Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman TESI
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UNIVERSIT À DEGLI S TUDI DI PAVIA FACOL T À DI SCIENZE MM. FF. NN. Isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari della pianta ecuadoriana Brunfelsia Chirikaspi Plowman (Chiriguayusa) e saggi di Bioattività RELA TORE: Pr of . Giovanni Vidari TESI DI LA UREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE DI Jorge EDUARDO PONCE ZEA ANNO ACCADEMICO 2009/2010
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UNIVERSITAgrave DEGLI STUDI DI PAVIA FACOLTAgrave DI SCIENZE MM FF NN
Isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari dellapianta ecuadoriana Brunfelsia Chirikaspi Plowman
(Chiriguayusa) e saggi di Bioattivitagrave
RELATORE Prof Giovanni Vidari
TESI DI LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE DI Jorge EDUARDO
PONCE ZEA
ANNO ACCADEMICO 20092010
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Isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari dellapianta ecuadoriana Brunfelsia Chirikaspi Plowman
(Chiriguayusa) e saggi di Bioattivitagrave
1 INTRODUZIONE
Lo studio effettuato per la realizzazione di questa tesi siinserisce nellrsquoambito delle ricerche condotte nel Dipartimento di
Chimica Organica dellrsquoUniversitagrave degli Studi di Pavia sui
metaboliti secondari presenti nelle piante e nei funghi Questa
ricerca egrave giustificata nellrsquoambito della Chimica Organica
giaccheacute lrsquoisolamento e lrsquoidentificazione strutturale di nuove
sostanze naturali rappresenta un importante contributo perlrsquoincremento delle conoscenze nel contesto chimico e biologico
Si puograve dire che la ricerca in questo campo egrave ancora lontana
dallrsquoessere terminata nonostante gli isolamenti di centinaia di
migliaia di composti in passato e gli eccezionali risultati ottenuti
in quanto la scoperta di nuove specie e le continue innovazioni
dei metodi di analisi hanno ampliato il numero di composti chepossono essere oggetto della ricerca
Lrsquoisolamento di nuovi composti naturali egrave di fondamentale
importanza per lrsquoindividuazione di molecole con attivitagrave
farmacologica che possono servire come base strutturale per la
progettazione di nuovi farmaci in alternativa ai farmaci di
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sintesi inoltre lrsquoidentificazione di particolari scheletri molecolari
puograve essere utile per studi di tipo chemotassonomico
I metaboliti secondari appartengono alla gran varietagrave di
molecole (senza eterogenee) prodotte dalle piante superiori
che possono trovare importanti applicazioni commerciali in
campo farmaceutico cosmetico e alimentare Questo tipo di
composti sono prodotti dal metabolismo ma non sono ritenuti
essenziali per la crescita sviluppo o riproduzionedellorganismo in questo senso sono detti secondari La
funzione o limportanza di queste sostanze egrave normalmente di
natura ecologica in quanto esse possono essere utilizzate come
meccanismi di difesa contro predatori per la competizione
interspecifica o per facilitare i processi riproduttivi Alla
categoria dei metaboliti secondari vegetali appartengono granparte dei composti utilizzati dalluomo come stupefacenti
(morfina cocaina tetraidrocannabinolo ecc) Le classi
principali di metaboliti secondari
sono Alcaloidi Terpenoidi Acidi organoalifatici aromatici o
eteroaromatici Fenoli Iridoidi Steroidi Olii volatili Resine e
balsami Saponine
In questo scenario di ricerca fitochimica egrave stato
fondamentale il contributo delle conoscenze tradizionali
riguardo allrsquouso delle risorse vegetali conoscenze che hanno un
uso ampio e diverso dal ritualisticoa quello medicinale e
cosmetico In paesi in via di sviluppo come lrsquoEcuador queste
nozioni etnobotaniche sono parte della cultura tradizionale e
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riguardano in molti casi piante endemiche sulle quali
lrsquoinformazione scientifica relativa ai composti e ai meccanismi
drsquoazione egrave scarsa Sullrsquoampia varietagrave di piante che sono parte
integrante della tradizione indigena rimane ancora tanto da
studiare e le informazioni sui componenti chimici e biologici
sono ancora incomplete
Il presente lavoro egrave una descrizione dei processi di estrazionedi isolamento e drsquoidentificazione di metaboliti secondari
compiuti sulla pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman e di saggi di
attivitagrave antimicrobica
2 METABOLITI SECONDARI
Nelle piante la produzione di metaboliti secondari puograve
essere indotta da stress come ad esempio le radiazioni UV o
come meccanismo di difesa verso i nemici naturali Esistono tregrandi classi di MS
-Terpeni (29000) che derivano del lrsquoisopentenil pirofosfato
-Alacaloidi (12000) che provengono dagli aminoacidi
-Fenoli (8000) che derivano dalla via metabolica dellrsquoacido
Shkiminico o dalla via del malonato-acetato
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Una classificazione piugrave ampia divide i metaboliti secondari tra
- quelli contenenti Azoto (N) Alcaloidi glicosilati aminoacidinon proteici glicosidi cianogeni
-quelli non contenenti Azoto terpenoidi e fenolici
I metaboliti secondari sono coinvolti nella pigmentazione
cellulare di fiori e semi attraggono insetti impollinatori co
involgendosi indirettamente nel processo di riproduzione dellapianta La maggior parte di metaboliti secondari che vengono
usati come farmaci o come composti guida per la loro
produzione appartengono alle famiglie di terpenoidi alcaloidi e
flavonoidi In particolare alcuni composti di queste famiglie
sembrano avere unrsquoattivitagrave anti-cancerogena
La sintesi dei metaboliti secondari avviene in diversicompartimenti cellulari I composti idrofili vengono prodotti
principalmente nel citosol I terpenoidi e alcuni alcaloidi
vengono sintetizzati nel cloroplasto Altri alcaloidi sono
sintetizzati nei mitocondri insieme a certe amine Infine i
metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico (liscio)
La funzione dei metaboliti secondari egrave ancora motivo di
discussione Sono stati considerati come prodotti di scarto ma
questo non spiegava i fatti inseguito elencati
- I prodotti di scarto sono propri degli organismi eterotrofi
e non delle piante che sono esseri autotrofi
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-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto non si
potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani
- La produzione dei metaboliti secondari egrave strettamente
regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivitagrave
regolatorie non potendo essere cosigrave considerati delle scorie
Si puograve ritenere che le funzioni principali dei metaboliti
secondari siano
-Difesa contro gli organismi erbivori microbi o altre piante con
cui competono nel loro ambiente
-Protezione contro le radiazione UV
-Riproduzione
La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali neidiversi ecosistemi si crede abbia generato lrsquoimmensa varietagrave
biologica attuale che implica anche una diversitagrave chimica a
livello dei composti prodotti dai diversi organismi
La produzione di metaboliti secondari nella pianta non egrave
neccesariamente costitutiva generalmente viene indotta dalle
infezioni provocate dalle ferite rotture o attacco dei
microrganismi In alcuni casi nella zona attorno al danno i
compartimenti cellulari dove si trovano i precursori dei
metaboliti secondari si possono rompere rilasciandoli nel
citosol dove possono subire modificazioni chimiche operate da
enzimi Questo egrave il caso delle mirosinasi e i glucosinolati che
quando la cellula egrave intatta si trovano in compartimenti separati
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Isolamento e caratterizzazione di metaboliti secondari dellapianta ecuadoriana Brunfelsia Chirikaspi Plowman
(Chiriguayusa) e saggi di Bioattivitagrave
1 INTRODUZIONE
Lo studio effettuato per la realizzazione di questa tesi siinserisce nellrsquoambito delle ricerche condotte nel Dipartimento di
Chimica Organica dellrsquoUniversitagrave degli Studi di Pavia sui
metaboliti secondari presenti nelle piante e nei funghi Questa
