ESPERIMENTI CON

ORGANI ISOLATI

LA SPERIMENTAZIONE

1. Modelli semplificati (cellule in coltura, esperimenti

in vitro, organi isolati studi di binding)

2. Modelli complessi (esperimenti in vivo)

1+2. Informazioni fondamentali per l’uso clinico

di un farmaco, ma influenzato da assorbimento,

farmacocinetica e meccanismi riflessi.

PERCHE’ SI UTILIZZA QUESTO TIPO DI

TECNICA NELLA FARMACOLOGIA

SPERIMENTALE?

•Per identificare il tipo e l’ordine di grandezza di

risposta che si ha per una sostanza sconosciuta

•Per poter quantificare l’effetto farmacologico di

una sostanza

•Per consentire la previsione di un possibile

effetto terapeutico

Esiste una notevole corrispondenza tra i recettori

isolati nell’animale e quelli dell’uomo

L’isolamento di un organo permette di eliminare le

variazioni delle influenze circolatorie ed ormonali.

Viene però mantenuta la divisione fisiologica in

compartamenti del tessuto (il vascolare, l’interstiziale,

l’intracellulare).

Si può pensare che le risposte ai farmaci ottenute

nell’animale siano predittive di quelle dell’uomo

DA DOVE PROVIENE UN ORGANO ISOLATO?

• Da animali di laboratorio sani o da animali con

patologie spontanee o indotte chirurgicamente o

farmacologicamente

• Dall’uomo come ”by products” di procedure

chirurgiche o mediante la rapida acquisizione post-

mortem

Un tessuto in vitro non è un tessuto in vivo, è quindi opportuno

modificare i sali della soluzione fisiologica per mantenere il

preparato nella condizione più adeguata.

CARATTERISTICHE DI

UN ORGANO (o TESSUTO) ISOLATO

Devono avere alcuni requisiti fondamentali:

capacità a rimanere vitali

stabilità

omogeneità anatomica

Composizione del sangue

[Il sangue può essere considerato come un tessuto connettivo, formato da cellule sospese in una matrice fluida, chiamata plasma

Ha una azione principalmente di trasporto: ossigeno, le sostanze nutritizie, metaboliti, ormoni, ecc]

• H2O

• Soluti organici

• Elettroliti

• Proteine – Albumina

– Globuline

– Fibrinogeno

•Piastrine

•Eritrociti

•Leucociti –Neutrofili

–Eosinofili

–Basolfili

–Linfociti

–Monociti

siero PLASMA

ELEMENTI

CELLULARI granulociti

leucociti linfoidi

Principale composizione del plasma

• Cationi

– Na+, K+, Ca 2+, Mg 2+,

• Altri minerali

– ferro, rame, iodio in tracce;

• Anioni

– Cl-, fosfati, solfati, bicarbonati, proteine, acidi organici

• Proteine

– albumina, globuline, fibrinogeno

• Azoto non proteico

– urea, ac. urico, creatinina, creatina, sali di ammonio

• Sostanze nutritizie

– H20 (90%)

– glucosio, ac. lattico, aminoacidi, colesterolo, fosfolipidi, lecitina

• Gas

– N2, O2 (2%), CO2 (60%)

Soluzioni fisiologiche per organi isolati

(isotoniche con il plasma)

“Fisiologica” è l’attributo che si associa a numerose

soluzioni saline

Soluzione salina (isotonica) NaCl 0.9% = ……… g/l

MW (NaCl) = 23 + 35.5 = 58.5

154 mmol/l

pH = 7 (6.8 a 37°C)

Plasma normale

Na+ = 145 mmol/l

Cl- = 110 mmol/l

pH = 7.4

Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati (mmoli/litro)

Ringer anfibi

Krebs

ileo stim

musc.schel.

Tyrode

cuore

ileo

Ringer

Tyrode

Locke

De Jalon

utero

Reiter

NaCl 111.0 118.0 137.0 154.0 154.0 115.0

KCl 1.87 4.69 2.68 5.63 5.63 4.7

MgSO4 --- 1.18 1.05 --- --- 1.2

NaH2PO4 0.04 --- 0.42 --- --- ---

KH2PO4 --- 1.2 --- --- --- 1.2

Glucosio 11.0 11.0 5.6 5.6 2.8 10.0

NaHCO3 4.8 25.0 11.5 6.0 6.0 25.0

CaCl2 1.08 2.52 1.8 1.08 2.7 1.8

Gas aria 95% O2

5% CO2

O2

O2 95% O2

5% CO2

95% O2

5% CO2

SOLUZIONI FISIOLOGICHE

per organi isolati

La soluzione fisiologica deve:

assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive

apporto di O2 (?)

temperatura 37°C (?)

corretta composizione ionica

pH costante

osmolarità costante

CONCENTRAZIONI DI ALCUNI ELETTROLITI (mM) E DELLE PROTEINE

(g/100 ml) NEL PLASMA DI ALCUNE SPECIE

Uomo Ratto Porcellino d’India

Na+ 150 151 145

K+ 3.6 5.9 7.4

Cl- 102 110 105

Ca2+ 2.4 2.5 2.2

proteine 7.0 6.3 5.4

Variabile: CONCENTRAZIONE IONICA

Miscela di acido debole e della sua base coniugata:

la sua funzione è quella di minimizzare la

variazione di pH

Perché una coppia coniugata possa essere

considerata come un tampone

di rilevanza fisiologica:

a) pKa = pH fisiologico + 1

b) sufficiente capacità tampone

Variabile: SOLUZIONE TAMPONE

Variabile: TEMPERATURA

• Variabile fisiologica

• Influenza la risposta basale di un tessuto

• Influenza la risposta a farmaci

• Influenza il pH della soluzione

Esempi:

– Utero di ratto femmina

– T basse = ridotto consumo di ossigeno tissutale

Strumentazione base

per organi isolati e perfusi

non stimolati

16

bagnetto a camicia

bombola di oxicarb

ciclotermo (temperatura 32-37°C)

trasduttore

amplificatore

registratore

Strumentazione: BAGNETTI

A camicia:

• E’ un bicchiere di vetro con una camicia intorno

alla quale circola acqua calda a 37° C.

