Edmund Mach Foundation - GLI OLIGOMERI DEL ......(Berk. e Curt) Berl. et De Toni sono state raccolte...

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L’ENOLOGO � LUGLIO/AGOSTO 2013

GLI OLIGOMERI DEL RESVERATROLONELLE FOGLIE DELLE VITI RESISTENTI(MERZLING X TEROLDEGO)INFETTATE DA P. VITICOLAScopo di questo studio era la caratterizzazione strutturale delle viniferineche si accumulano nelle foglie dei genotipi resistenti di Vitis viniferase infettati con Plasmopara viticola. Sono state evidenziate 15 viniferine,delle quali 10 nuove per la vite, assieme ad un dimero che derivadalla condensazione della (+)-catechina con l’acido trans-caffeico.

IntroduzioneAll’interno delle Vitaceae,

le viniferine rappresentano ungruppo relativamente ristrettodi composti fenolici di bassopeso molecolare costituito daderivati del trans-resveratrolodotati di proprietà antifungi-ne, che permettono alla piantadi contrastare l’attacco deipatogeni (1). Nella vite, laproduzione di resveratroloporta alla formazione di fitoa-lessine che derivano da oligo-

merizzazione ossidativa,denominate viniferine (2).Alcune di queste sono statedimostrare agire biologica-mente contro diversi patogenifungini della vite (3-4). Èstato osservato che la tossicitàdelle fitoalessine stilbenicheverso i funghi è strettamentecorrelata alla loro strutturachimica. In particolare, è statoriportato che γ-viniferin,dimero ossidativo del resvera-trolo, e pterostilbene, analogometilato del resveratrolo,

sono gli stilbeni maggiormen-te tossici verso la mobilità esviluppo dell’oomycete P.viticola (2,5).

Gli studi pioneristici diLangcake e Pryce (3) hannochiarito le strutture di trans-resveratrolo, α-viniferin ed ε-viniferin, osservando la pre-senza di altri composti carat-teristici della famiglia delleVitaceae simili alle viniferinema non caratterizzati (β-vini-ferin e γ-viniferin). Hannodescritto inoltre la formazione

1Fulvio Mattivi1Urska Vrhovsek

1Giulia Malacarne1Domenico Masuero

1Luca Zulini1Marco Stefanini1Claudio Moser

1Riccardo Velasco2Graziano Guella

1Fondazione Edmund Mach,Centro Ricerca ed Innovazione -

San Michele all’Adige (TN)2Laboratorio di Chimica Bio-orga-

nica, Dipartimento di Fisica,Università di Trento

DOCUMENTO

TECNICO

F. Mattivi

Parole chiave: Vitis vinifera,Plasmopara viticola, stilbe-ni, stilbenoidi, NMR, spet-trometria di massa

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Pinot Grigio. La muffa biancaemergente dalla parte inferio-re delle foglie è stata spazzo-lata in acqua bidistillata finoad ottenere una sospensione diconidi con 104/105 spore/mL.

L’infezione delle piante èstata ottenuta spruzzando lasospensione di conidi freddasulla superficie inferiore ditutte le foglie completamenteestese, in una camera climati-ca mantenuta a 24 °C e 80%RH.

Composti chimici. Aceto-nitrile, metanolo e acido ace-tico sono stati acquistati daCarlo Erba, etile acetato daBDH ed acido fosforico daMerck. L’acqua era di gradomilliQ. I composti trans-resveratrolo e trans-4-hydro-xystilbene sono stati ottenutida Sigma Aldrich, cis-resve-ratrolo è stato preparato viafoto-isomerizzazione di stan-dard di trans-resveratrolo,mentre trans-piceid (trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopy-ranoside) era stato isolatodalle radici anidre di Poly-gonum cuspidatum (7). Lapurezza di ogni monomero èstata controllata per HPLC el’identità confermata in ac-cordo con Mattivi et al. (8).

una più ampia ricerca finaliz-zata a stabilire il ruolo dell’in-tera classe delle viniferinenella difesa della vite nei con-fronti di P. viticola. Unoscreening preliminare condot-to per mezzo di HPLC-DAD-MS aveva mostrato che il17% dei genotipi in unapopolazione segregante(Merzling x Vitis viniferaTeroldego) presenta nellefoglie una quantità elevatarispetto ai parentali, ed uncomplesso profilo di viniferi-ne della vite note ed ignote,successivamente alla infezio-ne con P. viticola.

Scopodel lavoro

Lo scopo principale di que-sto studio era quindi l’isola-mento e caratterizzazionestrutturale delle viniferinepresenti in alcuni genotipiselezionati della popolazionedi viti resistente alla P. vitico-la. Attraverso tecniche avan-zate di spettrometria di massa(LC-ESI-MS e LC-ESI-Q-TOF) e misure estensive dirisonanza magnetica nucleare(NMR) mono e bidimensio-nali, spettrometria ultraviolet-

to (UV), dicroismo circolare(CD) e proprietà ottiche, èstato possibile identificare ledieci principali viniferine,come pure tre viniferineminori e un polifenolo dimeropresenti nelle foglie infettate.Calcoli di meccanica moleco-lare (MM) sono inoltre staticondotti su tutti i compostiqui riportati, per individuarnela conformazione più stabile.

Materialie metodi

Viti. Per l’isolamento delleviniferine sono stati scelti 18genotipi dai vigneti sperimen-tali della Fondazione EdmundMach in San Michele all’Adi-ge, da una popolazione F1che deriva da incrocio traMerzling e V. vinifera cvTeroldego. Le 10 foglie api-cali di 2-3 germogli sonostate infettate con P. viticola,e dopo 6 giorni campionate,congelate e conservate a -20°C.

