Enzimi Applicazioni

7/21/2019 Enzimi Applicazioni

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CONCETTI ALLA BASE DI UNA BIOTRASFORMAZIONE

Biocatalizzatori: vantaggi e svantaggi

Se si utilizzano gli enzimi per una trasformazione di un composto organico non-naturale le obiezioni

che si possono sollevare sono le seguenti:

a) Gli enzimi sono sensibili. Questo vero perch la maggior parte degli enzimi non resistono in acqua

bollente ma se vengono usate le opportune precauzioni, che sono del resto necessarie per molti

composti chimici, di solito sono molto stabili.

b) Gli enzimi sono costosi. Alcuni lo sono, ma altri invece sono economici se prodotti in larga scala.

Se si considera poi lalto potere catalitico confrontato con la maggior parte dei catalizzatori chimici,

lutilizzo pu essere pi vantaggioso. Inoltre se immobilizzati gli enzimi possono essere riutilizzati.

c) Gli enzimi sono attivi solo sui loro substrati naturali. Per alcuni enzimi questo vero, ma per la

maggior parte sicuramente falso. Molti enzimi sono capaci di accettare substrati non-naturali anche

con strutture non simili e mantengono la stessa alta specificit. E generale comunque che pi il

meccanismo di azione di un enzima complesso, pi stretto il limite di accettabilit per i substrati

estranei.

d) Gli enzimi lavorano solo nel loro ambiente naturale. E generalmente vero che gli enzimi

esplicano al massimo la loro attivit in acqua che normalmente un incubo per i composti organici.

Recentemente si visto che molti enzimi possono lavorare anche in solventi organici anche se la loro

attivit normalmente pi bassa.

Lutilizzo dei biocatalizzatori produce certamente molti vantaggi:

1) Gli enzimi sono catalizzatori molto efficienti. Vi una accelerazione per una reazione catalizzata

da enzimi di circa un fattore di 108. Si pu arrivare anche a 10

12che molto lontano da quello che pu

fare un catalizzatore chimico. Inoltre la concentrazione di un catalizzatore chimico va dallo 0.1-1%

mentre quella di un biocatalizzatore va dal 10-3

-10-4

%.

2) Gli enzimi sono accettati dallambiente. A differenza dei metalli pesanti che compongono

normalmente i catalizzatori chimici gli enzimi sono completamente degradati dallambiente.

3) Gli enzimi agiscono in condizioni blande. Gli enzimi lavorano in un intervallo di pH che vada 5 a

8, normalmente 7, a temperatura di 20-40C, normalmente 30C. Questo minimizza la possibilit di

avere reazioni non desiderate come decomposizione, isomerizzazione, racemizzazione,

riarrangiamento.


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4) Gli enzimi non sono legati al loro ruolo naturale. Dimostrano una grande tolleranza accettando

anche substrati di produzione umana e non devono per forza lavorare in acqua.

5) Gli enzimi possono catalizzare un largo spettro di reazioni. Come tutti i catalizzatori gli enzimi

accelerano solo la reazione ma non influenzano lequilibrio termodinamico.

Dal punto di vista stereochimico gli enzimi mostrano queste caratteristiche:

Chemoselettivit. Poich lenzima in grado di agire su un singolo tipo di gruppo funzionale, altre

funzioni sensibili non vengono elaborate.

Regioselettivit e diastereoselettivit. Data la loro struttura tridimensionale complessa, gli enzimi

possono distinguere tra gruppi funzionali che sono chimicamente situati in regioni differenti della

stessa molecola substrato.

Enantioselettivit. gli enzimi sono tutti formati, in quanto proteine, da L-amminoacidi, e quindi sono

catalizzatori chirali. Ogni tipo di chiralit quindi presente nel substrato riconosciuta nel momento

della formazione del complesso enzima-substrato. Cos un substrato prochirale pu essere trasformato

in un prodotto otticamente attivo, e i due enantiomeri di un substrato racemico possono reagire e con

velocit differenti portando ad una risoluzione cinetica.

Importanza dellenantioselettivit

Tutti i processi biochimici che avvengono in un organismo sono governati da enzimi. Dal momento che

la maggior parte di essi altamente selettiva nei confronti della chiralit del substrato, ovvio che gli

enantiomeri di un composto bioattivo come un farmaco o un composto agrochimico danno differenti

effetti biologici.

Di conseguenza essi possono essere visti come due specie differenti: lisomero che ha lattivit pi alta

chiamato eutomero, mentre il suo enantiomero che possiede attivit minore o indesiderata detto

distomero.

Leffetto del distomero pu essere pi basso, nullo o addirittura tossico.


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R-enantiomeri

HOOC

SH

NH2

S-enantiomeri

penicillamminaCOOH

HS

NH2

tossico antiartritico

OH

terpene

odore di lill

OH

odore di pipa fredda

HOOC NH2

NH2 O

COOHH2N

NH2O

asparagina

amarodolce

Di conseguenza i racemati dei prodotti farmaceutici ed agrochimici sono visti con sospetto. Con grande

meraviglia l88% dei 480 farmaci chirali sintetici venivano nel 1982 venduti in forma racemica e circa


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il 92% dei pesticidi. Questa situazione andata via via cambiando sotto la spinta legislativa che ha

portato ad una sempre maggiore richiesta di prodotti enantiomericamente puri.

