ESPERIENZE E RICERCHE

Influenza di un fattore legato alla figliata d'origine sulla regolazione del ciclo estrale nel ratto, e rapporti fra il tipo di ciclo estrale e l'andamento della sensibilità

a stimoli deciduogeni

CARLA ROSSI CARTONI e GIORGIO BIGNAMI

Laboratori di Chimica T erapeutica

Riassunto . - t statu osservato che i ratti a ciclo estrale di 4 giorni e quelli a ciclo di 5 giorni sono inegualmente distribuiti fra le figliate di fem­mine diverse. Tale reperto depone a favore dell 'esistenza di fattori gen etici o materni che contribuiscono a determinare il tipo di ciclo estrale osservato nella femmina adulta.

Le esperienze sulla decidualizzazione, condotte sugli st essi animali, hanno indicato che la normale riduzione, dal 40 al 5° giorno di pseudogravidanza, della sensibilità dell'endometrio agli stimoli è addirittura più marcata nei ratti a ciclo di 5 giorni che in quelli a ciclo di 4 giorni. Pertanto appare improbabile che la poussée di estrogeni responsabili della sensibilità agli stimoli rappresenti nel ratto a ciclo di 5 giorni una p er sist enza del normale ciclo follicolare.

Non si è potuta eseguire un ' analisi accurata degli effetti delle figliate sulla decidualizzazione, poichè pochi animali di ciascuna figliata sono stati traumatizzati al momento della massima sensibilità dell'endometrio. Tut­tavia differenze fra ceppi dell'entità della decidualizzazione sono st a te de­scritte da DE FEo (1963), e ripetutamente da noi osservate in due diversi ceppi derivati dai Wistar mantenuti separatamente nel nostro Istituto.

Summary (Litter effects o n the regulation of the oestrus cycle in the rat. Rela­tionships between type of cycle and uterine sensitivity to deciduogenic stimuli) . ­Observations on 53 Wistar albino rats, coming from 7 litters with 7 or more females each, showed that animals with 4-day and 5-day oestrus cycles were unequally distributed among the litters (Table l) . While it is known that the presence or absence of cyclicity in the hypothalamo-pituitary complex is determined by the absence or presence of androgen during a criticai period, the significant litter effect on cycle duration suggest s that genetic and/or maternal influences may determine the type of cycle observed in adult females .

. 111n. Jst. Su per .• 'ianilà ( 1067 ) 3 . 135· 148.

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34 out of tlw 36 rats with regular 4-day cyclt>i'< and lO oul of the 15 rati'< with regular 5-day cyclt"S wt•rt· u sPd fo r experimt> nts on decidu alization . Tlw 5-ua y cycle rat~< ust'd had onl' day of pro-oestru s, l day of fu ll kt>ra tini­zation and 3 tlays of dioPstrus . P seudoprt'gnancy was indueed by gla!'s-rod stimulation o n the morning in which full kPratinization was obst·rved, and tht· ut eri wen· traumatized eitlwr 96 or l 20 hours latcr. Thl' wt•ight of tht• traumatizcu a nd non-traurnatized horns and t ht· carbon ic anhyd rase contt·ut of thc traumatized horns were mt·asurt>d 96 hours aftcr traumatization . Tht· data (Table 2) showcd that the norma! dt·clin t• in st·nsitivity to deciduoma­inducing stimuli , occurri11.g hetween day 4 and day 5 of pscudopregnancy. was f'Yen mon· markeù in r ats with 5-day cycles than in r a ts with 4-day cy­cles . lt has bl't·n suggcsted that thl· Ot'Strogt·n secn•tion during pseudopre­gna ncy, whi ch allows tht· devclopmcnt of a high cndo metria l scnsitivity to Ùt•ciduoma-inducing stimuli , is dut• to a persistenct• of follicu lar cych·s (SiiE­LE NYAK & KRAICE R, 1960; S II EJ, ESNYAK , KRAICEll & ZEILMAKER, 1963). Sinct> tlw intt"rval bctwct·n thc rist• in oestrogen lt•vt·ls a nd pro-oestrus and ovulation set•ms to bt• longer iu 5-tlay than in 4-day cycle rats (EvEHETT, ] 961 ; 1964 ; A RON Pl al ., 1965) , a persistcn ct• of the cyclt•s might sti li account for a peak of utcrine SPnsitiv ity on tht· day bcfort' thP missetl vagina! pro­ot•stru s in 5-clay cyclt· animals (insteatl than on tlw ùay of tlw missctl pro­oestrus a s in 4-day cyclt· anirnals). HowPver , tlw fact that t ht• Ùt·crcmt•nl in sen sitivity obser\'Ctl on the following day was la rgrr in 5-day than in 4-tlay cyciP rats cannot he explaint,d on the samt• basis. lt must bi' pointed out that, although t he difl'e ren cc in utcrirw weight as betwet•n thc two sub-groupi' of animal s traumatized on day S was statistically significa nt, t ht• numlH'r of 5-day cycle rats was small. Part of the diA'crence migh t lw ascribcd t o t lw fa ct t ha t 5 -day cycle animals tend to form smaller d t•eiduomata, evcn wlw n tllt' dcciduogt·nic stimu lus is a pplicated at t h t> time of maximal s1•nsitivity.

An anal ysis of t he litter efl'ecl on decidualizatio n was not possible in the prescn t study, sincr too fcw animals in each litter were traumatizcd a t tlw timc of thc m axi mal sensitivity. Howt·vcr, strain di fferences in t he size of dt•ciduom ata wen· reporti'Ù by D EFEO (J 963). Simil ar ùifl'er cnces ha ve been r epeatedly obscrvcd betwt•en two separate Wis tar-ùeri ved strains main­tain eù at t ht• I stituto Superiore di Sanità. Thest• da ta suggest that mon· ex­tt•nsivc in vestigation s should bt· carrif'tl out to asst•ss tlw rolt· of genf'tit· and ma tl'mal factors ou tlt•cidualiza t io n.

I TRODUZJON E

Numerose ricerclw sono stat e condotte pt•r analizzare le possibili caust· della variabilità indi vidualr che si manifesta nei diversi fenomeni attin enti alla riprotlu;o:ioll t' n ei mammifr-ri. I fattori gt·rwtiei t• qut•ll i m att·rni t~d am llit·ll ·

ROSSI CA RTO N I E BIGNAMI 137

tali precoci rivf>stono particolare interesse per un duplice motivo. Innanzi tutto la loro comprensione è necessaria per meglio precisare i fattori endo­erinologici e fisiologici di maggiore rilevanza. Inoltre essa ha un fine pratico c ~ metodologico, permettendo sia u.na migliore standardizzazione del mate­riale sperimentale, sia lo studio sist ematico delle possibili in terazioni con altre cause di variazione.