Infezione delle piante.Sporangiospore di P. viticola(Berk. e Curt) Berl. et DeToni sono state raccolte dapiante infette di V. vinifera cv

di un deidrodimero di trans-resveratrolo (che successiva-mente ha preso il nome di δ-viniferin) ad opera dellaperossidasi da rafano e dellaH2O2. Successivamente a que-sti lavori c’è stato poco pro-gresso nella caratterizzazionestrutturale di questi compostibioattivi inducibili nelle fogliedi vite. Altri stilbeni identifi-cati in foglie infettate con P.viticola sono il monomeropterostilbene (2) ed il dimeroδ-viniferin (sinonimo: trans-resveratrol dehydrodimer),che sono stati descritti esserele principali viniferine sinte-tizzate in foglie di V. viniferavar. Chasselas infettate da P.viticola o soggette a radiazio-ne ultravioletta (5), mentre lostilbenoide α-viniferin non èpiù stato osservato nei lavoriseguenti. La maggior partedegli studi disponibili si sonofocalizzati su presenza e ruolofunzionale delle strutture note,concentrandosi soprattuttosugli oligomeri che manten-gono nella struttura il doppiolegame stilbenico, denominatioligostilbeni (1,6) piuttostoche su quei composti che lahanno persa nella polimeriz-zazione, detti stilbenoidi.

Questo articolo è parte di

Tab. 1 - Nome, quantità isolata e dati MS dei composti ottenuti da foglie di vite infettate con P. viticola.

frazione tempo quantità taglia nome formula MM ione molecolare osservato Δ massa

ritenz. (min) (mg) molecolare calcolata (M-H)- (M-H)- (ppm)

1.1 17,4 0,13 di- Z-ω-viniferin (1) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1340 -0,7

1.2 17,9 2,80 di- E-ω-viniferin (2) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1323 3,1

1.4 18,5 n.a. di- E-ω-viniferin (3) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1340 -0,7

1.4 18,5 n.a. di- Z-ω-viniferin (4) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1338 -0,2

2.1 13,5 1,10 di- caffeic acid and C24H20O9 452,1107 451,1028 451,1021 1,6catechin condensation

product (5)

2.2 14,8 1,39 di- pallidol (6) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1317 4,4

3.1 15,4 0,61 tri- ampelopsin D (7) C28H22O6 454,1416 453,1337 453,1340 -0,7+ quadrangularin A (8)

3.2 18,9 1,13 tri- α-viniferin (9) C42H30O9 678,1890 677,1811 677,1818 -1,0

4.1 19,1 0,59 tri- E-cis-miyabenol C (10) C42H32O9 680,2046 679,1967 679,1979 -1,8

5.1 17,9 0,54 tri- Z-miyabenol C (11) C42H32O9 680,2046 679,1967 679,1974 -1,0

5.2 18,1 1,55 tri- E-miyabenol C (12) C42H32O9 680,2046 679,1967 679,1969 -0,3

6.1 16,8 5,46 tetra- isohopeaphenol (13) C56H42O12 906,2676 905,2597 905,2617 -2,2

7.1 17,5 1,04 tetra- ampelopsin H (14) C56H42O12 906,2676 905,2597 905,2620 -2,5

7.2 17,5 0,90 tetra- vaticanol C-like (15) C56H42O12 906,2676 905,2597 905,2635 -4,2

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per HPLC-DAD-MS. La fra-zione C, con tutti i compostidi nostro interesse, venivaselezionata per ulteriore lavo-razione, mente le altre veni-vano eliminate.

Cromatografia flash suHW40S. Una seconda purifi-cazione è stata condotta sullastessa apparecchiatura, usan-do 20 g di resina HW40S(Toyopearl) come fase stazio-naria. La soluzione in meta-nolo (la frazione C ottenutadalla purificazione conENV+) è stata caricata quan-titativamente sulla colonna asiringa. La colonna venivainserita nel sistema HPLCpreparativo, lavata con acqua(500 mL) a 10 mL/min, e col-legata al detector impostato a280 nm. Le fasi mobili eranoacqua (A) e metanolo (B). Lacorsa cromatografica consistein un gradiente lineare da 50 a100% B in 60 min, seguito daun tratto isocratico al 100% Bper 40 min, con flusso 10mL/min. Venivano raccolte lefrazioni sequenziali di 50 mLed una aliquota di ciascunainiettata in HPLC-DAD-MSper verificarne la composizio-ne. Le frazioni eluite tra 50 e90 min contenevano tutti glistilbeni e stilbenoidi. Questefrazioni venivano riunite, por-

tate a secco e sciolte in 100mL di metanolo. Questa fra-zione purificata risultava ulte-riormente arricchita nei com-posti desiderati.

Cromatografia preparati-va in fase normale. Per ilfrazionamento dei diversi oli-gomeri è stata scelta unacolonna diolo, Develosil100DIOL-5, 300 x 20 mm.Dopo condizionamento conacetonitrile, con flusso 20mL/min, è stata connessa adun rilevatore UV operante a280 nm. Aliquote di 10 mLdell’estratto metanolico puri-ficato contenente gli stilbenivenivano portate a secco,sciolte in 0.5 mL di metanoloe 0.5 mL di acetone primadella iniezione. La separazio-ne cromatografica, a tempera-tura ambiente, era condottautilizzando come fasi mobiliacetonitrile (A) e metanolocon 3% acqua (B). Il profiloera il seguente: 100% A per15 min, gradiente lineare al15% B in 30 min, gradientelineare al 100% B in 10 min,valore mantenuto per altri 10min. Ciascun picco venivaraccolto separatamente, porta-to a secco, sciolto in 10 mL dimetanolo ed analizzato perHPLC-DAD-MS. Le 7 fra-zioni contenenti gli stilbeni

così ottenute sono state porta-te a 1.5 mL in acetone per lacaratterizzazione preliminarecon NMR.

Cromatografia preparati-va in fase inversa. Unacolonna Discovery HS-C18,250 x 21.2 mm, 5 μm, venivacondizionata con acqua, conflusso 10 mL/min e collegataal detector operante a 280 nm.Ognuna delle 7 frazioni veni-va portata a secco, sciolta in0.5 mL metanolo e filtrata sufiltro Durapore 0.22 μm primadella iniezione. La separazio-ne cromatografica veniva con-dotta a temperatura ambiente,in 78 min, utilizzando acqua(solvente A) e acetonitrile (B),con questo profilo: 100% Aper 3 min, poi isocratico a(30-27-32-34-32-32-32% B,percentuale variabile rispetti-vamente per le frazioni 1-7)per 65 min seguito da 100% Bper 10 min. Ogni picco (14 intotale) veniva raccolto separa-tamente, portato a secco,sciolto in 10 mL di metanoloed analizzato utilizzandoHPLC-DAD-MS.