ricerca egrave giustificata nellrsquoambito della Chimica Organica
giaccheacute lrsquoisolamento e lrsquoidentificazione strutturale di nuove
sostanze naturali rappresenta un importante contributo perlrsquoincremento delle conoscenze nel contesto chimico e biologico
Si puograve dire che la ricerca in questo campo egrave ancora lontana
dallrsquoessere terminata nonostante gli isolamenti di centinaia di
migliaia di composti in passato e gli eccezionali risultati ottenuti
in quanto la scoperta di nuove specie e le continue innovazioni
dei metodi di analisi hanno ampliato il numero di composti chepossono essere oggetto della ricerca
Lrsquoisolamento di nuovi composti naturali egrave di fondamentale
importanza per lrsquoindividuazione di molecole con attivitagrave
farmacologica che possono servire come base strutturale per la
progettazione di nuovi farmaci in alternativa ai farmaci di
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sintesi inoltre lrsquoidentificazione di particolari scheletri molecolari
puograve essere utile per studi di tipo chemotassonomico
I metaboliti secondari appartengono alla gran varietagrave di
molecole (senza eterogenee) prodotte dalle piante superiori
che possono trovare importanti applicazioni commerciali in
campo farmaceutico cosmetico e alimentare Questo tipo di
composti sono prodotti dal metabolismo ma non sono ritenuti
essenziali per la crescita sviluppo o riproduzionedellorganismo in questo senso sono detti secondari La
funzione o limportanza di queste sostanze egrave normalmente di
natura ecologica in quanto esse possono essere utilizzate come
meccanismi di difesa contro predatori per la competizione
interspecifica o per facilitare i processi riproduttivi Alla
categoria dei metaboliti secondari vegetali appartengono granparte dei composti utilizzati dalluomo come stupefacenti
(morfina cocaina tetraidrocannabinolo ecc) Le classi
principali di metaboliti secondari
sono Alcaloidi Terpenoidi Acidi organoalifatici aromatici o
eteroaromatici Fenoli Iridoidi Steroidi Olii volatili Resine e
balsami Saponine
In questo scenario di ricerca fitochimica egrave stato
fondamentale il contributo delle conoscenze tradizionali
riguardo allrsquouso delle risorse vegetali conoscenze che hanno un
uso ampio e diverso dal ritualisticoa quello medicinale e
cosmetico In paesi in via di sviluppo come lrsquoEcuador queste
nozioni etnobotaniche sono parte della cultura tradizionale e
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riguardano in molti casi piante endemiche sulle quali
lrsquoinformazione scientifica relativa ai composti e ai meccanismi
drsquoazione egrave scarsa Sullrsquoampia varietagrave di piante che sono parte
integrante della tradizione indigena rimane ancora tanto da
studiare e le informazioni sui componenti chimici e biologici
sono ancora incomplete
Il presente lavoro egrave una descrizione dei processi di estrazionedi isolamento e drsquoidentificazione di metaboliti secondari
compiuti sulla pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman e di saggi di
attivitagrave antimicrobica
2 METABOLITI SECONDARI
Nelle piante la produzione di metaboliti secondari puograve
essere indotta da stress come ad esempio le radiazioni UV o
come meccanismo di difesa verso i nemici naturali Esistono tregrandi classi di MS
-Terpeni (29000) che derivano del lrsquoisopentenil pirofosfato
-Alacaloidi (12000) che provengono dagli aminoacidi
-Fenoli (8000) che derivano dalla via metabolica dellrsquoacido
Shkiminico o dalla via del malonato-acetato
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Una classificazione piugrave ampia divide i metaboliti secondari tra
- quelli contenenti Azoto (N) Alcaloidi glicosilati aminoacidinon proteici glicosidi cianogeni
-quelli non contenenti Azoto terpenoidi e fenolici
I metaboliti secondari sono coinvolti nella pigmentazione
cellulare di fiori e semi attraggono insetti impollinatori co
involgendosi indirettamente nel processo di riproduzione dellapianta La maggior parte di metaboliti secondari che vengono
usati come farmaci o come composti guida per la loro
produzione appartengono alle famiglie di terpenoidi alcaloidi e
flavonoidi In particolare alcuni composti di queste famiglie
sembrano avere unrsquoattivitagrave anti-cancerogena
La sintesi dei metaboliti secondari avviene in diversicompartimenti cellulari I composti idrofili vengono prodotti
principalmente nel citosol I terpenoidi e alcuni alcaloidi
vengono sintetizzati nel cloroplasto Altri alcaloidi sono
sintetizzati nei mitocondri insieme a certe amine Infine i
metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico (liscio)
La funzione dei metaboliti secondari egrave ancora motivo di
discussione Sono stati considerati come prodotti di scarto ma
questo non spiegava i fatti inseguito elencati
- I prodotti di scarto sono propri degli organismi eterotrofi
e non delle piante che sono esseri autotrofi
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-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto non si
potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani
- La produzione dei metaboliti secondari egrave strettamente
regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivitagrave
regolatorie non potendo essere cosigrave considerati delle scorie
Si puograve ritenere che le funzioni principali dei metaboliti
secondari siano
-Difesa contro gli organismi erbivori microbi o altre piante con
cui competono nel loro ambiente
-Protezione contro le radiazione UV
-Riproduzione
La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali neidiversi ecosistemi si crede abbia generato lrsquoimmensa varietagrave
biologica attuale che implica anche una diversitagrave chimica a
livello dei composti prodotti dai diversi organismi
La produzione di metaboliti secondari nella pianta non egrave
neccesariamente costitutiva generalmente viene indotta dalle
infezioni provocate dalle ferite rotture o attacco dei
microrganismi In alcuni casi nella zona attorno al danno i
compartimenti cellulari dove si trovano i precursori dei
metaboliti secondari si possono rompere rilasciandoli nel
citosol dove possono subire modificazioni chimiche operate da
enzimi Questo egrave il caso delle mirosinasi e i glucosinolati che
quando la cellula egrave intatta si trovano in compartimenti separati
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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sintesi inoltre lrsquoidentificazione di particolari scheletri molecolari
puograve essere utile per studi di tipo chemotassonomico
I metaboliti secondari appartengono alla gran varietagrave di
molecole (senza eterogenee) prodotte dalle piante superiori
che possono trovare importanti applicazioni commerciali in
campo farmaceutico cosmetico e alimentare Questo tipo di
composti sono prodotti dal metabolismo ma non sono ritenuti
essenziali per la crescita sviluppo o riproduzionedellorganismo in questo senso sono detti secondari La
funzione o limportanza di queste sostanze egrave normalmente di
natura ecologica in quanto esse possono essere utilizzate come
meccanismi di difesa contro predatori per la competizione
interspecifica o per facilitare i processi riproduttivi Alla
categoria dei metaboliti secondari vegetali appartengono granparte dei composti utilizzati dalluomo come stupefacenti
(morfina cocaina tetraidrocannabinolo ecc) Le classi
principali di metaboliti secondari
sono Alcaloidi Terpenoidi Acidi organoalifatici aromatici o
eteroaromatici Fenoli Iridoidi Steroidi Olii volatili Resine e
balsami Saponine
In questo scenario di ricerca fitochimica egrave stato
fondamentale il contributo delle conoscenze tradizionali
riguardo allrsquouso delle risorse vegetali conoscenze che hanno un
uso ampio e diverso dal ritualisticoa quello medicinale e
cosmetico In paesi in via di sviluppo come lrsquoEcuador queste
nozioni etnobotaniche sono parte della cultura tradizionale e
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riguardano in molti casi piante endemiche sulle quali
lrsquoinformazione scientifica relativa ai composti e ai meccanismi
drsquoazione egrave scarsa Sullrsquoampia varietagrave di piante che sono parte
integrante della tradizione indigena rimane ancora tanto da