~ stato chiaramente dimostra to come fattori genetici abbiano un peso notevole nel determinare il livello di fertilità in varie specie di mammiferi (HAMMOND, 1952; HoLLANDER, 1960; FALCONER, 1960; NALBANoov, 1963) anche senza considerare i numerosi processi patologici che possono essere provocati nella madre o n el feto da singoli geni r ecessivi. Numerose esperienze hanno dimostra to che questo controllo si esercita a livelli assai diversi, ed a ttraverso meccanismi di trasmissione almeno in parte separati fra loro . In particolare, sono state attribuite a fa t tori genetici variazioni del comporta­mento sessuale (VALENSTEIN, R1ss & YOUNG, 1954; FoWLER & EowARDS, 1960; WnALEN, 1961; McG>ILL, 1962; MAI NARDI, Scuoo & BARBIERI, 1965), della morfologia c fisio logia dei gameti maschili e femminili (BRADEN, 1960), della sensibilità ovarica agli ormoni gonadotropi ipofisari (FowLER & Eo­WARDS, 1960 ; McLAREN, 1962; EowAnos, WJLSON & FowLER, 1963; SAKIZ & GUILLEMIN, 1963; KoED & HAMBURGE R, 1965), del numero di uova liberate al momento dell'ovulazione (FowLER & EDWARDS, 1960; McLAREN, 1962 ; liAFEz & RAJAKOVSKI, 1964), della sensibilità dell' utero agli ormoni ovarici (DRA­SHER, 1955), della frequenza con cui la inseminazione porta al concepimento c·Ù a l regolare impianto dell'uovo fecondato (FAINSTAT, 1951; FowLER & Eo wAHDS, 1960), delle perdite di blastocisti, di embrioni c di feti (FEKETE, 1947; HoLLANDER & STRONG, 1950 ; FowLER & EowAuos, 1960 ; EowAnos, WILSON & FowLER, L963; HAFEZ & RAJAKOWSKI, 1964; HAFEz, 1965) ed infine del comportamento materno e delle prestazioni fornite nel corso del­l'a llattamento (Ross et al., 1963 ; YouNG, LEGATES & fARTHING , 1965). È pf'rciò comprensibile che esistano notevoli differenze di ferti lità fr a diversi ceppi o diverse popolazioni naturali della s tessa specie, e come i livelli Ji ff>r­ti lità possano essere rapidamente modificati per mezzo dPlla selezione arti­ficiale (FALCONER, 1960).

Si trovano inoltre in letteratura delle analisi, troppo numerose per essere mf'nzionat e individualmente, dei fattori materni od ambientali precoci, pre­t' post-nat ali, che influenzano i processi rip roduttivi . ~ da notare che, per potPr operare una distinzione fra influenze genetiche cd influf'nze materne prc- <' post-natali, occorre in genere cont.lurre varie esperic•nze che possono c·sscre assai laboriose : studio delle correlazioni fra figli dello stesso ripro­duttorf' ma di madri diver se (halfsibs); trapianti di ovaio o t rasferimento eli blastocisti da un animale all'altro ; sca mbio alla nascita dci piccoli di madri diver se (cross-Jostering); vari tipi di incroci fra cC'ppi; t>d infine self'zionc

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13H ES Pt:Rl:t:NZE E RI CERC HE

artificia le, possibilmt·nte bidirezionalt· e con m antenimento di una o più popolazioni di controllo. P ertanto, ai fini pratici delle indagini fisiologiche, cndocrinologiche e farmacologiche, si è fatto spesso r icorso all'analisi dl'll t· correlazioni fra soggl'tti df'lla stessa figliata. Talt• analisi fornisct' una misura globali' delle influenze geneti che t' di quelle materne pre- e post-nata li, senza permt ttere di operare una distinzione più fin e. Dal punto di v ist a pratico, t'SSa permett e di utilizzare gli schemi di analisi dell a varianza a blocchi ran­domizzati, assai Yantaggiosi ove una parte sost anziale della variabilità possa essere ascritta all'effetto d1•i blocchi. Ad esempio, un 'esperienza a blocchi randomizzati sugli effetti dell 'estrone nel ratto ovariectomizzato ha dimo­strato un efff'tto significativo delle figliate (indipendenti dalla successione) sull l' m odificazioni del peso uterino (Bu RN, FINNEY & GooowiN, 1950). Tale procedimt•nto , generalmente indicato com<' split-litter technique, è stato successivamentt• raccomandato per le espcrien zP di endocrino logia in gent'­rale (MANDL, 1955) e spesso usato nel nostro laboratorio sia ai fini dello studio degli di'etti di farma ci ed ormoni sul comportamento del ratto (BIGNAM I, 1962 ; 1964; BovET, BIGNAMI & RoBUSTELLI , 1963), sia comt• punto di par­tenza p er una esperienza di selezion e artificiale bidirezionale nel campo della genetica del comportamt'nto (BIGNAMI, 1965 ; BIGNAMI & BoVET, 1965) .

Le esperif'nze riportate nel presente lavoro rappresentano un primo t en­tativo di analizzare nel ratto le variazioni del ciclo estrale, della pseudogra­vidanza t' del deciduoma sperimentale in funzione delle figliate d ' origine degli animali utilizzati. Allo stesso tempo sono st atf' compiut(' osservazioni sull'an­damento in funzion e del t empo della sensibilità a llo stimolo che provoca lu decidualizzazionc, in rapporto con il tipo di ciclo osser vato nei vari animali .

MATERIALI E METODI

P er le esperien ze sono state usat e delle figliat e di ratti Wistar albini, nate ed allevate nel nostro I stituto, contenenti ciascuna almeno 7 animali di sesso femminile. Il numero totale degli animali allevati dalle singole madri era compreso fra lO e 12. F ra le figliate con 7 o più femmine messe a nostra d isposi1.ione ne sono state presceltt• 7, in modo ch e la massima differenza di età fra gli animali sp erimentali non superasse i sei giorni. Pertanto, essendo gli animali allevati simultancamentt' nello stesso ambiente, curati dallo stesso inserviente c sottoposti agli stessi procedimenti sperimentali , essi differivano fra loro unica mente per la figliata d 'origine. All'età di 124-130 g iorni si è iniziato a prelevare quotidianamente lo strisco vaginale. Inoltre, per ogni ratto, è stato registrato il peso corporeo : a) al mattino dell'estro (cherati­nizzazione vaginale compl<'t a) in almeno due cicli consecutivi prima dell' in­du?.ione della pseudogravidanza; b) al mattino del giorno della traumati1.-7.azionc ; c) al mattino del giorno dell'aut opsia. Dopo l'osservazione di almeno

AtuL l sl . .Suprr. Sanil t\ ( 196i) 3. 135 · 148.