Analisi HPLC-DAD-MS.Le seguenti condizioni sonostate utilizzate per monitorareogni passaggio dell’isolamen-to e sono state inoltre validate

Estrazione. Il processo èstato condotto sotto azoto, albuio e in assenza di acidiminerali, per prevenire la pro-duzione di artefatti dovuto adossidazione, foto-isomerizza-zione ed idrolisi. Le fogliesono state pesate (517 g),macinate ed estratte per 48 ha temperatura ambiente inmetanolo (10 L). Il materialesolido è stato rimosso ed ilvolume di estratto ridotto a500 mL in evaporatore rotan-te a 35 °C.

Cromatografia preparati-va. Sia la cromatografia flashin bassa pressione che la cro-matografia liquida ad altrapressione sono state realizzatecon un sistema HPLC prepa-rativo Shimadzu SCL-10AVP. Per guidare l’estrazio-ne, sia l’estratto grezzo cheogni frazione intermedia sonostate analizzate per HPLC-DAD-MS.

Cromatografia flash suIsolute ENV+. Il primo pas-saggio nella purificazionedell’estratto è stato condottocon una colonna a siringaIsolute da 150 mL per croma-tografia flash, impaccata con20 g di assorbente ENV+Isolute con diametro di 40-70μm e dimensione media deipori di 60 μm, chiuso alle dueestremità con i dischi acces-sori Isolute SPE. La resinaveniva attivata prima di cia-scun uso tramite eluizionesequenziale con metanolo(200 mL) ed acqua (300 mL).L’estratto grezzo era diviso indue frazioni da 250 mL, cia-scuna filtrata su filtroDurapore 0.22 μm, assorbitasu circa 10 g di resina attivataed asciugata sotto pressioneridotta. La resina venivasospesa in acqua ed impacca-ta nella colonna a siringa, cheveniva inserita in linea nelsistema HPLC. La cromato-grafia flash era condotta atemperatura ambiente con unflusso di 25 mL/min ed elui-zione sequenziale con: A.acqua (350 mL); B. pentano :diclorometano 2:1 v/v (2 L);C. etile acetato (500 mL) e D.metanolo (500 mL). Le fra-zioni B, C e D venivano por-tate a secco, disciolte in 50mL di metanolo ed analizzate

Fig. 1 - Purificazione dell’estratto grezzo sulla colonna diolo

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sion power di 0 db e equipag-giato con pulsed-gradientfield utility. La scala del che-mical shift (δ) era calibratasul segnale del protone resi-duo dell’acetone deuterato,rispettivamente a δ H 2.040ppm e δ C 29.80 ppm. Sonostati registrati questi esperi-menti: 1H-NMR; decoupled13C-NMR; 1H-1H DQCOSY;1H-13C HSQC; 1H-13CHMBC e 1H-1H NOESY.

I calcoli di meccanicamolecolare sono stati ottenuticon programma PCMOD 7.0/GMMX versione 1.5. Tuttele strutture minimizzate cherientravano in una finestra distrain-energy di 3.0 kcal/molvenivano salvate e infineminimizzate con entrambiMMX e MM3 force fields,conservando solo quelle rien-tranti entro 2.0 kcal/mol.

Misure UV. Gli spettri UVdi ciascun oligomero sonostati registrati in metanolo, suuno spettrometro Hitachi U-2000. Valori medi venivanoottenuti attraverso misurazio-ne a due appropriate diluizio-ni, una il doppio dell’altra,tutte nel range 1.15-9.55 X10-5 M, al fine di ottenere unalettura di assorbanza nell’in-tervallo 0.27-0.83 UA.

Misure polarimetriche edicroismo circolare. La rota-zione ottica specifica venivamisurata in metanolo a tem-peratura ambiente, utilizzan-do un polarimetro JASCO-DP181 alla lunghezza d’ondadi emissione del sodio e valu-tato come valori di [a]Despressi in deg dm−1cm3 g−1 .Lo spettro CD era registratoin metanolo a temperaturaambiente, con un dicroigrafoJasco J-40AS e valutando Δe(dicroismo circolare molare)in cm mol-1 L alla lunghezzad’onda del massimo osserva-to nello spettro CD.

Dati strutturali deicompo-sti isolati

Le tabelle con tutti i datistrutturali sono reperibili sullavoro originale in linguainglese.

Nomenclatura.In accordocon la corrente pratica, abbia-mo utilizzato in maniera con-

zione a 280 e 310 nm.L’uscita del sistema HPLC

era splittata (9:1) all’interfac-cia ESI dell’analizzatore dimassa. Spettri di massa elet-trospray nell’intervallo di m/z100-1500 venivano registratiin modalità positiva. Il vol-taggio del cono (CV) eraimpostato in modalità scan-sione a 40 V per le identifica-zioni basate sul picco del-l’aglicone, e a 25 V perl’identificazione basata sia sulframmento dell’aglicone chesullo ione molecolare. Iseguenti ioni (m/z) venivanomonitorati per la quantifica-zione: 229.1 (CV 25 V) pertrans- e cis-resveratrolo,229.1 (CV 40 V) per trans- ecis-piceid, 455.2 (CV 60 V )per i dimeri, 681.2 (CV 70 V)per trimeri, 907.2 (CV 80 V)per tetrameri.

Analisi Q-TOF. Spettri dimassa ad alta accuratezzasono stati acquisiti medianteuno spettrometro di massaHDMS-Q-TOF Synapt con

sistema di ionizzazione elet-trospray (ESI) e softwareMassLynx 4.1. L’analisiHDMS è stata realizzatadopo separazione nelle condi-zioni cromatografiche descrit-te nella sezione precedente,con modalità negativa e nel-l’intervallo di m/z 50-3000Da. Lo spettrometro era cali-brato utilizzando sodio for-miato, e leucine enkephalinveniva usato per la lock mass.I dati sperimentali sono ripor-tati in Tab. 1. In queste condi-zioni lo strumento è accredi-tato di produrre dati speri-mentali con una accuratezzaentro ±3 ppm.