studiare e le informazioni sui componenti chimici e biologici
sono ancora incomplete
Il presente lavoro egrave una descrizione dei processi di estrazionedi isolamento e drsquoidentificazione di metaboliti secondari
compiuti sulla pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman e di saggi di
attivitagrave antimicrobica
2 METABOLITI SECONDARI
Nelle piante la produzione di metaboliti secondari puograve
essere indotta da stress come ad esempio le radiazioni UV o
come meccanismo di difesa verso i nemici naturali Esistono tregrandi classi di MS
-Terpeni (29000) che derivano del lrsquoisopentenil pirofosfato
-Alacaloidi (12000) che provengono dagli aminoacidi
-Fenoli (8000) che derivano dalla via metabolica dellrsquoacido
Shkiminico o dalla via del malonato-acetato
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Una classificazione piugrave ampia divide i metaboliti secondari tra
- quelli contenenti Azoto (N) Alcaloidi glicosilati aminoacidinon proteici glicosidi cianogeni
-quelli non contenenti Azoto terpenoidi e fenolici
I metaboliti secondari sono coinvolti nella pigmentazione
cellulare di fiori e semi attraggono insetti impollinatori co
involgendosi indirettamente nel processo di riproduzione dellapianta La maggior parte di metaboliti secondari che vengono
usati come farmaci o come composti guida per la loro
produzione appartengono alle famiglie di terpenoidi alcaloidi e
flavonoidi In particolare alcuni composti di queste famiglie
sembrano avere unrsquoattivitagrave anti-cancerogena
La sintesi dei metaboliti secondari avviene in diversicompartimenti cellulari I composti idrofili vengono prodotti
principalmente nel citosol I terpenoidi e alcuni alcaloidi
vengono sintetizzati nel cloroplasto Altri alcaloidi sono
sintetizzati nei mitocondri insieme a certe amine Infine i
metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico (liscio)
La funzione dei metaboliti secondari egrave ancora motivo di
discussione Sono stati considerati come prodotti di scarto ma
questo non spiegava i fatti inseguito elencati
- I prodotti di scarto sono propri degli organismi eterotrofi
e non delle piante che sono esseri autotrofi
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-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto non si
potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani
- La produzione dei metaboliti secondari egrave strettamente
regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivitagrave
regolatorie non potendo essere cosigrave considerati delle scorie
Si puograve ritenere che le funzioni principali dei metaboliti
secondari siano
-Difesa contro gli organismi erbivori microbi o altre piante con
cui competono nel loro ambiente
-Protezione contro le radiazione UV
-Riproduzione
La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali neidiversi ecosistemi si crede abbia generato lrsquoimmensa varietagrave
biologica attuale che implica anche una diversitagrave chimica a
livello dei composti prodotti dai diversi organismi
La produzione di metaboliti secondari nella pianta non egrave
neccesariamente costitutiva generalmente viene indotta dalle
infezioni provocate dalle ferite rotture o attacco dei
microrganismi In alcuni casi nella zona attorno al danno i
compartimenti cellulari dove si trovano i precursori dei
metaboliti secondari si possono rompere rilasciandoli nel
citosol dove possono subire modificazioni chimiche operate da
enzimi Questo egrave il caso delle mirosinasi e i glucosinolati che
quando la cellula egrave intatta si trovano in compartimenti separati
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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riguardano in molti casi piante endemiche sulle quali
lrsquoinformazione scientifica relativa ai composti e ai meccanismi
drsquoazione egrave scarsa Sullrsquoampia varietagrave di piante che sono parte
integrante della tradizione indigena rimane ancora tanto da
studiare e le informazioni sui componenti chimici e biologici
sono ancora incomplete
Il presente lavoro egrave una descrizione dei processi di estrazionedi isolamento e drsquoidentificazione di metaboliti secondari
compiuti sulla pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowman e di saggi di
attivitagrave antimicrobica
2 METABOLITI SECONDARI
Nelle piante la produzione di metaboliti secondari puograve
essere indotta da stress come ad esempio le radiazioni UV o
come meccanismo di difesa verso i nemici naturali Esistono tregrandi classi di MS
-Terpeni (29000) che derivano del lrsquoisopentenil pirofosfato
-Alacaloidi (12000) che provengono dagli aminoacidi
-Fenoli (8000) che derivano dalla via metabolica dellrsquoacido
Shkiminico o dalla via del malonato-acetato
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Una classificazione piugrave ampia divide i metaboliti secondari tra
- quelli contenenti Azoto (N) Alcaloidi glicosilati aminoacidinon proteici glicosidi cianogeni
-quelli non contenenti Azoto terpenoidi e fenolici
I metaboliti secondari sono coinvolti nella pigmentazione
cellulare di fiori e semi attraggono insetti impollinatori co
involgendosi indirettamente nel processo di riproduzione dellapianta La maggior parte di metaboliti secondari che vengono
usati come farmaci o come composti guida per la loro
produzione appartengono alle famiglie di terpenoidi alcaloidi e
flavonoidi In particolare alcuni composti di queste famiglie
sembrano avere unrsquoattivitagrave anti-cancerogena
La sintesi dei metaboliti secondari avviene in diversicompartimenti cellulari I composti idrofili vengono prodotti
principalmente nel citosol I terpenoidi e alcuni alcaloidi
vengono sintetizzati nel cloroplasto Altri alcaloidi sono
sintetizzati nei mitocondri insieme a certe amine Infine i
metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico (liscio)
La funzione dei metaboliti secondari egrave ancora motivo di
discussione Sono stati considerati come prodotti di scarto ma
questo non spiegava i fatti inseguito elencati
- I prodotti di scarto sono propri degli organismi eterotrofi
e non delle piante che sono esseri autotrofi
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-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto non si
potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani
- La produzione dei metaboliti secondari egrave strettamente
regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivitagrave
regolatorie non potendo essere cosigrave considerati delle scorie
Si puograve ritenere che le funzioni principali dei metaboliti
secondari siano
-Difesa contro gli organismi erbivori microbi o altre piante con
cui competono nel loro ambiente
-Protezione contro le radiazione UV
-Riproduzione
La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali neidiversi ecosistemi si crede abbia generato lrsquoimmensa varietagrave
biologica attuale che implica anche una diversitagrave chimica a
livello dei composti prodotti dai diversi organismi
La produzione di metaboliti secondari nella pianta non egrave
neccesariamente costitutiva generalmente viene indotta dalle
infezioni provocate dalle ferite rotture o attacco dei
microrganismi In alcuni casi nella zona attorno al danno i
compartimenti cellulari dove si trovano i precursori dei
metaboliti secondari si possono rompere rilasciandoli nel
citosol dove possono subire modificazioni chimiche operate da
enzimi Questo egrave il caso delle mirosinasi e i glucosinolati che
quando la cellula egrave intatta si trovano in compartimenti separati
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Una classificazione piugrave ampia divide i metaboliti secondari tra
- quelli contenenti Azoto (N) Alcaloidi glicosilati aminoacidinon proteici glicosidi cianogeni
-quelli non contenenti Azoto terpenoidi e fenolici
I metaboliti secondari sono coinvolti nella pigmentazione
cellulare di fiori e semi attraggono insetti impollinatori co
involgendosi indirettamente nel processo di riproduzione dellapianta La maggior parte di metaboliti secondari che vengono
usati come farmaci o come composti guida per la loro
produzione appartengono alle famiglie di terpenoidi alcaloidi e
flavonoidi In particolare alcuni composti di queste famiglie
sembrano avere unrsquoattivitagrave anti-cancerogena