ROSSI CARTONI E BIGNAMI 139

tre cicli a durata costante si è proceduto alla stimolazione meccanica mediante bacchetta di vetro delle pareti della vagina e del collo uterino al mattino dell'estro, onde provocare la pseudogravidanza. Si è quindi eseguita una lapa­ratomia in anestesia eterea per la traumatizzazione di uno dei corni uterini, al 40 giorno di pseudogravidanza (96 ore dopo l'estro) in una parte degli ani­mali di ciascuna figliata, ed al so giorno {120 ore dopo l'estro) nei rimanenti. Per la traumatizzazione un ago da iniezione endovenosa N. 2, dalla punta leggermente smussata ed incurvata verso l'esterno, è stato inserito nel lume uterino al livello dell'estremità ova.rica. La punta dell'ago è stata sospinta sino all'estremità cervicale, e quindi riportata indietro, esercitando contem­poraneamente una leggera pressione sull'endometrio dal lato opposto a quello del mesometrio. 96 ore dopo la traumatizzazione, e cioè all'8° o rispet­tivamente al 9o giorno di pseudogravidanza, i ratti sono stati sacrificati e si sono prelevati e p esati i due corni dell 'utero . Si è quindi proceduto alla misu­razione della attività carbonidrasica nel tessuto omogeneizzato del corno uterino precedentemente sott~posto a traumatizzazione, secondo il metodo manometrico modificato da ÙGAWA & PINCUS {1960) ed applicato all'utero ùi ratto da BIALY & PINCUS (1960) . Tale metodo si basa sulla liberazione di C01 nell'apparecchio di Warburg, e l'unità enzimatica viene arbitrariamente definita mediante una curva standard costruita in base ad una preparazione purificata di carboanidrasi di eritrociti bovini {l). Un andamento rettilineo si osserva per attività enzimatiche comprese fra 0,2 e 1,5 unità per 0,2 ml, che, usando una diluizione 1/10 dell'omogenato, corrispondono a 10-75 unità per grammo di tessuto. Come in altre ricerche precedentemente condotte nel nostro laboratorio, l'attività carboanidrasica è stata misurata poichè t·ssa aumenta sensibilmente nell'utero del ratto soltanto in seguito alla deci­dualizzazione dell'endometrio (JoHNSON, LUTWAK-MANN & SHELESNYAK, l 959; Rossr CARTONI & BIGNAMI, 1966).

RIS ULTATI

Dalle osservazioni sulla regolarità e sulla durata del ciclo estrale, ripor­tate nella Tab. l, è apparso chiaramente che la distribuzione degli animali a ciclo di 4 giorni ed a ciclo di 5 giorni fra le varie figliate non era omogenea. L'analisi della varianza condotta sulla durata del ciclo nei vari animali ha ùimos trato un effetto significativo delle figliate d'origine (quadrati medi: 0,6617 tra figliate, 0,1757 entro figliate; F: 3,766; g.l.: 6 e 46; P < 0,005). [l valore di xl è stato calcolato per una tabella 7 x 2 (m = figliate; n = ciclo di 4 giorni o ciclo di 5 giorni) dopo l'eliminazione dei due ratti a ciclo

(l) Prodotta dai K. & K Laboratories, Jarnuirn, N. Y., USA .

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140 E~I'E RIENZE •: RICERC II•

irregolare (z2 = 19,98 ; 6 g .l.; p < 0,005) . Ancht· se nel nostro caso l t· fn·­quenzc osservat e ed attese sono molto basse in al cune combinazioni , il mt·­todo del z2 dà ugualmen tf• una buona approssimazione dato cht• i wadi di liucrtà soro più di 2 (CAVALt.l -SF'oRZA, 1955).

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Dist ribuzione fra le varie figliate del ratti con ciclo estrale di 4 o 5 giorni.

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L' analisi di vananza sui valori del peso corporeo ha anche essa dimo­strato un effetto significativo delle figliate di origine (quadrati m edi: 1462,3 tra figliate, l 76,1 entro figliate; F: 8,3; g.l. 6 c 46; p < 0 ,001).

La Tab . 2 contiene un sommario dei dati riguardanti il peso dci corni uterini traumatizzati c non traumatizzati (in valori assoluti ed in valori rife­r iti al peso corporeo) e della attività carboanidrasica nei corni uterini trau­matizzati . Dei 36 ratti a ciclo di 4 giorni uno ha presentato una ricomparsa precoce dell 'estro dopo la traumatizzazione, cd un altro è morto dopo la lapara tomia. P ertanto questi due animali non sono stati inclusi nella Tau. 2. Anche 5 dei 15 ratti a ciclo di 5 giorni sono stati scartati ai fini dellf• espe­rienze sulla decidualizzazionc. Infatti, pur essendo regolare la durata del ciclo in questi 5 animali - tanto da pcrmctterne la utilizzazione ai fini della analisi di cui nella Tab. l - essi presentavano un'alternanza di due tipi di ciclo di 5 giorni , e cioè: a) un giorno di proestro (cellule epiteliali nuclcat c), un giorno di estro (cheratinizzazione completa) c tre giorni di diestro (preva­lenza di leucociti) ; b) un giorno di proest ro, due giorni di estro c due giorni di dies tro. Dato che n ella Tab . 2 gli animali sono stati classificati a st'con da

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142 ESPERIENZE E RICE RCHI·.

del tipo di ciclo t'Stralc cd a st>conda dclrintnvallo fra cht·ratinizzaziont· "<t!!i­nalc c traumatizzazione, sono stati considerati quegli a nimali nei quali la durata della cheratinizzazione vaginalt- rimaneva costantt· da ciclo a ciclo . Occorrt' infine ricordare che non si sono osservati ratti ch t' presentassero regolarrnente un ciclo di S giorni con un giorno di prot·stro c due giorni di estro. Pertanto l'esperienza da noi est>guita non può fornire indi cazioni su questo tipo di animali .

I dati della Tab. 2 indicano chl' il pt·Ao mt·dio dt·i corni traumatizzati è sempre significativamente inferiore nei gruppi operati al S0 giorno rispetto a quelli operati al 4° giorno. L ' ispezione dci singoli dati ha mostrato che tal t· riduzione è dovuta sia al fatto che in alcuni casi non si sono sviluppati dcci­duomi (macroscopicamcnte visibili), sia al minori' sviluppo del dcciduoma negli altri casi. Inoltre, anche n t•i casi in cui la dccidualizzazione è sufficien LI'

ai fini della determinazione dell ' a ttività carboanidrasica (cioè in 14 animali su 19 operati al so giorno), l' attività en zimatica è significati vamente infcriorl' a quella riscontrata nei ratti operati al 4° g iorno.