Esperimenti NMR. Glispettri 1H (400 MHz) e 13C(100 MHz) NMR di tutti glioligomeri misurati sono statiregistrati in d6-acetone(99.90% CD3COCD3) a 298K su uno spettrometro NMRBruker-Avance 400 MHzNMR, utilizzando un probe 5mm BBI con 900 proton pulselength di 8.7 µs alla transmis-


per permettere di ottenere ilprofilo dei metaboliti delleviti infettate. L’analisi è statarealizzata su un sistemaMicromass ZQ LC-MS com-pleto di una pompa HPLCWaters 2690 e detector DADWaters 996 gestito da softwa-re Empower. La separazioneè stata ottenuta su una colon-na cromatografica ZorbaxSB-Aq, 5 um, 2.1x150 mm,con precolonna Zorbax SB-Aq, 5 um, 2.1x12.5 mm. Lafase mobile consiste di acidoacetico 0.1% in H2O (A) eacetonitrile (B). La separazio-ne è stata condotta a 40 °C in27 min, nelle seguenti condi-zioni: Gradienti lineari a par-tire da 5% B, al 70% B in 25min, al 95% B in 0.1 min,95% B mantenuto per 2 min,alle condizioni iniziali (5% B)in 0.1 min. La colonna venivaequilibrata per 7 min prima diogni analisi. Il flusso era 0.25mL/min ed il volume di inie-zione 6 μL. Gli spettriUV/Vis venivano registratitra 220 e 400 nm, con rileva-

Fig. 2 - Il rapporto di assorbanza (A280/A230), quindi tra le bande UV IIe III degli stilbenoidi

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lavaggio acquoso, con penta-no-diclorometano e con meta-nolo. Questa purificazione ini-ziale ha permesso di incre-mentare i segnali di stilbeni estilbenoidi, in precedenzasovrapposti e parzialmentecoperti da altri interferenti, neicromatogrammi HPLC-DAD-MS. Una seconda cromato-grafia flash su resina HW40S

ha permesso una ulteriorepurificazione dell’estratto, tra-mite la raccolta dei soli com-posti eluenti nell’intervallo40-90 min. Nell’estratto puri-ficato così ottenuto, tutti icomposti target sono statirecuperati, finalmente rappre-sentando i principali picchivisibili nel cromatogrammaHPLC-DAD-MS.

vite (9-10), una cromatografiaflash su una resina formata dalcopolimero polistirene-divi-nilbenzene (Isolute ENV+) ciha permesso di eliminare conefficienza la maggior parte deimetaboliti primari, quali car-boidrati, acidi organici, ami-noacidi e clorofille, e metabo-liti secondari quali le proanto-cianidine, nelle tre frazioni di

sistente la nomenclaturatrans- e cis- per descrivere lastereochimica agli anelli satu-ri, mentre si è utilizzata lanomenclatura Z-/E- perdescrivere la sterochimica deidoppi legami. I nomi utilizza-ti in questo studio, assiemecon i nomi triviali utilizzati inletteratura, sono i seguenti: Z-ε-viniferin (sin. cis-ε-vinife-rin); E-ε-viniferin (sin. trans-ε-viniferin); E-δ-viniferin(sin. trans-δ-viniferin, trans-resveratrol dehydrodimer); Z-miyabenol C (sin. cis-miya-benol C); E-miyabenol C (sin.trans-miyabenol C).

Risultati ediscussione

Infezione della vite, estra-zione dalle foglie e fraziona-mento. In una indagine preli-minare a mezzo HPLC-DAD-MS, avevamo osservato chenelle foglie infette con P. viti-cola raccolte dalla progeniedell’incrocio di Merzling xTeroldego si notava la forma-zione, in aggiunta a trans-resveratrolo, trans-piceid e E-ε-viniferin, di numerosi altristilbeni e stilbenoidi, ed innumero superiore a quello deicomposti noti finora isolatinella vite (risultati non pub-blicati). La accurata identifi-cazione e quantificazione diquantità minute di viniferinein una matrice complessaquale l’estratto da foglia èparticolarmente impegnativa.A questo punto risultavaovvio che prima di poterdescrivere la interazione travite e P. viticola in questapopolazione, era necessarioisolare e caratterizzare questinuovi metaboliti. Diciottogenotipi alti produttori di stil-benoidi sono stati selezionatida questa popolazione e que-ste piante sono state infettate,le loro foglie apicali raccolte,riunite ed estratte con meta-nolo, con una resa tale da per-metterci di intraprenderel’isolamento in quantità suffi-cienti alla caratterizzazionestrutturale.

La pre-purificazione del-l’estratto grezzo è stata realiz-zata in due passaggi. In accor-do con risultati precedenti congli stilbenoidi dalle radici di

Fig. 3 - Isolamento finale per cromatografia in fase inversa delle settefrazioni ottenute dalla colonna diolo

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so di raccogliere 14 frazionicontenenti da 0.13 fino a 5.46mg (Tab. 1) di oligomeri puri,per un totale di 14.74 mg.

Queste frazioni sono stateetichettate con un codicenumerico sequenziale a duecifre, la prima indicante l’or-dine di eluizione nella colon-na in fase normale (Fig. 1) ela seconda l’ordine di eluizio-ne nella separazione in faseinversa (Fig. 3).

Caratterizzazione struttu-rale dei composti isolati.Una conferma della strutturadegli oligomeri isolati è stataottenuta per spettrometria di

massa ad alta risoluzione inmodalità negativa. Per tutti èstato possibile ottenere unottimo match rispetto allamassa teorica, inferiore a 3ppm con l’eccezione di trecomposti e comunque sempreinferiore a 5 ppm (Tab. 1).