La sintesi dei metaboliti secondari avviene in diversicompartimenti cellulari I composti idrofili vengono prodotti
principalmente nel citosol I terpenoidi e alcuni alcaloidi
vengono sintetizzati nel cloroplasto Altri alcaloidi sono
sintetizzati nei mitocondri insieme a certe amine Infine i
metaboliti lipofili si trovano nel reticolo endoplasmatico (liscio)
La funzione dei metaboliti secondari egrave ancora motivo di
discussione Sono stati considerati come prodotti di scarto ma
questo non spiegava i fatti inseguito elencati
- I prodotti di scarto sono propri degli organismi eterotrofi
e non delle piante che sono esseri autotrofi
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-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto non si
potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani
- La produzione dei metaboliti secondari egrave strettamente
regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivitagrave
regolatorie non potendo essere cosigrave considerati delle scorie
Si puograve ritenere che le funzioni principali dei metaboliti
secondari siano
-Difesa contro gli organismi erbivori microbi o altre piante con
cui competono nel loro ambiente
-Protezione contro le radiazione UV
-Riproduzione
La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali neidiversi ecosistemi si crede abbia generato lrsquoimmensa varietagrave
biologica attuale che implica anche una diversitagrave chimica a
livello dei composti prodotti dai diversi organismi
La produzione di metaboliti secondari nella pianta non egrave
neccesariamente costitutiva generalmente viene indotta dalle
infezioni provocate dalle ferite rotture o attacco dei
microrganismi In alcuni casi nella zona attorno al danno i
compartimenti cellulari dove si trovano i precursori dei
metaboliti secondari si possono rompere rilasciandoli nel
citosol dove possono subire modificazioni chimiche operate da
enzimi Questo egrave il caso delle mirosinasi e i glucosinolati che
quando la cellula egrave intatta si trovano in compartimenti separati
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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-Se i metaboliti secondari fossero prodotti di scarto non si
potrebbe giustificare la loro produzione nei tessuti giovani
- La produzione dei metaboliti secondari egrave strettamente
regolata nel tempo e nello spazio e molti effetuano delle attivitagrave
regolatorie non potendo essere cosigrave considerati delle scorie
Si puograve ritenere che le funzioni principali dei metaboliti
secondari siano
-Difesa contro gli organismi erbivori microbi o altre piante con
cui competono nel loro ambiente
-Protezione contro le radiazione UV
-Riproduzione
La co-evoluzione tra piante e i loro nemici naturali neidiversi ecosistemi si crede abbia generato lrsquoimmensa varietagrave
biologica attuale che implica anche una diversitagrave chimica a
livello dei composti prodotti dai diversi organismi
La produzione di metaboliti secondari nella pianta non egrave
neccesariamente costitutiva generalmente viene indotta dalle
infezioni provocate dalle ferite rotture o attacco dei
microrganismi In alcuni casi nella zona attorno al danno i
compartimenti cellulari dove si trovano i precursori dei
metaboliti secondari si possono rompere rilasciandoli nel
citosol dove possono subire modificazioni chimiche operate da
enzimi Questo egrave il caso delle mirosinasi e i glucosinolati che
quando la cellula egrave intatta si trovano in compartimenti separati
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Ogni metabolita secondario ha le sue caratteristiche
chimiche specifiche il che implica processi di estrazione
specifici e metodi di analisi che devono pianificarsi in dettaglio
Dopo lrsquoestrazione e lrsquoisolamento questi metaboliti devono
essere caratterizzati e identificati con strumenti appositi
3 METODOLOGIE
Le tecniche e metodologie che vengono usate in questa
tesi sperimentale per lrsquoisolamento e la caratterizzazione di
metaboliti secondari appartengono a tecniche utilizzate nella
Chimica delle sostanze naturali Come egrave giagrave stato detto spesso i
metaboliti secondari sono molto diversi ma sono caratterizzati
da comuni origini biosintetiche e da proprietagrave chimico-fisicheche ci permettono di inglobarli in determinati gruppi Le
informazioni che possiamo ottenere dalle analisi di metaboliti
secondari interessano sia ricerche farmacologiche sia studi di
chemotassonomia Egrave stato detto anche che lrsquoestrazione dei
metaboliti richiede processi di estrazione specifici e metodi di
analisi pianificati
Generalmente il percorso dello studio dei metaboliti segue
le seguenti tappe
- Estrazione delle sostanze naturali dalla massa biologica di
partenza per ottenere i cosidetti estratti totali
- Separazione dei costituenti degli estratti totali
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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- Caratterizzazione dei costituenti puri tramite analisi fisico-
chimiche
La preparazione degli estratti egrave un passaggio determinante del
lavoro Le condizioni di lavoro in cui si deve lavorare devono
essere non denaturanti anche se non si conoscono le
caratteristiche apriori dei nostri metaboliti Si possono stabilire
comunque delle regole generali che ci permettono di ridurre il
rischio di degradazione dei nostri composti
Nel caso delle piante queste vengono sminuzzate
omogeneizzandole in un solvente a bassa temperatura in
quanto durante il trattamento meccanico della biomassa
vengono rotti dei compartimenti cellulari che possono
contenere enzimi in grado di apportare modificazioni chimiche
ai metaboliti secondari creando cosigrave artefatti la bassa
temperatura impedisce agli enzimi di essere operativi In
seguito si filtra la parte solida e si evapora il solvente si
ottengono cosigrave estratti di consistenza oleosa o cerosa che
vengono conservati a -20degC
In altre occasioni la preparazione dellrsquoestratto prevede un
essicamento della biomassa da utilizzare questa operazione
viene effettuata al riparo del sole in ambiente ventilato e a
temperature relativamente basse (30degC) Lrsquoessicamento egrave utile
quando si stanno cercando principi attivi che devono essere
attivi anche nella sua forma secca
La diversitagrave dei metaboliti secondari ci obbliga ad estrarre con
piugrave di un solvente o miscela di solventi aumentando la polaritagrave
ad ogni tappa di estrazione in seguito vengono elencati i
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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solventi che possono essere usati in ordine crescente di
polaritagrave
-Esano
-Cloruro di Metilene
-Acetato di Etile
-Metanolo
-Miscela di Acqua e metanolo
-AcquaSpesso gli estratti piugrave ricchi di molecole di interesse sono quelli
di polaritagrave media alta
Talvolta quando si vuole semplificare lrsquoestrazione questa si fa
con un solo solvente o una sola miscela di solventi ad esempio
EtOHH20 Da questa estrazione totale comunque si dovragrave
operare un processo di divisione chiamato Ripartizione bifasicache utilizza due solventi non miscibili di polaritagrave diversa messi
in un imbuto separatore dove viene messo lrsquoestratto totale
Nellrsquoimbuto separatore si formeragrave un sistema a due fasi una
sopra lrsquoaltra con un ordine che dipenderagrave dalla densitagrave dei
solventi In questo sistema i metaboliti si ripartiranno secondo
la loro affinitagrave con i determinati solventi Ad esempio in unsistema a due fasi in cui abbiamo usato Esano e Acqua i
metaboliti meno polari tenderanno a distribuirsi nella fase
organica mentre quelli piugrave polari si distribuiranno in acqua
Le procedure finora descritte riguardano unrsquoestrazione
indiscriminata di tutti i metaboliti secondari e operando in
questo modo nei nostri estratti ldquototalirdquo troveremo piugrave composti
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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da separare e caratterizzare Tuttavia esistono procedure di
estrazione mirata o selettiva in cui si estraggono composti che
possiedono determinate caratteristiche chimiche Queste
estrazioni si effettuano utilizzando condizioni e solventi piugrave