Occorre anche notare che, a parità di giorn o di traumatizzazione, i pt·si m edi dei corni uterini traumatizzati t endono ad essere minori nei ratti a ciclo di S giorni rispetto a quelli a ciclo di 4 gio rni . Anche per il piccolo nu­m ero di animali a ciclo di S giorni, tale differenza è risultata statisticam entt· significativa in uno solo dci confronti, c cioè quello fra ratti a ciclo di 4 giorni traumatizzati al S0 giorno c ratti a ciclo di S giorni traumatizzati al 5° giorno.

Il peso m edio dci corni utcrini non traumatizzati è risultato esscrl' licvt·­mcnte maggiore negli a nimali a ciclo di 4 giorni rispetto a quelli a ciclo d i S giorni, sia nei gruppi traumatizzati al 40 giorno di pscudogravidanza che in quelli traumatizzati 24 ore più tardi. Una diH'erenza più marcata è apparsa fra i ratti traumatizzati al S0 giorno (che presentavano corni non traumatiz­zati di m aggiore peso) e quelli traumatizzati al 40 giorno. Tale differenza è risultata essere significativa per i valori riferiti al peso corporeo, sia per i soli ratti a ciclo di 4 giorni, sia per tutti gli anim ali.

DISCU!'SJO E

I risultati delle esperienze qui riportate forniscono indicazioni u tili alla comprensione dei fattori che regolano la durata del ciclo estrali' e le mo­dalità della decidualizzazione dell'endometrio nel r atto.

Le differenze di sviluppo della r eazione dl'cidualc in rapporto al mo­m ento in cui vien e eseguita la traumatizzazionc con fermano i dati della let­t eratura sulla notevole diminuzione di sensibilità dell'endometrio tra il 4° ed il so giorno della pscudogravidanza (KRAICER & SHELESNYAK, 19S9; D EFEO, 1963) . I dati da noi raccolti indicano che tal(' riduzione è assai evi-

Ami. Jsl. S1tper. Sanit<i (1967) 3, 136· 148.

ROSSI CARTONI E BIGNAMI 143

dente anche nelle misure di attività carboanidrasica del tessuto uterino. Si è osservato inoltre che la riduzione di sensibilità fra il 4° ed il S0 giorno di pseudogravidanza è addirittura più marcata nei ratti a ciclo di 5 giorni che nei ratti a ciclo di 4 giorni. Tale reperto va discusso alla luce delle ipotesi sinora proposte per spiegare la brusca comparsa e la breve durata della sensi­bilità dell'endometrio agli stimoli che possono indurre la decidualizzazione. La maggior parte degli autori è oggi d 'accordo sul fatto che tale fenomeno sia legato alla secrezione di estrogeno, in aggiunta a. quella di progest erone che predomina durante la gravidanza e la pseudogravidanza (v. le varie rassegne in ENDERS, 1g63). Tuttavia le modalità secondo le quali avviene questa secrezione supplementare di estrogeno non sono ancora del tutto chiarite (SHELESNYAK & KRAICER, 1g60; SHELESNYAK, KRAICER & ZEIL­MAKER, 1g63; YocniM & DEFEo, 1g63; BITTO N, V ASSENT & Psvcuovos, 1g65; Rossi CARTONI & BIGNAMI, 1g66). Shelesnyak e coli. (SaELESNYAK & KRAICER, 1960; SnELESNYAK, KRAICER & ZEILMAKER, 1g63) hanno sugge­rito che l'andamento dell~ poussée estrogenica, che determina la sensihiliz­zazione agli stimoli deciduogeni in corso di gravidanza e di pseudogravi­danza, ripeta l'andamento della poussée estrogenica che si verifica in ogni ciclo estrale. In tal caso, però, il periodo di massima sensibilità dell'endo­metrio dovrebbe apparire più tardivamente nei ratti a ciclo di S giorni ri­spetto a quelli a ciclo di 4 giorni. Invece il confronto da noi eseguito indica che, dopo il 4° giorno di pseudogravidanza, la sensibilità dell'endometrio decresce addirittura più rapidamente nei ratti a ciclo di S giorni che non in quelli a ciclo di 4 giorni. Inoltre in vari laboratori si adopera comunemente lo st esso intervallo di g6 ore (fra l'induzione della pseudogravidanza al mo­mento dell'estro e l'applicazione dello stimolo che avvia la decidualizzazione) nei due tipi animali.

Le differenze fra i pesi medi dei corni uterini non traumatizzati nei gruppi operati rispettivamente al 4° ed al 5° giorno possono essere spiegate tenendo conto dei seguenti fattori. I ratti operati al 40 e quelli operati al so giorno si trovavano al momento dell'autopsia rispettivamente all'B0 ed al go giorno della pseudogravidanza. Inoltre i corni uterini traumatizzati al 4° giorno presentavano un grado di decidualizzazione assai maggiore, ed è noto che lo sviluppo di una voluminosa reazione deciduale tende di per sè a prolungare la pseudogravidanza. Ambedue questi fattori hanno probabil­mente contribuito a far sì che nei ratti sacrificati all'Bo giorno non fosse ancora iniziata la ripresa della secrezione di es trogeni che si verifica alla fine della pseudogravidanza. È possibile invece che tale ripresa fosse già iniziata, almeno in una parte degli animali sacrificati al go giorno, specialmente quando la decidualizzazione mancava od era assai scarsa. In effetti è stato riportato che in ratti del ceppo Holtzman-Sprague-Dawley il peso dell' utero, in assenza di decidualizzazione, risale al go giorno lievemente al di sopra (cd al 10o

. t nn. / s i . .'ittJICr. Sanità ( 1!167 ) 3 , 135·148 .

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giorno nettamcntl' al di sopra) tlci minimi usservabili nel corso della pseudo ­gravidanza (DEFEo, 1963). Un aumento del genere, forse lil'vt·men tc piì1 precoce nel ceppo da noi adoperato, sarebb t: già sufficiente a spiega re le difl'e­r enze osservate.

Le analisi condotte 1wr misura rt• l'eAetto delle tigliate d 'origine sul ciclo t•strale permettono alcune conclusioni preliminari non prive di interesse. La significatività statistica dell 'effetto sul peso corporeo degli animali conferma i dati della letteratura sulle influenze gen etiche c materne sulla cresci ta (Goo­DALE , 1938 ; M cARTH UR, 1949 ; FALcONEH, 1953; ]INKs & BnoAoH u RsT,

1963). Inoltre essa sembra indicare che il campione da noi utili:r.zat o fossi' appropriato ai fini di questo tipo di indagini.

