Effetti sul fenotipo dei diversi tipi di mutazione Mutazioni con perdita di funzione Quasi sempre...
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Effetti sul fenotipo dei diversi tipi di mutazione
Mutazioni con perdita di funzioneQuasi sempre sono Mutazioni recessive (genotipo in omozigosi): - l’eterozigote non esprime il fenotipo mutante, quindi senza aploinsufficienza (per meccanismi compensatori dell’altro allele?)- con aploinsufficienza (pochissimi i casi di alleli recessivi che esprimono questo fenotipo)
Mutazioni con acquisto di funzioneIn genere sono Mutazioni dominanti- per aumento della produzione proteica (e funzione) rispetto al wt- per produzione di una nuova proteina (e funzione) rispetto al wt
APPLICAZIONI DELLA TERAPIA GENICA
- malattie ereditarie monogeniche con ereditarietà mendeliana
- malattie infettive
- malattie multigeniche (cancro)
Terapia genica classica:1) Produzione e somministrazione della proteina che manca al paziente2) Eliminazione delle cellule malate3) Attivazione delle cellule del sistema immunitario che determinano l’uccisione delle cellule malate
Terapia genica non convenzionale: Correzione del difetto genetico restaurando la normale espressione genica.1) Inserimento completo del gene wt nelle cellule somatiche 2) Mutagenesi mirata nelle cellule somatiche per ripristino gene wt3) Silenziamento nelle cellule somatiche del trascritto del gene mutato4) Terapia genica nelle cellule germinali (solo in animali modello)
Strategie per la terapia genicasomatica
Aggiunta genica
Correzione genica per mutagenesi mirata (gene targeting)
Inibizione genica
Eliminazione cellulare controllata
Eliminazione cellulare mediatadal sistema immunitario
Terapia genica somatica in vivo ed ex vivo
in vivo
ex vivo
Terapia genica somatica ex vivo
- Applicabile solo a certi tipi cellulari: cellule in divisione e coltivabili in vitro (es: da midollo osseo, pelle, tumori)
-Estrazione/preparazione delle cellule primarie o della linea cellulare del paziente (cellule autologhe)
- Trasferimento del gene in vitro
- Quando possibile controllo dei trasformanti
- Reimpianto delle cellule nel paziente
SVANTAGGI
- Applicabile a pochi tessuti (sistema emopoietico, cellule epiteliali, ecc)
- Tecnica difficile con scarsa efficienza
- Necessità di trattamenti ripetuti nel tempo
Esempi: cellule staminali di midollo osseo trattate in emofilici e talassemici
Terapia genica somatica ex vivo
Introduzione diretta del gene in vivo nelle cellule bersaglio:
- iniezione diretta in tipi cellulari non coltivabili in vitro (es. c. cerebrali) o per aumentare il numero di cellule trattate rispetto alla terapia ex vivo (es. nel muscolo scheletrico distrofico)
- somministrazione in prossimità del tessuto bersaglio (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica)
Problemi:
- Trasferimento quantitativamente limitato
- Rischio di inserimento in cellule sane
- Reazione immunitaria (alle proteine virali, se si utilizzano virus; talvolta alla proteina espressa)
Terapia genica somatica in vivo
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
1) Trasferimento genico diretto: - trasfezione di DNA “nudo” in plasmidi (applicato a volte a cellule muscolari)- trasfezione mediata da liposomi (vescicole formate da doppio strato lipidico)
2) Trasferimento tramite vettori- retrovirus- adenovirus- virus adeno-associati
3) Tipi di inserzione: - ectopica - mirata
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
1) Trasferimento genico diretto
Vantaggi:- Non si generano nuovi virus patogeni
- Riduzione del rischio di reazione immunitaria - Possono trasferire molecole di DNA anche molto grandi
Svantaggi: - Scarsa efficienza sia di trasferimento che di integrazione - Se integrati, possibile mutagenesi inserzionale
2) Trasferimento tramite vettori virali
Caratteristiche necessarie: - Le particelle virali ricombinanti devono essere difettive rispetto alla
replicazione (deleti per geni responsabili di replicazione e assemblaggio del virione), non produrre composti tossici per l’ospite.