Lo studio dello spettro UVci ha dato altre informazionipreliminari. Il cromoforo stil-benico è essenzialmentecaratterizzato dalla presenzadi tre bande, convenzional-mente chiamate come I, II eIII (11). La banda I è localiz-zata tra 308 e 336 nm mentrela banda II è nella regione

281-313 nm. Mostrano tipica-mente dei coefficienti diestinzione molare elevati esono in diretta relazione allaprensenza di un doppio lega-me coniugato in configurazio-ne E (cioè trans). La bandaIII, situata intorno ai 230 nm,è più debole ed essenzialmen-te dovuta alla presenza diunità fenoliche. La presenzadi un cromoforo cis-stilbenicoda origine ad uno spettro dif-ferente, con un massimo diassorbimento (banda II) diminore intensità e più cortalunghezza d’onda rispettoall’isomero trans (11).

Oltre ai coefficienti di estin-zione molare, abbiamo misu-rato il rapporto tra le assor-banze A280/A230 che erastato suggerito essere infor-mativo per l’assegnazionedella struttura (12). Il rapportoA280/A230 è stato trovatoassumere (Fig. 2) valori bassi(0.22-0.28) per cinque stilbe-noidi oligomeri. Valori inter-medi sono stati trovati per i treoligostilbeni trimeri (0.37-0.38) e per gli oligostilbenidimeri (0.38-0.52). I valoripiù elevati erano quelli deimonomeri del trans-resvera-trol0 (1.00-1.10).

Sono stati condotti molte-plici esperimenti NMR al finedi chiarire ciascuna struttura,inoltre i valori sperimentali didicroismo circolare ed α sonostati acquisiti e successiva-mente discussi per ciascuncomposto, dove appropriato.Gli stilbenoidi oligomeri pos-siedono tre caratteristichestrutturali peculiari che devo-no essere definite con chia-rezza per poter definire leloro strutture: 1) la stereochi-mica dei doppi legami esoci-clici, 2) la posizione regiochi-mica dei gruppi 4-idrossifenile 3,5-diidrossifenil ai C7/C8 e3) la stereochimica relativa (oeventualmente assoluta) deicentri chirali C7 e C8. Ilprimo compito è semplicedato che la grandezza delparametro 3J (H7,H8) è dia-gnostica della stereochimicadel doppio legame in configu-razione Z (11-13 Hz) o E (15-17 Hz). Il secondo compito, ladefinizione della regiochimicaai vari centri C7/C8, richiedeesperimenti HMBC. Di solito,l’esame delle risonanze 2D-

Fig. 4 - Strutture degli stilbenoidi dimeri nelle foglie di vite: Z-ε-viniferin(1), E-ε-viniferin (2), E-ω-viniferin (3), Z-ω-viniferin (4), pallidol (6), E-am-pelopsin D (7), E-quadrangularin A (8) e di un prodotto di condensazionetra (+)-catechina ed acido trans-caffeico (5)

La colonna diolo ci ha per-messo di frazionare in manie-ra efficace l’estratto purifica-to, ottenendo sette frazioniche risultavano separate inbase alla loro taglia ed affinità(Fig. 1). La caratterizzazionedei composti ha confermato laseparazione dei dimeri (fra-zioni 1, 2 e 3) dai trimeri (fra-zioni 3, 4 e 5) e tetrameri (fra-zioni 6 e 7). Ciascuna dellesette frazioni ottenute per cro-matografia in fase normale èstata quindi ulteriormenteseparata per cromatografia infase inversa. Questa tecnicacomplementare ci ha permes-

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doppio legame stilbenico inconfigurazione cis, e datiNMR (Fig. 4) e CD in accor-do con la struttura della Z-ε-viniferin. In particolare, unaassegnazione completa e unadiscussione dettagliata deidati NMR per Z-ε-viniferin eper tutti gli altri composti notiè disponibile nelle SupportingInformation dell’articolo ori-ginale in lingua inglese, libe-ramente scaricabili online.

Questo composto è statodescritto come un prodottodella isomerizzazione indottadalla luce della E-ε-viniferinestratta dalle foglie di vite (3).Considerando che questocomposto era meno del 5%dell’isomero E (Tab. 1) e chenon era osservato nelle analisidegli estratti da foglia freschi,pensiamo che la sua presenzadi dovuta alla formazionedurante l’isolamento, nono-stante che l’intero processosia stato fatto con protezionedalla luce. Ha conservato lastessa configurazione assolutaosservata nell’isomero E (2).

(+)-E-ε-viniferin (2). Lospettro di massa del picco iso-lato nella frazione 1.2 (Fig. 3)corrisponde con quello di unresveratrolo dimero, con

assorbimento UV e coeffi-ciente di estinzione molecola-re (ε 319.0 = 30633 M-1 cm-1; ε280.0 = 24781 M-1 cm-1) inaccordo con la presenza di undoppio legame stilbenico inconfigurazione E, e datiNMR (vedi SupportingInformation, versione inglese)(Fig. 4), CD ed α in accordocon la struttura della (+)-E-ε-viniferin (2). L’isolamento diuna sola e specificamente dis-simmetrica struttura trans-, lacui configurazione assolutaall’anello trans-diidrobenzo-furanico è stata completamen-te assegnata e trovata avereentrambi i centri chirali inconfigurazione S, ha confer-mato la alta specificità dellareazione di dimerizzazionedel resveratrolo, come giàriportato (3).

La presenza di questocomposto è molto importan-te, data la alta bioattivitàriportata per E-ε-viniferincontro il rilascio di zoosporeda sporangi di P. viticola(50% inibizione a 19 μg/mL)e contro la mobilità dellezoospore successivo al lororilascio (50% inibizione a12.5 μg/mL), come pure nelcombattere la germinazionedei conidi di Botrytis cinerea

(50% inibizione a 100μg/mL). Inoltre, E-ε-viniferine trans-resveratrolo sono imattoni utilizzati per costrui-re diversi alti oligomeri.

ω-viniferins (3 e 4). Lospettro di massa del picco iso-lato in frazione 1.4 (Fig. 3)corrisponde a quello di unamiscela di due resveratrolidimeri, con assorbimentomassimo UV (294.5 nm) ecoefficiente di estinzionemolecolare intermedi (ε 294.5 =13947 M-1 cm-1), compatibilecon la presenza di una misce-la di stilbeni con il doppiolegame in configurazioniZ+E. I dati NMR (Fig. 4) eCD erano in accordo con lapresenza di una miscela didue nuovi isomeri della ε-viniferin, che abbiamo chia-mato ω-viniferine (Fig. 4). Sitratta di viniferine minori,dato che la quantità ottenutaera circa 6.5 inferiore rispettoa quella del maggiore dimeronell’uva, E-ε-viniferin (2).