I dati da noi raccolti suggeriscono l'esis tenza di fattori genet1c1 o ma­t erni , che contribuiscono a determinare il tipo di ciclo estrale che compan· più tardi. Questo reperto va considerato insieme ai dati della letteratura sulla determinazione stabile delle caratteristiche funzionali del complesso ipotala­mico-ipofisario n elle fasi precoci dello sviluppo dell 'organismo. In tale periodo la presenza o assenza di ormoni sessuali maschili determina rispettivamentl' la futura assenza o presenza di un ritmo ciclico di tipo ff'mminile (PFEIFFEH, 1936 ; BAHRACLOUGH, 1961; BARRACLOUG tl & GonsKI, 1961; HARRIS & LEVINE, 1962). Vari dati concorrono a dimostrare che la regolarità e la durata di questi cicli sono in parte sotto controllo genetico, oltre che sotto il con­trollo di influenze ambientali. Si possono menzionare ad escompio le nott•voli differenze tra popolazioni naturali {' ceppi mantenuti a lungo in cattività, confermate ripetutamentc sia in specie caratterizzate da ovulazione spon­tanea, sia in specie iu cui l'ovulazione avviene di r egola dopo il coito . In quasi tutti i ceppi di ratti allevati per usi di laboratorio si osserva una grande mag· gioranza di animali a ciclo r egolan• di 4 giorni, un numero minore di animali a ciclo r egolare di 5 giorni (parte con un giorno e parte con due giorni di cheratinizzazione completa) ed infine una minoranza, spesso trascurabile, di

' animali a ciclo più lungo od irregolare.

I dati raccolti da EvERETT (1961; 1964) e da AnoN et al. (1965) indicano che l' intervallo intercorrente fra la ripresa ddla secrezione di estrogeni t'

l'attivazione del m eccanismo che prc·sicdc alla libcrazion<' di LH (e quindi alla ovulazione) sia più lungo n ei ratti a ciclo di 5 giorni che in quelli a ciclo di 4 giorni. In altre parole, la maggior durata del ciclo sarebbe da attribuire non tanto (o non soltanto) ad un ritardo nell' inizio della poussée FSH, m a ad un suo svolgimento più graduale, o ad una minore sen sibilità dei follicoli ovarici, o ad una minore sen sibilità del meccanismo ncuro-ormonalc che prt•· siede alla liberazione di LH. L'uno o l'altro dei primi due fenomeni porte· r cbbe ad un ritardo nella maturazione dei follicoli c ad un più lento aumento dei tassi di estrogeno, provocando in via secondaria un ritardo di 24 ore della scarica di LH. Occorre però ricordare che alcuni dei ratti a ciclo di 5 giorni

Atlll. l sl. !:illJJfr. Su><ilrì ( 1!107 ) 3, l:l5 · 148.

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uvulano tra il l 0 cd il 2.0 giorno della cheratinizzazione vagina le (cioè dopo l(Uasi 48 ore daJia scomparsa dei leucociti dallo striscio), anzichè nella notte fra proestro ed estro vagina le. In questi casi è difficil<· non pensare ad una mi­nore sensibilità dei meccanismi che presiedono alla librrazione deii 'LH.

Ai fini della comprensione dei vari mecca1ùsmi di feed-back negativi c

positivi che presiedono a lla regolazione del ciclo può essere assai utile inve­stigare le cause della variabilità residua nei ceppi di animali addomesticati, a pparentemente mm1ma ma tuttavia corris pondente a profonde differenze fi siologiche. Ovviamente l' indirizzo da noi seguito, pur avendo fornito utili indicazioni , non sembra poter essere usato sistematicamente a questo fine, per la relativa rarità con la q uale compaiono figliate composte quasi rsclusi­' amente di ratti a ciclo di 5 giorni. Più utilmente potranno essere sfru ttate differen ze fra ceppi, di cui si trovano occasionalmente cenni in letteratura (ZEIL!\1AKER, 1966), eventualmente dett>rminando una separazione più netta mediante la selrzione art ificiale bidirezionale .

I dati da noi raccoltt, non permettono un' analisi soddisfacente dell 'ef­fetto delle figliate sulla decidualizzazionc, dato che soltanto la metà degli animali (3-4 per fi gliata) è stata sottoposta a traumati:r.zazione al momr n to della massima sensibilità dell'endometrio. Occorre però ricordare che si pos­·ono osservare notevoli differenze di peso dei dcciduomi in ceppi Jivcr si di ratti ed in condizioni sperimentali identiche (DEFEO, 1963). Anche nel nostro laboratorio si sono notate differenze nell'entità della decidualizzazione in Jue ct>ppi di ra t t i d t>rivati dai Wistar, a llevati s<>paratamente nel nostro Isti tu to . Inoltre questi ceppi differiscono •tuanto a lla st>nsibilità ad agenti farmaco­logici che t•sereitano una influenza negativa neJle fasi [Jreeoci della gravi­danza (BovET-N ITTI & BIGNAMI, L962; BovET- NITTI, BIG AMI & BovET, 1963). Pertanto lo studio sist ematico delle influen ze genetiche e mat(•rne sulla decidu alizzazione rivestirebbe un notevole interessf•, tra ttandosi eli uno d f' i ff'nomeni critici nel de terminare il livello di fertilità nell' animale.

H ottobre 1966.

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Laboratori di Chimica Biologica, Centro fntPrnazionale di Chimica Microbiologica

Summary. - · The s~hesis and some properties of N-(9-~-D-ribofu­

ranosylpurin-6-yl)-L-aspartic acid 5'-monophosphate (adenylosuccinic acid) and of its diastereoisomer derived from D -aspartic acid are describeJ.

Riassunto. (Nucleotidi di micrMganismi . XIII. Sintesi dell'acido adeni­losuccinico). - Si descrive la sintesi dell'acido adenilosuccinico e del suo diastereoisomero derivato dall' acido D-aspartico, usando un metodo più semplice e rapido di quello finora descritto. La fosforilazione del derivato 2' ,3'-isopropilidenico della 6-clororibofuranosilpurina viene effettuata con 2-cianoetilfosfato anzichè con t etra-p-nitrofenilpirofosfato, evitando in tal modo il complesso procedimento di eliminazione dei gruppi p-nitrofenilici dal 6-clororiboside fosforilato; il gruppo 2-cianoetilico viene invece totalmente e facilmente rimosso durante la condensazione con acido aspartico a pH alcalino.

Si riportano inoltre i poteri rotatori dei due diastereoisomeri ; applicando il metodo delle differen ze delle rotazioni molecolari, si mette in eviden za che il contributo rotazionale della parte ribosidica è indipendente dalla natura del derivato purinico.