Vantaggi: - Alta efficienza di trasferimento genico
Svantaggi: - Espressione transiente - Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con
eventuali virus presenti nell’ospite - Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate - Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale
nel genoma) (attivazione di oncogèni) - Possibilità di reazioni immunitarie - Tecniche con bassa efficienza e costi elevati
METODI DI TRASFERIMENTO GENICO
Retrovirus (ad RNA): hanno specifici recettori per entrare nelle cellule; si integrano nei cromosomi in localizzazioni casuali, entrano nel nucleo solo quando si dissolve membrana nucleare (solo cellule in divisione)
Adenovirus: legame a specifici recettori cellulari che permettono l'ingresso del virus tramite endocitosi; infettano molti tipi cellulari, anche non in divisione; geni non integrati (episomi); espressione per brevi periodi; necessità di trattamenti ripetuti (es. trattamento fibrosi cistica)
Virus adeno-associati (AAV): non sono in grado di replicarsi autonomamente ma necessitano di virus helper co-infettanti come adenovirus o Herpex simplex. Si integrano in sito specifico (19q13.3).
Lunga sequenza terminale ripetuta
Psi + non codificante: per impacchettamento nel capside
Maturazione del genoma a RNA
Trascrittasi inversa e integrasi
Proteina per involucro
Retrovirus
Vettore retroviraleSostituzione di gag, pol, env con gene X: lunghezza max = 8 kbMarcatore selez: gene Neo
Lunghezza massima: 8Kb
da Dr. Sara Caldarola
Linee cellulari per packaging: forniscono le necessarie funzioni di gag, pol, env, ma delete per gene psi; hanno inserito stabilmente i geni virali codificanti per proteine strutturali del capside, produce virioni vuoti per l’assemblaggio dei virioni.La loro transfezione transiente con vettore ricombinante determina l’impacchettamento del costrutto nel virione (contiene l’enzima transcrittasi inversa) vettore virale completo da usare per l’infezione delle cellule da trattare
PREPARAZIONE RETROVIRUS PER L’INFEZIONE CELLULARE
Dr. Sara Caldarola
IL RETROVIRUS NON E’ IN GRADO DA SOLO DI REPLICARSI E PRODURREPARTICELLE FAGICHE PER ALTRE INFEZIONI CELLULARI
INFEZIONE CON RETROVIRUS DELLA CELLULA BERSAGLIO
Patogeno naturale dell’uomo, genoma a DNA a doppio filamento, causa il comune raffreddore
Come vettore ha una delezione della regione E1 il che lo rende difettivo per la replicazione. Come cellule d'impaccamento vengono usate cellule renali embrionali.
Adenovirus
Virus AdenoassociatiAppartengono alla famiglia dei parvovirus.
Genoma formato da una molecola di DNA a singolo filamento di circa 5 kb.
Capside icosaedrico e sono privi d'un involucro lipidico.
Non sembrano associati a nessuna patologia: ideali come vettori.
Espressione prolungata del transgene
Ma dimensioni ridotte del transgene (max 4,7 kb)
Terapia genica nei tumoriSe inattivato gene soppressore tumore (oncosoppressore) introduzione nuova versione gene; Se attivato oncogène spegnimento con gene con RNA antisenso
Inserimento gene wt
Inserimento miratoe doppia ricombina-zione per ripristinogene wt
Strategie di terapia genica somatica in malattie da aploinsufficienza
Strategie di terapia genica somatica in malattie da acquisizione di funzione
Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali
Produzione di RNA interferenti introdotti con vettori virali
RISC: RNA-Induced Silencing Complex.(Formato da RNA e proteine)srotola ds RNA e il filamento complementaresi appaia con RNA da silenziare, degradazione dell’ RNA a doppio filamento
Complesso Dicer:RNAsi che degrada lunghi filamenti di dsRNA a frammenti di circa 20 bp
Si introduce nella cellula l’RNA del geneche si vuole silenziare a doppio filamento (dsRNA)
Es: ganciclovir
Terapia genica dei tumori
Gcv Gcv-P Gcv-PPP
Incorporazione DNA
Terminazione catenarottura DNA
Tk HSV Tk mamm
Ganciclovir (Gcv): analogo di un nucleoside virale (metilguanina): uccide le cellule tk+, ovvero quelle con il vettore virale inserito
Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali
