Estrazione ed analisi dei lipidi

Lezione del 17- 5- 07

centrifuga

H2O/CH3OH/CHCl3 0,8 2 1

+

CELLULE o MEMBRANEin soluzione fisiologica

Estrazione dei lipidi

CH3OH

(Bligh & Dyer)

Agitazione per 15’

+ CHCl3

Agitazione per 15’

SISTEMA MONOFASICO

SN1

CHCl3 + H2O +

ESTRATTOLIPIDICO

pellet

CH3OH / CHCl3 / H2O 1 1 0,9

SISTEMA BIFASICO

+ H2O /CH3OH/ CHCl3

0,8 2 1

centrifuga

SN2

SN1+SN2

CH3OH+H2O

CHCl3

Cos’e’ la Cromatografia ?

La cromatografia e’ una tecnica che serve a separare i singoli componenti di una miscela omogenea.

E’ basato sulla diversa ripartizione di molecole tra una fase mobile (liquida o gassosa) ed una fase stazionaria (solida o liquida)

• Analisi qualitativa

• Analisi quantitativa

• PurificazioneComponentiMiscela

Differenti tipi di cromatografia

• Cromatografia liquida ( cromatografia su colonna, su strato sottile o TLC, e HPLC)– Fase stazionaria: gel di silice, allumina, etc.

– Fase mobile: solventi organici

– importanti proprieta’: polarita’

• Gas cromatografia– Fase stazionaria: un polimero impaccato o capillare.

– Fase mobile: gas inerte (Elio)

– importanti proprieta’: punto di ebollizione (evaporazione soluti)

Cromatografia su strato sottile (TLC)

Il gel di silice o di allumina (fase stazionaria) e’ deposto in strato sottile su una lastra di vetro. La silice e’ molto polare. La superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (Si-OH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si). Sui primi ha luogo l’interazione tra fase fissa e soluto

SiO

OH

O

O

SiO

SiO

OHO

OHO

Si Si Si

La silice è resa attiva dai gruppi silanolici ≡Si-OH. Questi, però, sono bloccati da molecole di acqua legate mediante legami idrogeno

SiOHO

H

H

SiOH

SiOH

+ SiSiO

+ H2O

Quindi, è necessario essiccare in stufa ( 180 °C) per eliminare le molecole di acqua, senza però superare i 300 °C, perché si avrebbe la condensazione interna con formazione nuovamente di gruppi silossanici

La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere, con il soluto, per l’adsorbimento sulla fase stazionaria. L’effetto della fase mobile è quello di differenziare la capacità dei vari soluti di essere adsorbiti. Un soluto molto polare interagisce fortemente con la fase fissa e, per far si che la fase mobile competa con il soluto, dovra’ anch’essa essere abbastanza polare.

Affinità di classi di composticon fasi stazionarie polari

  

Composto 

Gruppo funzionale

 

           

forza di assorbimento crescente

Acidi

Alcoli

Ammine

Mercaptani

Aldeidi

Chetoni

Esteri

Eteri

Alcheni

Alcani

C

OH

O

OH

NH2

SH

C

O

H

C O

C

O

O R

O

RH

C C

H

R

fosfolipidi

R1, R2= catene acidi grassi non polari

Glicerolo, gruppi fosfato e X = parte polare

R O CH2C

O

CHOCR'

O H2C O P

O

O-

O CH2 C NH3+

H

COO-

FosfatidilserinaFosfatidiletanolammina

NH3+O

O-

O

POH2CO

R C O CH'

O

C CH2OR

CH2 CH2

Fosfatidilcolina

CH2O

O-

O

POH2CO

R C O CH

O

C CH2OR

'

CH2 N+(CH3)3

H

Fosfatidilinositolo

CH2O

O-

O

PO

OHOH

OH

OH

O

H

H

H

HH

H

CH

CH2

O

O

O

O

C

C R

R'

Cromatografia su strato sottile (TLC)

• Applicazione del campione

• Corsa cromatografica

• Visualizzazione

• Interpretazione dei risultati

“fronte del solvente” 1 cm.

A. Disegnare la linea di deposizione e il fronte del solvente con una matita

“linea di deposizione” 1 cm.

B. Risospendere i campioni in cloroformio

C. Depositare il campione mediante capillari o siringhe tipo Hamilton

1. Applicazione del campione

2. Corsa cromatografica

Lastra cromatografica

Camera di slivuppo

A. La lastra viene posta in una vaschetta chiusa saturata dai vapori del solvente di sviluppo

B. Il campione viene trasportato attraverso la fase stazionaria

C. Rimuovere la lastra dalla cameretta quando il solvente ha raggiunto la linea superiore

Solvente disviluppo

(fase mobile)

}

3. Visualizzazione dei risultati

A. Attendere l’evaporazione del solvente dalla superficie della lastra

C. Un metodo fisico si basa sull’osservazione della lastra alla luce ultravioletta (254 nm 365 nm). I metodi chimici consistono nello spruzzare sulla lastra reagenti cromogeni come soluzioni di H2SO4, di iodio, blu di molibdeno ecc..

B. Per rilevare la posizione dei componenti esistono metodi chimici e metodi fisici

4. Interpretazione dei risultati

A. Determinare il fattore di ritenzione (Rf) per ciascuna macchia.

B. I componenti incogniti vengono identificati per confronto con gli Rf degli standard .

miscela std std std incognita

distanza tra macchia e linea di deposizione

distanza tra il fronte del solvente e linea di deposizione Rf =

1

3

2

?

?

?

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

dS

dB

dA

dc

Rf componente A =

Rf componente B =

dA

dS

dB

dS

+ polare!

- polare!

componente B

componente A

component B

component A

Corsa cromatografica

Fronte del solvente

Linea di deposizioneMiscela incognita

Fronte del solvente

Linea di deposizione

I componenti meno polari presentano una minore interazione con la silice e migrano piu’ velocemente

I componenti piu’ polari stabiliscono maggiori interazioni con la silice e migrano piu’ lentamente

I componenti neutri migrano con il fronte del solvente

TLC preparativa (purificazione dei singoli componenti)

Estrazione dei lipidi(Bligh & Dyer)

Scraping della silice

Retta di calibrazione

microgrammi

0 2 4 6 8 10

area

mac

chia

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Analisi quantitativa