Adenylosuccinic acid, the 5'-rihotide of N-purin-6-yl-L-aspartic acid (I), was first ohtained by Carter and Cohen on incubation of fumarie acid with adenosine-5'-phosphate in the presence of an enzym e fraction purified from

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) For p aper XII, see DELFINI, C. & S. RuSSI, A nn. ! st. Super. Sanitd, l, 368-378 (1966).

(0 0

) Laboratorio di Chimica delle Sost anze Naturali, Istituto Chimico dell'Università, Napoli

. 11111 . l s l . .'luprr . .'lrrniNt ( 1!167 ) 3. 1 19· 11i6 .

ISO l::SP.E RI ENZE F. R!CERCIIF.

yeast autolysat es (CARTER & COHEN, 1956); it was then indepcndcntly isolated by Joklik from mammalian liver (JOKLIK, 1957) and by Ballio and Serlupi-Crrscenzi from thP mycelium of Pmicillium chr_ysogenum Thom (BALLIO & SERLUPI-CRESCEN­Zl , 1957). F urther report s on tlw occurrenct· in difl'erent organisms of t>ither tht' ribotide, thc riLoside or thc base havc appcared and t h e ro le of tlw ribotide as an intermediatt· in thc intercon version of inosine-5' -phosphatc an d adenosine-S ' -phos­phatc has Lcen demonstrated (CAR­TER & CottEN, 1956; LIEBERMAN, 1956).

' H

(l)

Adenylosuccinic a ciJ has been obtained in very high yield b y HAMPTON ( 1962) from 6-chloro-9-~-D-ribofuranosylpurint>-5' -phosphate. T he la tt t> r was prepared in only l 8 % yield from 6-chloro-9-(2' ,3' -0-isopropyliJent'­rj-D-ribofuranosyl)-purine by a ratncr trdious procedure· (HAMPTON & MAGUIRE, 1961) .

The desire to obtain both aden ylosuccinic acid and the diastereoiso­meric N -(9-~-D-ribofuranosylpurin -6-yl)-D-aspartic aci d 5' -monophosphatc necessary for other investigations, prompted a re-examination of thc syn­thesis. The present paper describes in detail the preparation of these com­pounds by a method which, as in Hampton's procedure, starts from the iso­propyliJcne derivative of 6-chloro-9-~-D-ribofuranosylpurine . Thc phos­phorylation is cfl'ect ed with 2-cyanoethyl phosphatt· and dicyclohexylcar­hodiimidc (TENER, 1961), instead of t etra-p-nitrophenylpyrophosphate, followed by condensation with eithcr D- or L- aspartic acid a t alkalinc p H . Under thesc conditions thc cyanoeth yl group is concurre~tly split off. Chro­matography frrst o n Dowex-50 H +, which hydrolyzes the isopropylidenl' group, then on Dowex-1 formate with gradient elution, affords a pure pro­duct in an overall yield of 31 %· The identity of synthetic adenylosuccinic acid and of its diast ereoisomer was ascertained through spectrophotomctric (Tablc l) and chemical analyses, and by paper chromatographic and electro­phoretic comparison with a n authentic samplc of adenylosuccinic acid iso­latcd from Penicillium chrysogenum (Table 2).

Thc optical rotations of both synthetic ribotides werc dct ermincd, and thc method of molccular rotation differenccs (BARTON &. J ONES, 1944; BARTON, 1945 ; KLYNE, 1950) applied (Tahle 3). D.[M] 0 valucs for t he two rihotides, wherc D.[M] 0 = [M] n of ribotidc - [M]0 of corresponding purine base, are comparablc with [M]u of adenosine-S' -monophosphate, thus demon­strating that t hc rot ationaJ contrihution of thc carbohy dratt• componcn t Ì R

Au11 . l sl . 8U)Jfr . .Sflniil\ (l9(ii) 3 . 149 - l !ili.

, i

Comparison purin-6-y

• Penlclll

~-·

N-(9-[:l-U-ril 5'-monop

-(9-[j-D-ril

5'-monop

Adenylosuco ch ry&ogem

Comparison • reolsome• those of

('

N-(9-[j-D-til L-asparlio

p ha te

N-(9-~-D-ril D-asparl̕ p h ate

Adenylosuc1 nicilli um

• on1 towa.rc

independent in the case (BALJ,IO, BA

(l ) On int 118partic acids o diastereoisome values of aden• vely - 165°, - 1

ly io m

2

r

BALLIO E DI VITTORIO 151

TABLE l.

Comparlson of the spectnl propertles of the dlutereolsomerlc N-(9-~·D-rlbofuranosyl­purln-6-yl)·aspartlc acJd 5'-monophosphates wlth those of adenylosucclnlc acld from • Penlcllllum chrysogenum •·

l Compound l Àmax l Àmin

Acldlc !Neutrali ~l~:· l Acldlc l Neutrali "'l!:·

N -(9-~-D-ribofuranosyl-6-y l )·L·uspartic aci d S'-monophosphate. 267 269 269 23S 234 233

N -(9-~-D-ribofuranosyl-6-y l )·D·aspartic aci d S' ·monopbosphate . 267 269 269 23S 233 233

Adenylosuccinic aci d from Penicillium

chry&ogenum 267 267 269 234 ?.33 234

TABLE 2.

Comparlson of the paper chromatographlc and electrophoretlc mobllltles of tbe dlaste­reolsomerlc N-(9-~·D-rlbofuranosylpurln-6-yl)-aspartlc acld 5'-monophosphates wlth those of adenylosucclnlc acld from • Penlcllllum chrysogenum •.

-Co mpound l Cbromatographlc mobUitles (RF) l F. l ectropboreslll •

Solvent (a)!Solvent (b) ISolvcnt (c) N-(9-~-D-dbofuranosylpurin-6-yl)-

L-aspartic aci d S'·monophos· p ha te 0.23 0.31 0.23 9 . 9

N-(9-~-D-ribofuranosylpurin-6-yl)·

D-aspartic ucid S' -monophos· phate 0 .23 0.32 0.23 9 . 9

Adenylosuccinic aci d from P e-

nicillium chry&ogenum 0.22 0.31 0.23 9.9

• cm towarde tbe anode In l hour aud 20 volts/cm nt p H 4.7.

independent from the nature of the purine component. A similar conclusion in the case of adenosinesuccinic acid (l) was reached in a previous paper (BALLIO, BARCELLONA & DI VrrTORIO, 1963).

(l) On introducing the new [<(o values determined for the enantiomeric N-purin-6-yl­aspartic acida (see Tahle 3), 6.lMJo at pH 7.0 for adenosinesuccinic acid is - 184° and for the diastereoisomer derived Crom D-aspartic acid is - 18S0. Tbese 6gures compare well with LM]o values of adenosine, its N1-monomethyl· and its N•-dimethylderivative, which are respecti­vely - 16So, - ISSo and - 1730,

A1111. / st. Super. Sani/d ( 1967) 3 . 149 · 156 .