Ganciclovir (Gcv): analogo del nucleoside erpetico: uccide le cellule tk+, ovvero con il vettore virale inserito
Gcv Gcv-P Gcv-PPP
Incorporazione DNA
Terminazione catenarottura DNA
Tk HSV Tk mamm
VPC = Cellule infettate da Herpes simplex (con gene Tk) che producono virioniimpiantatenel tumore
Produzione di timidina chinasi virale
Somministrazione farmaco (GCV)Neuronavigazione
stereoatassica guidata da MRI
Malattia Gene introdotto Tessuto targetß-talassemia ß-globina Midollo osseoImmunodef. congenita (SCID) ADA Midollo/linfocitiDistrofia muscolare Distrofina MuscoloFibrosi cistica CFTR Epitelio alveoliEmofilia A e B Fattore VIII e IX Epatociti/muscoliFenilchetonuria Fenilalanina idrossilasi FegatoMorbo di Gaucher Glucocerebrosidasi Midollo osseoMucopolisaccaridosi tipo I -L-iduronidasi FibroblastiMucopolisaccaridosi tipo VII ß-glucuronidasi Midollo osseoEpidermolisi bullosa Laminina Cheratinociti
TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE UMANE MENDELIANE
SCID: SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY DISEASE
Assenza di Adenosina deaminasi (ADA) (enzima della via di recupero delle purine) Malattia AR: mancanza di cellule progenitrici dei linfociti T e accumulo metaboliti tossici (adenosina e derivati)
Terapia classica:-Trapianto di midollo: compatibilità del 90-100% dell’HLA (una minoranza dei pazienti)- Somministrazione di enzima ADA estratto dai bovini (correzione del metabolismo, ripristina in parte funzioni immunitarie).
Terapia genica ex vivo:- Cellule staminali emopoietiche- Precursori linfociti T - Infezione con vettore retrovirale. Il cDNA dell’ADA dimensioni ridotte(1.5 Kb). Non è necessaria una regolazione fine dell’espressione genica con ripristino della fisiologia sia con alta che bassa efficienza di integrazione- Cellule con copia gene ADA hanno un vantaggio selettivo di crescita eliminando più facilmente i metaboliti tossici
SCID: UN ESEMPIO DI SUCCESSO DELLA TERAPIA GENICA SOMATICA
Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo con retrovirus per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA)
Terapia 6-7 volte l’anno.Dopo 5 anni recupero parziale della funzione immunitaria
ADAPrecursori linfociti T da midollo osseo paziente ADA-
Terapia genica per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA)
Linfociti T oppureCellule staminali midollo osseo (tutte le linee emopoietiche transgeniche)
Malattia letale entro i 30 anni senzatrattamenti.
Terapia classica:- Drenaggio bronchiale- Somministrazione antibiotici
Terapia genica ex vivo-Vettori adenovirali per introdurreil gene CFRT nelle cellule dei polmoni tramite aereosol
Problematiche:Tessuto polmonare crea barriere fisiche (muco) e immunitarie;difficile ingresso dell’adenovirus nel nucleo; reazioni infiammatorie; espressione a breve termine
Terapia con staminali?Inserimento CFTR in vettori virali e infezione di staminali paziente (da midollo), spinte a differenziarsi ad epiteliali per ripopolare il polmone
COSA È LA DMDCOSA È LA DMD
LA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD) E’ UNA GRAVE PATOLOGIE GENETICA, CAUSATA DALLA TOTALE ASSENZA DELLA DISTROFINA NEL MUSCOLO STRIATO E LISCIO.
colpisce tutti i muscoli scheletrici, la muscolatura liscia e il cuore. difficoltà di deambulazione e di movimento insufficienza respiratoria problemi cardiaci DMD: conduce alla completa immobilità, l’aspettativa di vita non supera i 25-30
anni. A 10-12 anni i ragazzi vivono sulla carrozzina.
La DMD è una malattia rara, con una ha una frequenza di 1 su 3500
Mutazioni dello stesso gene causano anche:• La distrofia di Becker (DMB), meno invalidante con assenza parziale di
distrofina.
• Cardiomiopatia dilatativa legata all’X
• Il gene è localizzato sul braccio corto del cromosoma X.
• Le donne con una sola copia mutata del gene sono portatrici sane, gli uomini, essendo emizigoti, si ammalano.
• E’ il più lungo gene fin ora identificato, circa 2,3 Mb (79 esoni)
• mRNA rappresenta solo lo 0,5% del gene (circa 12 kb)
• 7 promotori, originano 1 proteina lunga e 6 versioni più corte.