selettivi ad esempio lrsquouso di solventi acidi per separare
sostanze basiche come nel caso dellrsquoestrazione degli alcaloidi
Nello stesso modo si usano solventi di natura basica per
lrsquoestrazione di acidi Si puograve inoltre far ricorso anche alla
distillazione in corrente di vapore per ottenere gli oli essenziali
Una volta ottenuti gli estratti totali si puograve procedere con i
processi di separazione e purificazione dei componenti
Attualmente la tecnica di separazione piugrave usata egrave la
cromatografia per ripartizione che si basa sulla diversa affinitagrave
che i metaboliti possono avere per una fase stazionaria e unafase mobile La cromatografia di ripartizione viene divisa
principalmente i due grandi classi
-cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria
polare (gel di silice) utilizzando solventi di polaritagrave media bassa
(esano acetato drsquoetile cloruro di metilene)
-Cromatografia di ripartizione in fase inversa Fase
stazionaria apolare (gel di silice in cui i gruppi idrossile sono
esterificati con catene idrocarburiche C-18 ) con solventi a
polaritagrave alta
Quando si ha una piccola quantitagrave di miscela e si vuole
ottenere una risoluzione maggiore nella separazione dei
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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componenti si puograve far ricorso alla cromatografia strumentale
come la High Performance Liquid Cromatography HPLC
Combinazione di tecniche cromatografiche tradizionali con
quelli strumentali ottengono dei buoni risultati in tempi
relativamente brevi
Eventualmente quando si ha a disposizione di composti
quasi puri e in quantitagrave sufficiente si ricorre ai metodi di
purificazione tradizionali quali la distillazione frazionata (oliessenziali nicotina) la ricristallizzazione e la sublimazione
(canfora caffeina)
I composti puri devono essere caratterizzati e identificati
cioegrave ne devono essere identificate la struttura chimica la
stereochimica e le principali proprietagrave chimico-fisiche Per
lrsquoidentificazione ci sono diverse tenciche spettroscopiche di cui
le piugrave importanti sono basate sulla tecnologia della risonanza
magnetica nucleare (NMR) Le spettroscopie NMR del protone
(1H-NMR) e del carbonio (13C-NMR) sono le prime tecniche di
indagine a cui il composto puro egrave sottoposto
Altre tecniche spettroscopiche di indagine strutturale chesi affiancano a quelle NMR sono la spettroscopia di
assorbimento nellrsquoinfrarosso (IR) che permette di identificare i
gruppi funzionali della molecola la spettrometria di massa (MS)
che permette di risalire al peso molecolare noncheacute ad altre
informazioni strutturali la spettrofotometria UV-visibile che
riconosce la presenza nelle molecole di particolari cromofori
grazie alle relative bande di assorbimento
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Attualmente si dispone di strumenti che permettono
lrsquoidentificazione dei metaboliti secondari in maniera piugrave veloce e
affidabile arricchendo cosigrave le banche dati di molecole Da
queste banche si possono consultare i dati riguardanti le
caratteristiche chimico-fisiche dei metaboliti Queste
conoscenze possono servire per una successiva identificazione
rapida e semplice di metaboliti o di specie nuove o di specie
che non siano ancora state studiate approfonditamente a livello
fitochimico
Nella parte esperimentale per la elaborazione di questa
tesi sono state usate la maggior parte delle tecniche descritte
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHEMi egrave sembrato opportuno per maggiore chiarezza
presentare le usanze indigene che coinvolgono la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman o come viene chiamata in lingua
Kichwa ldquoChiriguayusardquo
Nella tradizione indigena locale le foglie e la corteccia
vengono usate principalmente a scopo terapeutico come anti-
infiammatorio emolliente e tonificante
In seguito si descrivono alcune preparazioni tradizionali
che prevedono lrsquouso della ldquoChiriguayusardquo
Per il recupero fisico post-parto in 5 litri drsquoacqua bollente
si mettono 15 foglie secche e si lasciano bollire per 30 minuti
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
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Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Con questa acqua la puerpera deve bagnarsi tutti i giorni per
una settimana
Invece per lrsquouso anti-infiammatorio le foglie o la
corteccia macinate possono essere applicate su ferite e gonfiori
Le foglie o la corteccia possono anche essere bolliti per poi
inumidire con questo decotto gli indumenti da usare su
eventuali aree gonfie1
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA
Brunfelsia egrave un genere di pianta
della famiglia delle Solanacee comprendente circa 50 specie Il
genere descritto per la prima volta in Brasile attorno al 1640 egrave
originario dellrsquoAmerica centro-meridionale e delle Indie occidentali
Nei tessuti vegetali di questo genere di pianta sono stati
trovati alcaloidi allucinogeni con struttura simile a quella
dellrsquo atropina Tinture della pianta venivano utilizzate per scopi
medici o cerimonie religiose da popolazioni indigene
Sono classificate in letteratura numerose specie di
Brunfelsia ma solo su alcune di esse sono stati effettuati studi di
carattere fitochimico
1USEFUL PLANTS OF ECUADOR Applications Challenges and Perspectivespagina 293 Prima Edizione
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Studi su altre specie dello stesso genere vengono riportati
qui di seguito
In un primo lavoro2 sui petali di Brunfesia Calcyna si
cercava di individuare il motivo del cambiamento di colore e
dellrsquoincremento del profumo ed erano state ipotizzate due
soluzioni la prima che avvenisse per induzione del pathway
metabolico dellrsquoacido shkimico la seconda per degradazione di
antocianine La prima ipotesi egrave risultata la piugrave probabilecontribuendo in maniera importante a chiarire i processi di
produzione di metaboliti secondari del genere Brunfelsia
Lavori su Brunfelsia Grandiflora hanno caratterizzato una
saponina di tipo Furostano che ha mostrato unrsquoattivitagrave
leishmanicida potente2
Dalla pianta Brunfelsia hopeana Benth egrave stata isolata una
cumarina la scopoletina con la quale sono stati effettuati test
che suggeriscono unrsquoattivitagrave spasmolitica non specifica
associata almeno in parte allrsquoinibizione della mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare dagli store nor-adrenaline dipendenti3
2A new leishmanicidal saponin from Brunfelsia grandiflora Fuchino et AlResearch Center for Medicinal Plant Resources National Institute of Biomedical Innovation Ibaraki
Japan
3Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin
Oliveira EJ Romero MA Silva MS Silva BA Medeiros IA
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Uno studio4 volto a rilevare unrsquoattivitagrave antiofidica e anti-
infiammatoria di diverse piante ha incontrato in Brunfelsia
Uniflora unrsquoattivitagrave analgesica lieve
Brunfelsia Chirikaspi Plowman non presenta studi
scientifici precedenti tranne qualche citazione come in
unrsquoarticolo sullrsquoutilizzo di piante allucinogene nella Cultura San
Agustin in Colombia 4
6 MATERIALI
Per le tecniche cromatografiche
bull Kieselgel 60 Merck (230-400 mesh) per separazioni su
colonna
bull LiChrospher 100 RP-18 (12 microm) Merck per separazioni su
colonna a fase inversa
bull lastre in alluminio per TLC su gel di silice Fluka dotate di
indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lastre in alluminio per TLC su fase inversa Merck RP-18
dotate di indicatore di fluorescenza a 254 nm
bull lampada a fluorescenza a 254 e 366 nm
bull soluzione rivelatrice per TLC costituita da vanillina 05
in acido solforico-etanolo 41
Per la caratterizzazione spettroscopica
bull spettrometro NMR Brucker CXP 200 MHz
4Alter ego representations in San Agustin monolithic sculptures possible planthallucinogenic influence de Rios MD University of California Irvine CA USA
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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1 PROCEDURA SPERIMENTALE
Il lavoro di tesi inizia in Ecuador con la raccolta delle foglie