I dati NMR e MS hannosuggerito che questi duedimeri del resveratrolo fosse-ro due isomeri strutturali diE- e Z-ε-viniferin. Dato chenon è stato trovato alcun cam-biamento nella connettività

HMBC degli H7 ed H8 per-mette di definire la principaleconnettività tra gli atomi del-l’intero oligomero. Il terzocompito può essere considera-to il più difficile, per il fattoche negli anelli a cinquemembri anche piccole modifi-che nella geometria possonoalterare in modo significativol’angolo diedro tra i nucleiaccoppiati H7/H8, causandoampie variazioni nei valoridelle loro costanti di accop-piamento. Nonostante siageneralmente accettato chenei 2,3-benzodiidrofurani(come pure nei 2,3-diidrofura-ni) il 3Jcis (5-10 Hz) sia mag-giore che 3Jtrans (1-9 Hz) (13),non si può pervenire ad unaassegnazione definitiva dellastereochimica usando sola-mente la dimensione degliaccoppiamenti, a meno chenon sia stato attentamenteinvestigato uno specifico pat-tern di sostituzioni o di siste-mi eterociclici, oppure siastata condotta una completaanalisi conformazionale. Diconseguenza, questa assegna-zione stereochimica deveessere valutata mediante espe-rimenti di irradiazione seletti-va 2D-NOESY e/o NOE1D.Se tramite irradiazione dellarisonanza H-7 viene osservatoun marcato NOE (» 10%) sulsegnale del H-8 vicinale, que-sto implica una vicinanza spa-ziale dei protoni coinvolti e sipuò convalidare quindi unaconfigurazione cis al C7/C8,mentre quando si rileva soloun modesto NOE (» 1-2%), idue protoni sono attesi esserein posizione trans.

Eventualmente, gli shift 13Cdei C7 e C8 possono discrimi-nare tra le configurazioni rela-tive cis e trans 2,3 a causadell’effetto schermante di unatomo di carbonio in configu-razione cis- in posizione g(effetto-g) (14).

I dimeriZ-ε-viniferin (1). Lo spettro

di massa del picco isolatonella frazione 1.1 (Fig. 3)corrisponde a quello di unresveratrolo dimero, conassorbimento UV e coeffi-ciente di estinzione molecola-re (ε 280.0 = 9920 M-1 cm-1) inaccordo con la presenza di un

Fig. 5 - Strutture degli stilbenoidi trimeri nelle foglie di vite: α-viniferin(9), E-cis-miyabenol C (10), E-miyabenol C (12), Z-miyabenol C (11)

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H7a-H8a (2.34 Å) era trovataessere minore rispetto adH7a—H2a/H6a (2.68 Å )mentre la distanza H7a—H10a/H14a era valutata esse-re tanto lunga (4.19 Å) dasfuggire alla rilevazioneNOE. Il valore della costantedi accoppiamento 3J (H-7/H-8) (8.0 Hz) è superiore chenelle e-viniferine, dando ulte-riore supporto alla loro confi-gurazione cis.

Alla luce della intrinsecaelevata capacità della tecnicaNMR per l’analisi quantitati-va, precise misure 1H-NMRpermettono di ottenere unaaffidabile stima del loro rap-porto molare nella miscela. Inbase alla integrazione dellaarea relativa dei segnali NMRdei protoni di E-ω-viniferin(3) in comparazione ai segna-li di Z-ω-viniferin (4), laabbondanza relativa delprimo deve essere 66% e delsecondo 33%. Questo è statoconfermato tramite un succes-sivo frazionamento dei dueisomeri, che ha permesso diottenere i loro dati UV. E-ω-

viniferin (3) ε 318.5 = 19966M-1 cm-1 ε 280.0 = 12554 M-1cm-1; Z-ω-viniferin (4), ε 281.5= 6754 M-1 cm-1).

Prodotto di condensazionetra (+)-catechina ed acidotrans-caffeico, 5. Lo spettroMS del picco isolato in fra-zione 2.1 (Fig. 3) suggerisceuna struttura ricca di ossigeno(Tab. 1) con un debole cro-moforo UV con massimo a280.5 nm (ε 280.5 = 7344 M-1cm-1), e dati NMR e CD inaccordo con la presenza diuna prodotto di condensazio-ne tra (+) catechina e acidotrans-caffeico (Fig. 4). Lapresenza dello scheletro dellacatechina ha potuto esserededotta dai caratteristicisegnali per H2 a 4.41 (d, J =8.4 Hz). 1J etero correlato aC2 (dC 82.8) che permette distabilire la stereochimica alC2-C3. Infatti, ci si sarebbeaspettato un accoppiamentomolto piccolo J(2,3 < 1Hz)per H2 nella epicatechina. Laconfigurazione al Cb è statadeterminata dal pattern di

accoppiamento di Hb con iprotoni diastereotopici al Ca,nonostante che un veloce flip-ping dell’anello lattone porti avalori di J mediati. Piccolisegnali rilevabili nello spettro1H-NMR e DQCOSY di que-sto campione hanno indicatola presenza di un altro com-posto che potrebbe essereassegnato come il suo Cb ste-reoisomero in base a modifi-che significative nei chemicalshifts di 2Ha e Hb, mentre isegnali del nucleo della cate-china di entrambi gli stereoi-someri erano quasi sovrappo-nibili. Una simile struttura sipuò formare per accoppia-mento ossidativo C-C del car-bonio in β al carbonile del-l’acido caffeico con il C8della catechina, che vienesuccessivamente convertitonel corrispondente d lattone.