152 F.SI>Eni ENZE E III CE RCIII :

T~U I.E :l.

Comparison of dilference ( t1 1 M In ) between molecular rotatlons of the dlastereoisome· ne adenylosuccinic acids and enantiomeric N-purin-6-yl-aspartic acids wlth the m o­lecular rotation of adenosine-5'-monophosphate.

( ' o fil p o Il 11 d

N- (9- (:1-D-rihofuruuosylpuriu-(>-~ I)- l .-aspartie acid 5' -monophosphut t· . .. . . . . .

"\ -(9-~-D-ri !Jofuru uos y l puri u-(o- yl )-D-aspa rti t•

ac i d :i ' -II>Onopho~phutt' . . .

:\ -purin-6-y i-L-usp a r1ir ar·itl ••

N-purin -1\-yi-D-aspartit· ur id • •

Arle nosin t>· 5' -nwnophosphut r . .

, .. ( 0

11 in U4j11l•OI1~

I'IUIHt iOfl

"" i.ll )

l .04.

l . 15

0.51

0. 54

O .R(>

l ~• In

- :1.4" - 15 . 7° l i0 . 70

- 77 .3°\ - .157 . i" - 200 . 6"

f- (>I .R"i -l JS.i . 011

- C.2 . 611 157 . 111

• Conrentrntion >< werc' d t>t crnoiuet:l spcetrophntonoctrirall~ ond n re rl'ferrrd to un h~·

d rous products . Tlw molar cx tinr ti on corfli c ir·nt• reportt·d und <·r ,. Methml• » wt•rt• u~l'd for th r rulculntion".

• • F ij!ures hrrein rcportcd difl"t'r front 1 host' puhlishcd in n prt' ' Ìtll" pupcr (H~ LLIO.

B~no:LJ.ON~ & D1 V ITTORIO. 1963). lt wa~ in fuct no t cò tha t ho1 dryinJ~ hring~ ahou1 n par­tiul r acl'mizution ; tlwrr forc optical rotation ~ werr rl ctc rnoinrd on fr eshl) p rcpurt>d surnples

dried in v11cu" wit hou1 heatin)!. At pH 1.0 Il!'\\ joc]ff nnd I M "n valut'' \\ l'TI' respt•eti vel)

l 33.3" unrl , 113.6" fo r thl' L·enantio mrr. antl - 3:1.11" un1l fi2 .R" for 1111' D-r nuu1iom <'r .

J.:XPEHIM ENTAI .

Ma.terials. - All solvents and rcagcnts werc from C. Erba (Italy), ana­ly tical gradc, with the ex ception of L-aspartic acid a n d adenosin e-S' -mono­phosphatc, purchascd from HofTmann-La Roche (Switzcrland), di eyclolw­xylcarbodiimide from Fluka A. G. (Switzcrland ), D-aspartic aci d an d 2-cya­noethyl phosphatc (barium salt monohydrate) obtained from th1· Californi a Corpora ti o n for Biochemical Hcsearch (U .S.A.), an d inosine from th<' N utri­tional Bioehcmicals Corpora tion (U .S.A.). The stock solution of eyano{'thyl phosphate in pyridint' ( l mmolc/ml) was prcparcd b y the mcthod of T E NE H

(1961) . Ion cxchangcrs wcrc from Fluka A. G. (Switzerland). Dowcx l X 8 (200-400 m csh) was prcparcd in tbc format{' form by tbc m cthod of Hurlbr rt (HURLBE RT et al. , 1954). Dow(•x 50W X 4· (100-200 mcsh) was prepared in tlw H 1 form , aftcr rccycling through the Na ·i form . 6-chloro-9-~-D-ribofu­

ranosylpurinc was synthcsizcd from 2~,3 ',5'-tri-0-acctylinosinc (BRE DERECK

& MAHTJ N J, 1947) as dt'~crihcd by Z E MLJ CKA & SonM (J 965) with thl' followin p;

A nn. / ."41. S II JJt' l'. ·"''(u li lir ( JUfi i) 3 . J I H· l td: .

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DALLIO E 01 VITTORIO 153

modifications: the chlorination reagent dimethylchloromethyleneammonium chloride was generated in situ from thionyl chloride and dimethylformamide (three moles of thionyl chloride and two moles of dimethylformamide per mole of purine derivative were used), and refiuxing in chloroform was pro· tracted for · three hours in order to bring the reaction to completion . The overall yield was 80 %· 6-chloro-9-(2~3'-0-isopropylidene-~-D-ribofurlè

nosyl)-purine was made from 6-chloro-9-~-D-ribofuranosylpurine by the method of IIAMPTON & MAGUIRE (1961). An authentic sample of adenylo­succinic acid was prepared from Penicillium chrysogenum (BALLIO & SERLUPI· CRESCENZI, 1957).

Methods. - Spectrophotometric measurements were made with a Cary recording spectrophotometer model 11. The following molar extinction coefficiente were used: 19,900 for both adenylosuccinic acid and its diastè· reoisomer a t p H 7 .O; 17,800 for both the enantiomers of N-purin-6-yl-aspartic acid at pH l; 15,400 for adenosine-5'-monophosphate at pH 7.0. Paper chromatograms were run a t 25° t, by the descending method, on Whatman N. l paper, in the following solvent systems: (a) 1M ammonium acetate, pH 7.5- ethanol (30 :75), (b) 1M ammonium acetate, pH 3.8 • ethanol (30 :75), (c) isobutyric acid - l N ammonia (lO: 6). Paper electrophoresis was run on Whatman N. l paper in 0.05M ammonium acetate - acetic acid buffer, pH 4. 7, with a potential gradient of 20 volts/cm. Optical rotations were deter­mined with a Hilgher polarimeter (sodium lamp) in a 2 dm microtube. Ri­hose was determined with orcinol reagent (UMBREIT, BURRIS & STAUFFER, 1949) and total phosphorus with molybdate followed by reduction with stan­nous chloride (WEIL·MALBERBE & GREEN, 1951).

N-(9-~-D-ribofuranosylpurin-6-yl)-L-aspartic acid 5'-monophosphate (Ade­nylosuccinic acid) .