• E’ il più usato poiché è possibile montare una

serie di bagnetti in parallelo.

• In questo tipo i bagnetto il tessuto è

completamente immerso nel liquido.

A cascata:

• Utile per determinare l’emivita di alcune

sostanze (es: NO)

• Si possono utilizzare tessuti (organi) diversi

• Si possono inibire i recettori di un tessuto

rispetto ad altri

TRASDUTTORI DI FORZA

(apparecchi leva)

Il tessuto nel bagnetto è collegato ad un

apparecchio leva (trasduttore).

Tramite il trasduttore si rileva

la reattività del tessuto.

SEGNALE ELETTRICO

Trasduttore isotonico collegato

ad ileo di cavia (esempio 1)

L’ileo isolato di cavia collegato al trasduttore

isotonico ed immerso in un bagnetto:

l’ileo si muove spontaneamente

Si somministra ACh e, poiché ci sono recettori

muscarinici, il tessuto si contrae:

l’ileo si accorcia = il trasduttore si abbassa

Trasduttore isometrico collegato

ad ileo di cavia (esempio 2)

L’ileo isolato di cavia collegato al trasduttore isometrico ed

immerso in un bagnetto:

l’ileo rimane fermo

Si somministra ACh, ma non si ha accorciamento,

trattandosi di una leva imperniata, però il tessuto reagisce lo

stesso

La reazione del tessuto si trasduce in una forza che il

tessuto esercita sulla leva.

Il movimento del trasduttore è convertito

in potenziale elettrico che può essere

amplificato e registrato come il

movimento della penna su un

registratore a carta

Alcuni esempi in commercio

COSA LEGGIAMO SUL REGISTRATORE?

Nel trasduttore isotonico si ha una variazione di

lunghezza (il registratore registra un’ampiezza e

l’unità di misura è in mm)

Nel trasduttore isometrico non si hanno

variazioni di lunghezza ma avremo una

variazione di forza e l’unità di misura è il

grammo.

A COSA SERVE L’AMPLIFICATORE?

• Per segnali di piccola o piccolissima intensità

• Per segnali di grandezza maggiore

Registrazione e interpretazione del segnale

Ridurre interferenza di segnali estranei

Apparecchiatura per test in vitro su

ileo isolato e stimolato elettricamente

27

Ileo isolato

• Specie : Guinea pig (rat)

• Tipo di preparato: si misura l’attività contrattile di segmenti di ileo registrati in condizioni isometriche.

• Quali molecole si valutano: farmaci attivi sui recettori muscarinici, istaminergici, serotoninergici, nicotinici, per la bradichinina e la colecistochinina e farmaci ad effetto spasmolitico o spasmogenico muscolare.

• Molecole di riferimento: Atropine, BaCl2, Bradykinin, Carbachol, Cholecystokinin, Hexamethonium, Histamine, LTD4, Nicergoline, Nicotine, Papaverine, Pyrilamine, Serotonin.

duodeno + digiuno + ileo = tenue

Nello spessore della parete di tutto il tubo digerente vi sono numerosissimi gangli situati nella sottomucosa (Plesso di Meissner) e tra lo strato longitudinale e quello trasversale della tonaca muscolare (Plesso di Auerbach) che regolano le varie funzioni dell'apparato digerente.

Struttura del tratto gastrointestinale

ESPERIMENTI CON LA MUSCOLATURA

LISCIA INTESTINALE

• Innervazione parasimpatica (a mediazione

colinergica

– Plesso mienterico di Auerbach

– Plesso submucoso di Meissner

• Innervazione simpatica (inibisce i movimenti

peristaltici, a mediazione adrenergica)

– Fibre lungo le arterie

Controllo della funzione gastrointestinale

Sistema simpatico inibisce le

secrezioni ed eccita la

contrazione degli sfinteri

(risposta di attacco-fuga)

Sistema parasimpatico eccita

la contrazione e la motilita’

intestinale

Principali preparati di intestino “in vitro”

• Ileo terminale di cavia (metodo di Magnus, 1904)

• Long strip = fibre muscolari longitudinali di ileo con plesso mienterico di Auerbach (metodo di Paton e Vizi, 1968)

• Ileo terminale di cavia (metodo di Trendelenburg, 1917)

• Sacculus del colon di cavia (metodo di Botting)

• Digiuno di coniglio con stimolazione elettrica periarteriale (metodo di Finkleman, 1930)

• Duodeno di ratto

• Ileo di topo

• Intestino di pesciolino rosso

ILEO DI CAVIA: PRELIEVO DEL PREPARATO

34

35

Tracciato tipo: effetto di dosi crescenti di acetilcolina

su ileo di cavia isolato e perfuso secondo Magnus

36

Quali molecole si studiano con i preparati di

intestino (dosaggio qualitativo)

1. Agonisti e antagonisti colinergici

2. Agonisti e antagonisti dell’istamina e della

serotonina

3. Agonisti adrenergici

4. Bloccanti adrenergici

5. Oppioidi (morfina inibisce il release di ACh)