L’isolamento e caratterizza-zione di questo prodotto dicondensazione ha fornitol’evidenza che altri compostifenolici principali della vitepartecipano ai meccanismi diossidazione enzimatica in-

tra gli atomi e/o nella posizio-ne regiochimica dei nucleiaromatici in base alle misureHMBC-NMR, le differenzeosservate sui dati NMR devo-no essere indotte da una diffe-rente relazione stereochimicaai centri chirali C7a e C8a. Lemisure NOESY ci hanno per-messo di stabilire che nelle ω-viniferine H7a e H8a nonerano stereochimicamentenella correlazione trans comeusuale per gli oligomeri delresveratrolo. Infatti, per tuttigli isomeri delle ω-viniferinela integrazione delle mappefuori-diagonale 2D-NOESYdi H-7a mostravano un piùforte effetto dipolare con H-8a che con H2a/H6a, mentrel’effetto NOE di H7a conH10a/H14 non era più rileva-bile. Questo risultato, cheindica una stereochimica 7,8cis, è in perfetto accordo conle distanze internucleari valu-tate nella geometria moleco-lare di questi composti comeottenuta mediante calcoliMM per entrambe le ω-vini-ferins per le quali la distanza

Fig. 6 - Strutture degli stilbenoidi tetrameri isolati dalle foglie di vite: isohopeaphenol (13), am-pelopsin H (14), isomero di vaticanol C (15) e hopeaphenol (16)

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accordo con la presenza di undoppio legame stilbenico inconfigurazione E che assorbea 313.5 nm, e spettri NMR inaccordo con la presenza diuna miscela 1:1 di due com-posti già identificati quali stil-beni costitutivi di alcuneVitaceae, rispettivamenteampelopsin D (7) (23-24) e ilsuo regioisomero, quadrangu-larin A (8) (25) (Fig. 4).L’attribuzione della strutturadi questi isomeri trans- harichiesto qualche attenzione ela comparazione con un’altrastruttura simile, parthenocis-sin A (26) a causa delle infor-mazioni conflittuali riportatenelle referenze citate. Al con-trario di quanto riportato inletteratura (25), dove si asseri-sce che “i dati NMR di ampe-lopsin D (23) sono moltosimili a quelli di quadrangula-rin A e la sua struttura dovreb-be attualmente essere la stessadi quadrangularin A”, noiconfermiamo qui che unaattenta analisi dei dati NMRdel nostro campione che con-tiene entrambi i dimeri inquantità quasi equimolecolariporta alla definitiva dimostra-zione che queste strutturesono diverse, in accordo conla controindagine spettrosco-pica di Niwa et al (27).

È stato suggerito (24) che(-)-ampelopsin D (7) vienesintetizzata dalle Vitaceae dalsuo precursore (+)-E-ε-vini-ferin (2), attraverso una ini-ziale protonazione acida del-l’atomo di ossigeno all’anellodiidrofuranico, seguita daattacco nucleofilo del doppiolegame e formazione di unanello intermedio a cinquemembri, che si deprotona performare (-)-ampelopsin D (7).Un tale meccanismo, chepotrebbe giustificare la pre-senza di questo composto, èperò incompatibile con la for-mazione di quadrangularin A(24,27). Una reazione stereo-selettiva, che apparentementesegue una ciclizzazione bio-mimetica di stilbeni naturalidurante la oligomerizzazioneossidativa, è stata dimostratacapace di produrre sia ampe-lopsin D che quadrangularinA, attraverso diversi meccani-smi (28). La presenza sia diampelopsin D (7) che qua-drangularin A (8) in ibridi di

V. vinifera è qui riportata perla prima volta.

I trimeriα-viniferin (9). Lo spettro

MS del picco isolato in fra-zione 3.2 (Fig. 3) corrispondea quello di un resveratrolo tri-mero, con un cromoforo UVdi media intensità (ε 282,5 =6265 M-1 cm-1) e A280/A320= 0.238 (Fig. 2), compatibilecon la presenza di anelli feno-lici isolati. I dati NMR, UV eCD erano in accordo con lastruttura nota della α-viniferin(Fig. 5), che era il primo stil-benoide con proprietà anti-fungine scoperto nelle fogliedi vite infettate da B. cinerea(29). Questo composto è statoriportato anche in foglie divite infettate con P. viticola,ma non in foglie irraggiatecon luce UV (30). Nel nostrocaso, le quantità isolate eranosufficienti a fornirci per laprima volta il suo spettro 13CNMR e potere ottico rotato-rio, confermando una struttu-ra dissimmetrica con [α]589(MeOH, c=0.14) = -46.

Secondo Langcake e Pryce(3), α-viniferin inibisce il rila-scio di zoospore da sporangidi P. viticola, inibisce lamotilità delle zoospore dopoil loro rilascio ed è anche par-ticolarmente attiva nei con-fronti della germinazione deiconidi di B. cinerea. Dopo glistudi pioneristici di Pryce eLangcake (29), la presenza diquesto composto, come puredi altre presunte viniferinenon caratterizzate struttural-mente, quali β-viniferin e γ-viniferin (3), è stata trascura-ta, forse per la difficoltà diidentificarla e caratterizzarla.Ne consegue che il nostro stu-dio conferma per la primavolta la presenza di α-vinife-rin (9) in foglie di vite infetta-te con P. viticola.

E-cis-miyabenol C (10). Lestrutture molecolari di 10, 11e 12 erano strettamente corre-late. Lo spettro MS di 10, iso-lato in frazione 4.1 (Fig. 3)era quello di un resveratrolotrimero, con un forte cromo-foro UV (ε 320,5 = 11096 M-1cm-1, ε 280.0 = 8935 M-1 cm-1)compatibile con la presenza diun doppio legame trans-stil-

benico nella struttura. I datiNMR e CD erano in accordocon un nuovo stereoisomerodi E-miyabenol C (Fig. 5).Una attenta analisi in NMRdelle tracce HMBC suggeri-sce la stessa connettività degliatomi come per E-miyabenolC (12) ma le misure NOESYindicavano un effetto dipolareNOE molto forte del doppiet-to δH 3.71 (H8a) con il suoprotone vicinale H7a a δH5.66 e un medio NOE conH8b. Così, abbiamo ottenutoevidenza per suggerire qui lastereochimica 7a,8a cis per ilcomposto 10. Forti differenzenelle frequenze in 13C e 1H-NMR per quasi tutti i nucleinella parte sinistra della strut-tura (quella che contiene lagiunzione con l’anello cis) eforti similarità dei δ per quelledalla parte opposta supporta-no la nostra assegnazione.Anche i calcoli MM confer-mano questa ipotesi, sugge-rendo una struttura a geome-tria ottimizzata dove gli angolitorsionali H7a-H7b e H8a,H8b sono trovati essere ri-spettivamente -240 e 1490,por-tando a valutazioni diJ(7a,8a)=6.8 Hz e J(7b,8b)=8.9 Hz, in buon accordo coni loro valori sperimentali.