A solution of 114.3 mg of 6-chloro-9-(2~3'-0-isopropylidene-~·ribo­

furanosyl)-purine (0.35 mmoles) in 3.5 ml of pyridine and 1.4 ml of stock solution of cyanoethyl phosphate (1.4 mmoles) was concentrated to dryness in a rotatory evaporator at 300 C. The residue was taken up in 4 ml of py­ridine and again concentrated to dryness as before. The process was repeated twice more. The residue was then ta~n up in 4 ml of anhydrous pyridine and 700 mg of dicyclohexylcarbodiimide (about 3.4 mmoles) were added. After storage in a stoppered fiask for 23 h at room temperature, the electrophoretic analysis of the mixture showed an u.v. ahsorbing spot which moved in an hour (at 20V/cm) 5.2 cm towards the anode, whereas the starting compound moved 2.3 cm and adenylosuccinic acid 9.9 cm. One ml of water was added and the solution left 30' at room temperature. The mixture was then concen· trated to dryness at 300 C, the residue taken up in 8 ml of water and again

A11n. l sl. Supu. Sanità (1967) 3, 149· 156. 3

154. ESI'E Rl l:NZE E RICERCHE

concentrat etl to dryness, tbe prOCt>SS repeat ed onct· more, and finallv tht• rt·­sidue takcn up in 5 mi of wat er. To the suspension 140 m g of L-asparti r acid (1.05 mmoles) wcrt• added. The pH was adjusted to 9 .5 witb 1 ON po­tassium b ydroxidt· and thc solution heated to lOOo C. Thc p H was oftt·u controlled and kcpt at 9.5 by small additions of potassium hydroxi de. After 4 hours beating, paper chromatography with solvent syst em (a) showt>d only two spot s, tbe fa st er witb an u .v. spectrum identica} t o tha t o f inosine-5' -pbospbat c, and the slower to that of adenylosuccinic acid; the two com­pounds, which ga ve a negative reaction for cx-glycols (GoRuo , TnoRNBUHC & WERUM, 1956), are tbc 2~3 '-0-isopropylident• deri vati ves of tbt>se riho­tides. Thc mixtun was tben diluted witb water to lO mi , briefly boiled and fìltered tbrough a sintercd glass fìlter . Th!· solid was resuspcndctl in lO mi boiling water , fi ltered , and the proccss r cp ('ated once m ort· . Tht• combitwtl filtrates werc percolatcd throu gh a Dowex-50 H + column (1 cm in diamcter, 17 cm high), wbich was thcn washed witb water . F ractions of lO mi cach were collect ed. E ach fraction was scanned in the spcctrophotometer and the optical dcnsity at the wave length of thc absorption maximum plotted against fraction number {F ig. l) .

120

100

80

E

~ 40

20

o 12 Fract ion number

16

F ig. l . - E lution from a column of Dowex-50 H l of t he mixture of inosinc-5' -phosphulc und aden ylosuccinic acid obtuined iu thc synthetic procedure.

On pap er cbromatograpby with solvcnt syst em (a), fractions 5, 6 and 7 gavc spots witb the mobility o{ inosine-5' -phosphatc ( also sbown by tbc Àmax

value, which was 249 mfJ-) , fraction 8 gave two spot s with the mobilities of inosine-5' -phosphate an d adenylosuccinic a ci d (Àmax was 252 ID fJ-), fra ctions 9, lO, 1 l and 12 gavc a single spot with thc sam e mobility as adeny ­losuccinic aci d (ì.111nx was 268 m !l-)- The u .v . absorbing spot s ga ve a positivt•

A1w. I HI. 8uprr. Suui/tì ( I !JU7) 3, 1 4U - I ~tf ;.

e­

ic ) •

n

·r

d !·

·-G

d il l

BALLIO E DI VlTTO.RIO 155

reaction for IX-glycols, thus showing that during treatment with Dowex-50 H + the isopropylidene group was split off.

Fractions from 8 to 12 were comhin_ed and percolated through a Dowex-1 formate column (1.4 in cm diameter, 14 cm high). The resin was washed . with two column volumes of water and then eluted with a gradient of formic acid. This was performed by connecting the colUinn with a closed mixer containing 400 ml of water, fed from a reservoir with 800 ml _Qf 5N formic acid. Every ten minutes a 6 ml fraetion was collected (see Fig. 2). Fraetions

. 70

60

50

::....40 E ,.._

<D N

-30 "' ~

w20

10

o 20 40 80 Fraction number

100 120

Fig. 2. - Purification of syn­thetic adenylosucci· nic acid on a column of Dowex-1 fonnate.

76 to 88, which on paper chromatography showed the presence of a single spot corresponding to adenylosuccinic aeid, were comhined and freeze dried . On drying 4 hours at lOOo C in vacuo over phosphorus pentoxide, 51 mg of the aci d were obtained with an overall yield from 6-chloro-9-(2~3' -0-iso­propylidene-~-D-ribofuranosyl)-purine of 31.5 %- Analytical data were in good agreement with C1,H18N50 11P · 2~0 (molecular weight 499). In faet an e:269 of 19.7 X 103 at pH 7.0 was found as compared to the value of 19.9 X 103 reported by CARTER & COHEN (1956) for the nucleotide. Phosphorus and ribose analyses gave base, phosphorus and rihose ratios of 0.99: 0..99: 1.05. On paper chromatography in solvent syst ems (a), (b) and (c) and on paper electrophoresis a single spot with the same mobility as adenylosuccinic acid isolated from Penicillium chrysogenum was observed.

[IX ]jf was -3.40 (c = 1.04 in aqueous solution a t p H 7 .0) for a sam­ple dried in vacuo without heating.

.dnn. Isl. Super. Saniti1 (1967) 3 , U9 -156 .

156 ESP E RIENZE E RICER CHE

N-(9-~-D-ribofuranosylpuri 11-6-_yl)-D-aspartic acid 5' -monophosphatt•.

The same proct>durt" used for the synthesis of adt•nylosuccinic acid wa1' followcd for tbc preparation of its diast ereoisom cr from 6-chloro-9-(2' ,3'-0-isopropylident>- ~-D-ribofuranosyl)-purine an d D-aspar t i1· acicl. Thl" yif· lcl was 31 % - An e:21i!l of 19.5 X 10~ and ra tios ofbasc, phosphorus and rioost· cor­responding tu 0.98: 1.02: 1.11 wcrc found for a formula C14H 18N,,0 11 P · 2H 20.

On pap cr chroma tography in solvent syst ems (u), (b) a nd (c) and 0 11

paper electrophoresis a sin glc spot with the same mobiliLy as a dcnylosu t· ­cinic acid isolat cd from Penicillium chrysogenum was obst·rved .

(o:]i{' was - 77.30 (c = 1.1 5 in aqueou s solut ion a t pH 7.0) for a sa m­plc dried in tmcuo without lwating.

Wt> t hank the Con~iglio 'azionul~ dellt> Ricerche, R outt·, for finarwial ~uppurt.

3 novembre 1966.

REFERE ·cE~

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