Sfortunatamente solo il 10% dei composti organici pu essere separata mediante tecniche di

cristallizzazione frazionata. Le principali sintesi asimmetriche inoltre fanno uso di ausiliari chirali

enantiomericamente puri che in molti casi sono molto costosi e non possono essere ricuperati.

Daltra parte la sintesi del composto desiderato partendo dal cosiddetto chiral pool che sono i

composti naturali enantiomericamente puri come i carboidrati, gli amminoacidi i terpeni e gli steroidi

non sempre possibile.

Svantaggi dei biocatalizzatori

Gli enzimi che la natura ci fornisce spontaneamente hanno ununica forma enantiomericae, dal

momento che non si possono creare enzimi che sono limmagine speculare di quelli naturali usando i

D-amminoacidi, impossibile invertire la chiralit di una reazione enzimatica ma bisogna cercare un

altro enzima che abbia selettivit opposta. Questo talvolta comunque possibile.

Gli enzimi richiedono condizioni di reazione piuttosto ristrette. Quello, che certamente un

vantaggio, di lavorare in condizioni blande qualche volta pu essere un impedimento alla reazione

stessa. Se la reazione nella condizione di lavoro dellenzima procede lentamente , queste condizioni

non possono essere variate di molto in quanto la temperatura e il pH devono rimanere entro valori ben

precisi pena la denaturazione dellenzima.Gli enzimi esplicano la loro attivit a livelli elevati in acqua. Molte delle reazioni organiche hanno

problemi ad avvenire in acqua perch i substrati sono normalmente poco solubili. Si pu lavorare anche

in sovente organico ma questo comporta di solito una perdita di attivit.

Gli enzimi possono essere inattivati. Linattivazione pu essere dovuta ai prodotti stessi della

reazione o addirittura al substrato che deve essere elaborato. Talvolta gli enzimi cessano di lavorare

quando la concentrazione del substrato o del prodotto diventano troppo elevate. Questo problema pu.

essere superato eliminando man mano che si forma il prodotto che provoca linibizione.

Gli enzimi possono causare allergia. Per questo problema si utilizzano le normali tecniche di protezione

che vengono utilizzate per i prodotti chimici nocivi.

Confronto tra luso di enzimi e di sistemi cellulari

Lo stato fisico dei biocatalizzatori usati pu essere molto differente. luso di enzimi pi o meno

purificati o di microrganismi, che possono essere considerati dei sistemi multienzimatici, in forma


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libera o immobilizzati dipende da una serie di fattori: a) il tipo di reazione; b) i cofattori che devono

essere riciclati; c) la scala in cui la biotrasformazione deve essere fatta.

Sistema Forma Vantaggi Svantaggi

Enzima isolato come tale apparecchiatura semplice,lavorazione semplice,migliore produzione dovuta alla

capacit di tollerare alte

concentrazioni

necessario il riciclo delcofattore

sciolto in acqua alta attivit dellenzima reazioni collaterali,

substrati lipofilici

insolubili,estrazione,

sospeso in

solvente organico

reazione facile da fare,

reazione facile da lavorare,

substrati lipofilici solubili,facile recupero dellenzima

bassa attivit

immobilizzato facile recupero dellenzima perdita di attivit durante

limmobilizzazione

Cellule come tali equipaggiamento costoso,lavoro oneroso a causa dei

grandi volumi,

bassa produttivit data dallabassa tolleranza alla

concentrazione,

bassa tolleranza ai solventi

organici,reazioni collaterali dovute al

metabolismo

non necessario il riciclodel cofattore

colture in

crescita

attivit pi alta grande biomassa,

pi prodotti collaterali

cellule cresciute facile lavorazione,

pochi prodotti collaterali

attivit pi bassa

celluleimmobilizzate

possibile riciclaggio dellecellule

attivit pi bassa

Le biotecnologie hanno sviluppato la sintesi di una serie di prodotti chimici che vanno dagli

amminoacidi alle penicilline, partendo da prodotti poco costosi come i carboidrati e utilizzando le

cellule di vari microrganismi. Queste sintesi sono dei processi fermentativi che avvengono mediante

una serie di reazioni consecutive. In constrasto la maggior parte delle biotrasformazioni

microbiologiche partono da molecole organiche complesse e avvengono in un unico stadio usando le


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potenzialit enzimatiche di un microrganismo per trasformare il composto organico non-naturale nel

prodotto desiderato.

Propriet degli enzimi

Il primo meccanismo proposto per lazione di un enzima quello chiave-serratura sviluppato da

Fischer nel 1894.

Questa schematizzazione per quanto sofisticata per quel tempo rappresenta lenzima come un

catalizzatore rigido. questo non spiega il fatto che gli enzimi in generale sono capaci di biotrasformare

una grande quantit di substrati anche con forme diverse.