di questa pianta nel mese di dicembre 2009 nella forestaamazzonica dellrsquoEcuador nella provincia di Napo (Sucumbios)dove prevale un clima umido tropicale
Le foglie sono state essiccate ad una temperatura media di35degC Una volta secche sono state macinate ed egrave stata ottenutauna polvere eterogenea di circa 300g Sono stati effettuati dueprocessi di estrazione utilizzando per ciascuno solo la metagravedelle foglie essiccate le due estrazioni sono state condotte atemperatura ambiente ed utilizzando due miscele di solventidiverse la prima utilizzando etanolo e acqua in rapporto 955ottenendo lrsquoEstratto I e la seconda con gli stessi solventi ma inrapporto 7030 ottenendo Estratto II
Le due soluzioni con le foglie sono state lasciate macerareper dodici ore in seguito si egrave filtrata la parte solida edevaporato il solvente In questa maniera si sono ottenuti i due
estratti secchi lrsquoEstratto I del peso di 1938 g e lrsquoEstratto II del
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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peso di 799 g Le procedure finora descritte sono state fatte nellaboratori dellrsquoUPS in Ecuador
In questa forma gli estratti sono giunti al laboratorio B2 delDipartimento di Chimica Organica nel mese di febbraio 2010 edegrave a questo punto che inizia il mio lavoro di identificazione deicomponenti degli estratti
Sono state effettuate analisi cromatografiche preliminarisu lastre TLC in fase diretta e inversa per verificare seesistessero differenze significative tra i due estratti(immagine
delle TLC) Da queste TLC egrave risultato che i due estratti eranocostituiti da dagli stessi composti si egrave quindi deciso di riunire 6g di ogni estratto in una frazione chiamata Estratto Totale
Successivamente sono state operate una serie diripartizioni bifasiche lrsquoEstratto Totale egrave stato posto in 500 mL diuna soluzione idroalcolica al 90 e le ripartizioni sono stateeffettuate utilizzando esano acetato di etile butanolo e acqua
Cosigrave operando si sono ottenute quattro frazioni dallrsquoestrattototale chiamate a seconda del solvente utilizzato Frazioneesanica Frazione in AcOEt Frazione Butanolica e FrazioneAcquosa
Alla Frazione in AcOEt egrave stata aggiunto sodio solfato per
togliere lrsquoeventuale acqua che puograve essersi unita al solvente
dopo che il sale egrave stato filtrato sono stati allontanati i solventi
in atmosfera ridotta tramite evaporatori rotanti Sono cosigrave state
ottenute le rispettive frazione secche dai pesi riportati in tabella
1
FRAZIONE PESO
Esanica 3156
Acetato di Etile 252
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Butanolica 627
Acquosa 22Tabella 1
Sono state fatte alcune prove cromatografiche in TLC infase diretta e inversa utilizzando diverse miscele eluenti peravere unrsquoidea della composizione delle frazione ottenute Unesempio di queste TLC sono riportate nelle fig 1
Figura 1
Da queste prime analisi si egrave scelto di lavorare unicamentecon la frazione in Acetato di Etile
Si egrave deciso di sottoporre la Frazione Acetato di Etile aseparazione cromatografica in fase diretta sono stati quindiprelevati 12 g di estratto ed egrave stata allestita una colonna
cromatografica utilizzando 50g di gel di silice ed utilizzando
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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circa 2 L di una miscela composta da esano ed acetato drsquoetile inrapporto 31
Di questa frazione erano giagrave state individuate nelle TLCpreliminari le clorofille che se poste alla luce UV a 366 nmrisultano di colore rosso Come ci si aspettava questi compostisono stati i primi ad essere eluiti dalla colonna ed essendopresenti in ogni estratto di pianta sono stati scartati Dalle TLCdelle provette della colonna hanno mostrato la presenza di uncomposto che dopo rivelazione con una soluzione di vanillina in
acido solforico ed etanolo diventava viola Le provettecontenenti questo composto sono state riunite in unrsquounicafrazione chiamata Frazione I che dopo evaporazione delsolvente aveva una massa di 256mg TLC IN FIGURA 2 mostra lefrazioni con il composto viola prima della reunione
Figura 2
Dopo varie prove in TLC riportate in fig345 della frazioneI abbiamo individuato che le migliori condizioni per separare i
componenti presenti nella frazione prevedono lrsquoutilizzo della
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
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C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
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C
12mg
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C
12mg
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12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
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C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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fase inversa e di una miscela eluente composta da metanolo edacqua in rapporto
Figura 3 Figura 4
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Egrave stata quindi preparata una colonna 18g di fase inversaper separare i 256 mg della Frazione I Le frazioni sono state
analizzate mediante TLC riportate in fig 5 da cui egrave risultataevidente la separazione di alcuni composti
Figura 5
Dopo colonna sono state raccolte le frazioni similicercando di non contaminare le frazioni relativamente pureDurante questrsquooperazione si egrave notata la presenza di particolatoproveniente dalla fase inversa che era passata attraverso ilsetto di vetro sinterizzato della colonna per eliminare la fasestazionaria dai campioni sono stati realizzate delle microfiltrazioni utilizzando semplicemente del cotone idrofilo posto inuna pipetta pasteur
Sulla base delle TLC in fig5 sembrava essere promettenteil composto JEP-1 che se posto sotto luce UV a 366 nm emette
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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una fluorescenza blu inoltre se TLC veniva rivelata con unasoluzione di permanganato di potassio (K2MnO4) il composto in
questione era visibile come una macchia gialla come si vedenella TLC riportata in fig5 Sono state raccolte le frazionicontenenti il composto che una volta secco era di circa 20 mg
Successivamente si egrave deciso di purificare ulteriormente ilcampione mediante una ldquomicro-colonnardquo in fase diretta con 1gdi silice e come eluente una miscela di esano ed acetato drsquoetilein rapporto 23 incrementando gradualmente la polaritagrave
dellrsquoeluente aggiungendo gocce di metanoloAl termine dellrsquoultima piccola colonna il campione egrave
risultato sufficientemente puro per le analisi spettroscopiche espettrometriche Egrave stato sottoposto ad unrsquoanalisi 1H-NMR e lospettro egrave riportato in fig () ed ad unrsquoiniezione in LC-MS di cuiriporto il cromatogramma in fig ()
Fig()
Fig ()
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Per chiarezza ripropongo lo schema delle estrazioni e delleseparazione cromatografiche che mi hanno portato alla
caratterizzazione della isoscopoletina
2 CARATTERIZZAZIONE
Dagli analisi 1H-NMR della Frazione 3 della microcolonna
abbiamo identificato la nostra sostanza come lrsquoisomero della
scopoletina iso-scopoletina E tramite comparazione con altri
spettri 1H-NMR presenti in bibliografia lrsquoabbiamo comprovato
Lo spettro H-NMR ci mostrava la pressenza di un gruppo
metossi con il segnale 4ppm I segnali degli H sono riportatinella tabella2
H Segnale
(ppm)
3 630
4 765
5 686
8 693
Tabella 2
Immagine della molecola isoscopoletina
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
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C
25mg
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25mgml
25mgml
C
12mg
ml
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ml
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12mg
ml
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ml
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C
12mg
ml
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12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
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C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
