta modulação ocorra nos animais SHAM. De fato, já foi sugerida a participação do O2-

na vasodilatação dependente do endotélio em arteríolas do músculo esquelético de ratos.88

A

forma como se dá esta participação do O2-, contudo, precisa ser melhor investigada.

Os dados obtidos sugerem uma maior participação do NO na modulação das respostas

da aorta à Ang II tanto em animais SHAM treinados quanto em animais 2R1C submetidos ao

exercício agudo ou ao treinamento. Esta maior participação do NO provavelmente envolva

um aumento de sua biossíntese. Contudo, para que esta inferência possa ser feita, devemos

descartar um aumento da sensibilidade destas preparações de aorta ao NO. Neste sentido,

preparações foram desafiadas também com o nitroprussiato de sódio, uma molécula doadora

direta de NO. Como não foi observada qualquer modificação de resposta ao nitroprussiato de

sódio entre os grupos estudados, fica corroborada a hipótese de que a maior atividade dos

40

mecanismos moduladores relacionados ao NO deve-se fundamentalmente ao aumento da

biodisponibilidade desta substância. A menor resposta à Ang II nas preparações provenientes

de animais treinados também não deveu-se à uma redução da capacidade contrátil da

musculatura lisa vascular nestas preparações. Isto porque as respostas à solução

despolarizante de cloreto de potássio também não foram modificadas pelo treinamento.

41

6 CONCLUSÃO

O presente estudo demonstra que, em animais SHAM expostos ao treinamento, as

respostas da aorta à Ang II são moduladas por NO de origem endotelial liberado em

consequência da ativação de receptores AT2. Já nos animais 2R1C, este mecanismo

modulador endotelial é suprimido, possivelmente pelo elevado estresse oxidativo que é

característico deste modelo experimental.

42

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49

APÊNDICES

APÊNDICE A – Composição nutricional da ração consumida "ad libitum" pelos

animais estudados

NUVILAB CR-1: Ração para animais de laboratório

Composição básica do produto:

Milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato bicálcico,

cloreto de sódio, premix vitamínico mineral e aminoácidos.

Níveis de Garantia por Quilograma do Produto:

Umidade 12,5%, proteína bruta 22,0%, extrato etéreo 4,5%, matéria mineral 10,0%, matéria

fibrosa 8,0%, cálcio 1,4% e fósforo 0,8%.

Enriquecimento por Quilograma do Produto:

Vitaminas - vitamina A 25.200,00 UI, vitamina D3 2.100,00 UI, vitamina E 60,00 mg,

vitamina K3 12,50 mg, vitamina B1 14,40 mg, vitamina B2 11,00 mg, vitamina B6 12,00 mg,

vitamina B12 60,00 mcg, niacina 60,00 mg, ácido pantotênico 112,00 mg, ácido fólico 6,00

mg, biotina 0,26 mg e colina 1.100,00 mg.

Microelementos Minerais - Ferro 50,00 mg; zinco 60,00 mg; cobre 10,00 mg; iodo 2,00 mg;

manganês 60,00 mg; selênio 0,05 mg; cobalto 1,50 mg.

Aminoácidos - lisina 100,00 mg; metionina 300,00 mg.

Aditivos:

Antioxidante 100,00 mg.

Fonte: Nuvital Nutrientes S/A

50

APÊNDICE B – Protocolo de treinamento (10 semanas)

Dias Duração

(min) Aquecimento Endurance Endurance Recuperação

minutos Veloc. Km/h 50% Veloc.

máx

60% Veloc.

máx minutos

Veloc.

Km/h

1 15 5 0,3 5 - 5 0,3

2 17 5 0,3 7 - 5 0,3

3 20 5 0,3 10 - 5 0,3

4 25 5 0,3 15 - 5 0,3

5 30 5 0,3 20 - 5 0,3

6 30 5 0,3 20 - 5 0,3

7 30 5 0,3 15 5 5 0,3

8 30 5 0,3 15 5 5 0,3

9 35 5 0,3 15 10 5 0,3

10 40 5 0,3 20 10 5 0,3

11 40 5 0,3 20 10 5 0,3

12 45 5 0,3 25 10 5 0,3

13 45 5 0,3 25 10 5 0,3

14 50 5 0,3 25 15 5 0,3

15 60 5 0,3 30 20 5 0,3

16 45 5 0,3 20 15 5 0,3

17 60 5 0,3 30 20 5 0,3

18 60 5 0,3 30 20 5 0,3

19 60 5 0,3 25 25 5 0,3

20 60 5 0,3 20 30 5 0,3

21 45 5 0,3 15 20 5 0,3

22 60 5 0,3 25 25 5 0,3

23 60 5 0,3 20 30 5 0,3

24 60 5 0,3 15 35 5 0,3

25 60 5 0,3 10 40 5 0,3

26 45 5 0,3 - 35 5 0,3

27 60 5 0,3 - 50 5 0,3

28 60 5 0,3 - 50 5 0,3

29 60 5 0,3 - 50 5 0,3

30 60 5 0,3 - 50 5 0,3

31 30 5 0,5 20 - 5 0,5

32 45 5 0,5 35 - 5 0,5

33 50 5 0,5 40 - 5 0,5

34 55 5 0,5 45 - 5 0,5

35 60 5 0,5 50 - 5 0,5

36 45 5 0,5 35 - 5 0,5

37 60 5 0,5 45 5 5 0,5

38 60 5 0,5 45 5 5 0,5

39 60 5 0,5 40 10 5 0,5

40 60 5 0,5 40 10 5 0,5

41 45 5 0,5 25 10 5 0,5

42 60 5 0,5 40 10 5 0,5

43 60 5 0,5 40 10 5 0,5

44 60 5 0,5 35 15 5 0,5

45 60 5 0,5 30 20 5 0,5

46 45 5 0,5 20 15 5 0,5

47 60 5 0,5 30 20 5 0,5

48 60 5 0,5 30 20 5 0,5

49 60 5 0,5 25 25 5 0,5

50 60 5 0,5 20 30 5 0,5

51

APÊNDICE C - Cirurgia de indução da hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip

52

APÊNDICE D – Solução nutritiva de Krebs-Henseleit (modificado)

Para preparo de 1000 mL de solução nutritiva de Krebs-Henseleit (modificado):

Sais [mM] Peso (g)

NaCl 130 7,61

KCl 4,70 0,35

KH2PO4 1,18 0,16

MgSO4. 7H2O 1,17 0,25

NaHCO3 14,9 1,25

Glicose 11,1 2,00

CaCl2

1,60 0,18

a) Pesar todos os sais, exceto o CaCl2;

b) Em seguida, colocar todos os sais (previamente pesados) em um balão volumétrico de

1000 mL;

c) Completar o volume com água deionizada;

d) Posteriormente, homogeneizar a solução em agitador magnético;

e) Adicionar o CaCl2 e homogeneizar novamente;

f) Finalizar com a verificação de pH, visto que o pH ideal é 7,4.

53

APÊNDICE E - Reatividade Vascular

a) Anel de aorta torácica (2mm)

b) Transdutor isométrico

c) Registro de movimentação do vaso na presença do agonista (Ang II)

a b

c