Nel 1960 Koshland ammise che gli enzimi non erano cos rigidi come descritto precedentemente. Egli

formul lipotesi che durante la formazione del complesso enzima -substrato, l(enzima possa cambiare

la sua conformazione sotto linfluenza del substrato stesso in modo da accoglierlo come ospite. Un

modello adatto a spiegare questa interazione dato dalla mano (il substrato) e dal guanto (lenzima).

Questo modello spiega anche perch in molti casi sono richieste delle particolari strutture sul substrato.

Queste particolari strutture possono trovarsi anche a distanza considerevole dal sito attivo.

Lesempio pi tipico di enzima in cui viene indotta la struttura (induced-fit) sono le lipasi. Questi

enzimi sono in grado di elaborare una grande variet di substrati artificiali che non hanno molto in

comune con i substrati naturali che sono i trigliceridi.


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A rappresenta il gruppo reattivo del substrato, X il corrispondente gruppo reattivo dellenzima. La

parte B del substrato forza lenzima ad adattarsi ad una differente conformazione. Entrambi i gruppi

attivi X dellenzima sono posizionati in maniera corretta per effettuare la catalisi. Se non c la parte B,

non vengono indotti cambiamenti conformazionali e loperatore chimico inattivo.

La regola dei tre punti di attacco

La razionalizzazione che spiega lenantioselettivit di un enzima stata fatta da Ogston in un articolo

su Nature del 1948: per avere un alto grado di enantioselettivit il substrato deve essere legato

fermamente in uno spazio tridimensionale. Per fare questo ci devono essere almeno tre differenti

punti di attacco del substrato allinterno del sito attivo. Facciamo un rappresentazione schematica

della discriminazione fra gli enantiomeri di una miscela racemica quando la chiralit data da un

carbonio sp3.

Nel caso Ilenantiomero A un buon substrato per dare unottima interazione dei suoi gruppi A, B, C

con i gruppi complementari del sito attivo dellenzima A, B, C. Questo assicura unottima

orientazione del gruppo reattivo D nei confronti delloperatore chimico che procede alla

trasformazione.


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Nei casi II, IIIe IVlenantiomero B un substrato che non si adatta bene al sito attivo e lorientazione

del gruppo reattivo D non possibile. In questi casi la catalisi enzimatica sar scadente.

Se nella catalisi invece coinvolto un substrato prochirale che porta due gruppi identici A ma

stereochimicamente differenti (gruppi enantiotopici)

si pu applicare lo stesso modello per capire quale trasformazione sar favorita: questa si chiamadifferenziazione enantiotopica.

Il caso V mostra un buon legame del substrato prochirale C con il sito attivo complementare

dellenzima. Il gruppo A pro-R situato nella posizione corretta rispetto alloperatore chimico. nel caso

VI la sistemazione del gruppo A pro-S nei confronti delloperatore chimico scadente e questo porta

ad una catalisi non buona. Come conseguenza il gruppo pro-R idrolizzato in modo migliore che il

gruppo pro-S.

Labilit dellenzima a distinguere tra due facce enantiomeriche di un substrato prochirale del tipo D

illustrata nella prossima figura si parla di differenziazione di enantiofacce.


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Nel caso VII si ha una buona corrispondenza tra i gruppi funzionali del composto D con quelli

delloperatore chimico e questo porta ad un attacco allatomo centrale X dalla faccia Si.

Nel caso VII lorientazione speculare del substrato D porta ad una non-corrispondenza dei gruppi.

Lattacco delloperatore chimico, che dovrebbe entrare sulla faccia Re, sfavorito.

Cinetica della selettivit

Come in ogni altra reazione catalitica un enzima (E) accelera la reazione abbassando la barriera di

energia (energia di attivazione Ea) tra il substrato e il prodotto. La catalisi quindi dovuta alla

stabilizzazione dello stato di transizione da parte dellenzima, assumendo che il catalizzatore si leghi

pi fortemente allo stato di transizione che al substrato nello stato fondamentale.


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Virtualmente la stereoselettivit dellenzima si origina dalla differenza di energia nel complesso

enzima-stato di transizione (ES). Per esempio, in una reazione enantioselettiva entrambi i substrati

enantiomerici A e B o le due forme speculari di un substrato prochirale, che coinvolgono i suoi gruppi

enantiotopici o le facce, competono con il sito attivo dellenzima.

A causa dellintorno chirale del sito attivo dellenzima, si formano i complessi diastereomerici enzima-

substrato (EA#) ed (EB#) che possiedono differenti valori di energia libera per i loro stati di

transizione:Il risultato una differenza nellenergia di attivazione sia per i substrati enantiomerici sia

per le orientazioni enantiomeriche e come conseguenza un enantiomero si trasformer pi velocemente

di un altro.

Il valore di questa differenza in energia, espressa come G#, una misura diretta della selettivit

della reazione che governa il rapporto degli enantiomeri P e Q e quindi la purezza ottica del prodotto.

Nella tabella successiva sono espressi alcuni valori rappresentativi di eccessi enantiomerici (ee)

corrispondenti a valori di G# della reazione descritta precedentemente.

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