• La distrofina, formata da 3685 aminoacidi, PM 427 kDa.
TUTTA COLPA DI UN GENETUTTA COLPA DI UN GENE
LA DISTROFINALA DISTROFINA• Ancorata sulla faccia interna della membrana
delle fibre muscolari.C- terminale è legato ad altre proteine
di membrana. N-terminale è connesso alle strutture
contrattili all’interno della cellula muscolare.
• Determinante per la stabilità meccanica della membrana durante la contrazione muscolare, funziona da ammortizzatore.
• Assenza o malfunzionamento causa rottura della membrana muscolare:
Ingresso del calcio nelle fibre.Attivazione di enzimi.Infiammazione e attivazione dei
fibroblasti.Formazione di tessuto cicatriziale che
sostituisce quello muscolare.Degenerazione muscolare e insorgenza
della patologia.
Terapia genica per la DMD
- Terapia di tipo sistemico (muscolatura striata, cuore, diaframma)
- Muscoli target difficilmente raggiungibili
- Transgene di dimensioni elevate (cDNA di 14 kb)
- Pochi vettori utilizzabili
TERAPIA GENETICA: L’EXON SKIPPINGTERAPIA GENETICA: L’EXON SKIPPING• La mutazione elimina EX50 portando alla
fusione di IVS 49 e IVS50; cambia il reading frame del gene della distrofina e cessa la produzione della proteina funzionale
• Viene indotto l’exon skipping (E.S.) dell’esone 51 nel pre-mRNA: Antisense Oligo (AO) che si attaccano alla sequenza dell’ESE (exonic-splicing-enhancer) all’interno dell’esone 51
• E.S. ristabilisce il corretto schema di lettura (reading frame) modificando l’mRNA (EX49 in frame con EX52)
• La proteina è più corta ma ancora funzionante
• Converte la DMD in DMB in modo da ridurre la gravità della malattia
COME FUNZIONA L’EXON SKIPPING 1/2COME FUNZIONA L’EXON SKIPPING 1/2• AOS o Oligonucleotidi antisenso, corti frammenti di RNA, si appaiano in regioni
coinvolte nello splicing del pre –mRNA, producendo splicing alternativo con rimozione di uno o piu esoni
• i 2 tipi di AOS più utilizzati nella sperimentazione per l’eliminazione dell’esone 51 sono:
2’O- metyl- fosforotioates, PRO05, formato da 20 basi
Morfolino, AVI-4658, ha 30 basi, e include le 20 del PRO05
2’O-Metil AO
morfolino AO
UCUUUACGGUGAAGGAACU GAUCUUUACGGUGAAGGAACUACAACCYC
Il trattamento con una molecola antisenso, somministrata con iniezione intramuscolare.
Lo studio, compiuto presso UCL (Londra) ha riguardato 7 ragazzi di età compresa tra 10 e 17 anni con DMD a cui era stata diagnosticata la malattia e in cui poteva risultare di beneficio lo skipping (salto) dell’esone 51.
Due dei pazienti hanno ricevuto 0.09 mg dell’oligonucleotide antisenso AVI-4658, iniettato localmente in un piccolo muscolo del piede (extensor digitorum brevis).Gli altri 5 pazienti hanno ricevuto 0.9 mg di AVI-4658 nell’altro piede.
I pazienti che hanno ricevuto il più basso dosaggio (0.09 mg) di AVI-4658 hanno mostrato poca espressione di distrofina, il dosaggio più alto (0.9 mg) ha prodotto un aumento dell’espressione di distrofina nel muscoli trattati.
Nelle aree delle sezioni immunocolorate adiacenti al luogo in cui AVI-4658 è stato iniettato, il 44-79% delle miofibre ha aumentato l’espressione della distrofina.
Fonte: Lancet Neurology, 2009
Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficienza (trasduzione di un numero di cellule elevato).• Garanzia di una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati).• Capacità di incorporare DNA di varie dimensioni.• Garanzia nella regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene introdotto• Non patogenicità • Facilità di somministrazione al paziente.• Capacità di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Buona tolleranza.• Assenza di immunogenicità • Facilità di costruzione e riproducibilità
IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. I VETTORI PIU’ UTILIZZATI OGGI SONO I RETROVIRUS