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C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Figura 6
Lo spettro di massa ci ha rivelato la pressenza di uno ione
molecolare con una massa di 1911g la massa corrispondente
allrsquoiso-scopoletina egrave di 19216g il fatto che sia un grammo inmeno puograve essere dovuto a che probabilmente nellrsquoanalisi lrsquoiso-
scopoletina perda unrsquoione
In letteratura sono pubblicati gran numero di articoli che
identificano alcune attivitagrave della scopoletina ma non ci sono
articoli relativi allrsquoiso-scopoletina Lrsquoattivitagrave della scopoletina e
varia da attivitagrave antimicrobica a inibitore di diversi recettori ed
enzimi cellulari
La scopoletina egrave stata isolata in Brunfelsia hopeana come
era stato segnalto nelle pagine precendeti
Le cumarine gruppo di cui fa parte la scopoletina
vengono prodotte in quasi tutte le piante La scopoletina egrave statatrovata in piante dei generi Scopolia Viburnum Artemisia e
Brunfelsia La biosintesi della scopoletina viene riportata in
seguito nella figura 7
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
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C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Figura 7
3 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo
Gli sperimenti relativi alla ricerca di Bioattivitagrave sono
stati effetuati presso la Sezione di Micologia del
Dipartimento di Ecologia del Territorio dellrsquoUniversitagrave di
Pavia sotto la guida della Dottoressa Solveig Tosi
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
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03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Lo scopo di questi sperimenti egrave quello di individuare
possibili attivitagrave antimicrobiche di Brunfelsia ChirikaspiPlowman e anche nel caso di risposte positive
indirizzare posteriori lavori drsquoisolamento nelle altre
frazioni
Le frazioni ottenute dalle ripartizioni bifasiche
Frazione Esanica Butanolica in Acetato di Etile eAcquosa sono state usate nei test di bioattivitagrave
Abbiamo testato le frazioni in 4 microrganismi 2 batteri
Bacillus subtillus e Staphylococcus aureus e due funghi
Candida Albicans e Aspergillus niger
In esame abbiamo portato le seguenti quantitagrave
Fraz Esanica 351 mg 02 ml di
solv
Fraz in
Acetato di
Etile
152 mg 09 ml di
solv
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
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C
S
06mg
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06mg
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06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
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03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Fraz Acquosa 124 mg 124 ml di
solvFraz
Butanolica
486 mg 012 ml di
solv
Tabella 3
I campioni sono stati sciolti in cicloesano (FHex)acqua (Facquosa) e metanolo (F Acetato di etile e
butanolica) nella minor quantitagrave di solvente possibile
per non sorpassare le concentrazione alcoliche che
possono tollerare i microrganismi
Lo sperimento egrave stato effettuato nella maniera inseguito descritta
Su piastre a celle (8x12) abbiamo messo del
terreno liquido opportuno per ogni microrganismo LB
per i batteri e Sabouraud per i funghi Lrsquooperazione di
riempimento delle piastre egrave stata compiuta con lrsquoausilio
di una cappa a flusso laminare verticale in modo da
conservare le adeguate condizioni di sterilitagrave
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
C
25mg
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25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
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C
12mg
ml
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C
06mg
ml
06mg
ml
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C
S
06mg
ml
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06mg
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C
S
06mg
ml
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06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
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C
S
03mg
ml
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ml
03mg
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C
S
03mg
ml
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03mg
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C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
C
12mg
ml
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C
12mg
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12mg
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C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
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C
S
06mg
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06mg
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C
S
06mg
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C
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03mg
ml
03mg
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03mg
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C
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03mg
ml
03mg
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C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
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25mgml
25mgml
C
25mg
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C
12mg
ml
12mgml
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C
12mg
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12mgml
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C
12mg
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C
06mg
ml
06mg
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06mg
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C
S
06mg
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06mg
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06mg
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C
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06mg
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06mg
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06mg
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C
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03mg
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03mg
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03mg
ml
C
S
03mg
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03mg
ml
03mg
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C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Egrave stato decisso di fare prove dei campioni a diverse
concentrazioni per ogni microrganismo
-2 mgml
-1mgml
-05 mgml
-025 mgml
-0125 mgml
-0061mgml
-0036 mgml
Le diverse prove a diverse concentrazioni e con i
diversi estratti sono state organizzate per ogni
microrganismo e con i rispettivi controlli cosigrave
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C 5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
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C
25mg
ml
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25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
12mg
ml
12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 4
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
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C
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ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
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C
12mg
ml
12mg
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C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
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06mg
ml
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ml
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ml
C
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06mg
ml
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ml
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C
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03mg
ml
03mg
ml
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ml
C
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03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
25mg
ml
25mgml
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C
25mg
ml
25mgml
25mgml
C
12mg
ml
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12mgml
C
12mg
ml
12mgml
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C
12mg
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12mgml
12mgml
C
06mg
ml
06mg
ml
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C
S
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ml
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C
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06mg
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06mg
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C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
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C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
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C 5mgml
5mgml
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C 5mgml
5mgml
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C
25mg
ml
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C
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C
25mg
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C
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C
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C
12mg
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C
06mg
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06mg
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C
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C
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03mg
ml
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C
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C
S
Tabella 4
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
25mg
ml
25mgml
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C
25mg
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C
25mg
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25mgml
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C
12mg
ml
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ml
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C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
12mg
ml
12mg
ml
12mg
ml
C
06mg
ml
06mg
ml
06mg
ml
C
S
06mg
ml
06mg
ml
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ml
C
S
06mg
ml
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ml
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C
S
03mg
ml
03mg
ml
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ml
C
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03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
5mgml
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C
25mg
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C
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C
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C
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C
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C
06mg
ml
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C
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03mg
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03mg
ml
C
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03mg
ml
03mg
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03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Cs Controllo della concentrazione del solvente
La frazione acquosa egrave stata fatta in altri due
piastre alle stesse concentrazioni e con gli stessi
microrganismi
Sono stati fatti i calcoli a partire delle soluzioni di
partenza per avere in ogni pozzetto della piastra le
concentrazioni riportate Dalla soluzione di 2mgml sono
state fatte delle diluizioni seriali in modo da ottenere
quelle meno concentrate alla fine ogni pozzetto
conteneva un volume tra terreno e campione di 200 microL
I pozzetti sono stati inoculati con i microrganismi
prima nominati con una quota di 1microL per pozzetto Egrave
opportuno ricordare che queste procedure sono state
effettuate in condizioni di sterilitagrave
Le piastre sono state incubate per 24 ore a una
temperatura di 24degC
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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5mgml
5mgml
5mgml
C
5mgml
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C
5mgml
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C
25mg
ml
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C
25mg
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25mg
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C
12mg
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C
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C
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03mg
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03mg
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C
S
Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
5mgml
5mgml
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C
5mgml
5mgml
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C
5mgml
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C
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C
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C
12mg
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C
12mg
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12mgml
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C
06mg
ml
06mg
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C
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06mg
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06mg
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C
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03mg
ml
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C
S
03mg
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03mg
ml
03mg
ml
C
S
03mg
ml
03mg
ml
03mg
ml
C
S
Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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4 RISULTATI DEI SAGGI DI BIOATTIVITagrave
Dopo un giorno drsquo incubazione abbiamo visto le
piastre non crsquoegrave stata alcuna inibizione nelle piastre che
contenevano la frazione acquosa Delle altre piastre i
risultati vengono riportati
Candida Albicans quando non crsquoegrave stata crescita egrave
stato segnalato col colore rosso
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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Tabella 6
In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Tabella 5
Bacillus Subtilis
F Esanica C F Butanolica C F AcOEt C
2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C 2mgml 2mgml 2mgml C
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C 1mgml 1mgml 1mgml C
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In Aspergillus niger non sono stati rilevati risultati
positivi
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5 CONCLUSIONI
Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
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Nel presente lavoro egrave stata presentata la pianta
Brunfelsia Chirikaspi Plowman nellrsquoambito della ricercadi cui si occupa la Chimica delle Sostanze Naturali
Questa pianta che aveva attirato la nostra attenzione
dai suoi precendeti etnobotanici ha dimostrato di avere
composti come lrsquoisoscopoletina che possono esplicare
attivitagrave di uso farmacologico
Su Brunfelsia sono stati effetuati lavori di
estrazione isolamento e caratterizzazione che ci hanno
portato a isolare e a caratterizzare la molecola
isoscopoletina nella frazione in Acetato di Etile
I saggi di bioattivitagrave
Con questo lavoro le potenzialitagrave di Brunfelsia
Chirikaspi Plowman sono state messe a considerazione
il lavoro su Brunfelsia C Plowman egrave ancora lungo ma si
spera che i primi passi fatti con questo lavoro servano
come punto di partenza per lavori succesivi
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
592018 Estrazione Di Metaboliti Secondari Della Pianta Brunfelsia Chirikaspi Plowma
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INDICE1 INTRODUZIONE2
2 METABOLITI SECONDARI4
3 METODOLOGIE6
4 CONOSCENZE ETNOBOTANICHE10
5 INFORMAZIONI SUL GENERE BRUNFELSIA11
6 MATERIALI13
7 PROCEDURA SPERIMENTALE14
8 CARATTERIZZAZIONE20
9 SAGGI DI BIOATTIVITArsquo22
11 CONCLUSIONI29