Questo nuovo stereoisome-ro del miyabenol C potrebbederivare dalla addizione di unsingolo intermedio trans-resveratrolo ossidato, con ilradicale in posizione α suldoppio legame stilbenico, adun anello m-difenolo deldimero (+)-E-ε-viniferin. Lastereochimica di (+)-E-ε-vini-ferin viene completamenteritenuta, mentre l’anello dii-drofurano di nuova formazio-ne ha la stessa, poco comunestereochimica cis- già trovatenelle ω-viniferine (3,4). Unasimile stereochimica nellacondensazione della unitàresveratrolo terminale è giàstata osservata nella formazio-ne del tetramero kobophenolA da E-miyabenol C nelleradici di Carex kobomugiOhwi (31).

Z-Miyabenol C (11). Lospettro MS del picco isolatoin frazione 5.1 (Fig. 3) corri-spondeva ad un resveratrolotrimero, con forte cromoforoUV (ε 281,5 = 14025 M-1 cm-1),

dotti dalla interazione con ilpatogeno. Questo ha fornitouna conferma indipendentedel coinvolgimento di altricomposti fenolici costitutivinella resistenza di P. viticola(15). Svariati fenoli e catecolisono peraltro stati dimostratiessere forti inibitori delle lac-casi di B. cinerea. Attraversol’inibizione della stilbeneossidasi, i composti fenolicicostitutivi potrebbero attenua-re la difesa contro Botrytis,preparando un `terreno sicu-ro’ per le classiche fitoalessi-ne (16).

Pallidol (6). Lo spettro MSdel picco isolato in frazione2.2 (Fig. 3) corrisponde aquello di un resveratrolodimero. Sia i dati NMR, cheCD ed α erano in accordo conla struttura nota del pallidol(Fig. 4) (17,19). Questo stil-benoide è conosciuto peressere facilmente prodotto datrans-resveratrolo trattato concolture di Botrytis cinerea(20) o con perossidasi (21).Nell’ultimo caso, è statariportata la produzione di (±)-pallidol. La mancanza di atti-vità ottica potrebbe non esse-re dovuto alla racemizzazionedei suoi centri chirali, ma allaintrinsecamente bassa dissim-metria della intera molecolache contiene infatti un asseinterno di simmetria C2.Sebbene, in principio, la pre-senza di questo elemento disimmetria non faccia diventa-re il pallidol una molecolaachirale, potrebbe diminuirele sue proprietà chirottiche.Vale la pena di ricordare che idati NMR del composto “4”riportato in Kulesh et al., (22)come (-)-pallidol otticamenteattivo non sono in accordocon i dati NMR di campionidi pallidol e sono chiaramenteinconsistenti con qualsiasiragionevole struttura di dime-ro del resveratrolo.

Ampelopsin D (7) e suoregioisomero, quadrangularinA (8). Lo spettro MS delpicco isolato in frazione 3.1(Fig. 3) corrisponde a quellodi un resveratrolo dimero, conassorbimento UV e coeffi-ciente di estinzione molecola-re (ε 313.5 = 24573 M-1 cm-1, ε280.0 = 15261 M-1 cm-1) in

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in frazione 6.1 (Fig. 3) corri-sponde a quello di un resvera-trolo tetramero, con cromofo-ro UV di media intensità (ε281,0 = 10929 M-1 cm-1) eA280/A320 = 0.266 (Fig. 2),in accordo con la assenza diconiugazione tra gli anellifenolici. I dati NMR, CD e aerano compatibili con la strut-tura nota del tetramero sim-metrico isohopeaphenol (13,Fig. 6), una viniferina giàcaratterizzata nel legno dellaV. vinifera ‘Kyohou’ (34).

La struttura di isohopeaphe-nol è stata chiarita per compa-razione con i dati NMR dihopeaphenol 16 (Fig. 6). Inostri dati NMR sono in buonaccordo con quelli di Ito et al.(34) per isohopeaphenol, que-sti autori non hanno riportatoperò il solvente NMR utiliz-zato. La stereochimica relati-va ai centri chirali è stata con-fermata da esperimentiNOESY.

Isohopeaphenol è statoosservato qui per la primavolta, come il composto isola-to in quantità di gran lungamaggiore dalle foglie di viteinfettate da P. viticola (Tab.1). Hopeaphenol, un isomerostrutturalmente molto simile,è stato isolato come stilbenoi-de costitutivo delle radici diV. vinifera cv. Chardon-nay,dove la sua concentrazioneera nell’intervallo 0.5-8 mg/gdi radice fresca (9).

Ampelopsin H (14). Lospettro MS del picco isolatoin frazione 7.1 (Fig. 3) corri-spondeva con un resveratrolotetramero, con cromoforo UVdi media intensità (ε 281,0 =12710 M-1 cm-1), e A280/A320 = 0.253 (Fig. 2), inaccordo con l’assenza diconiugazione tra gli anellifenolici. Sia i dati NMR cheCD erano in accordo con lapresenza di un tetramero sim-metrico, con la struttura di underivato del pallidol, corri-spondente a quella di ampe-lopsin H (14, Fig. 6) (23).Una struttura non osservata inprecedenza nella vite.

Ampelopsin H è un tetra-mero simmetrico con un asseC2 che causa l’equivalenzachimica degli atomi di idro-geno e carbonio nelle unità Ae B con quelle rispettivamen-

te delle unità D e C. Una evi-dente differenza con il palli-dol, è che ampelopsin Hmostra un forte effetto Cottonnel suo spettro CD, indicandoche questo composto dovreb-be essere enantiomericamentepuro.

Le unità A e D con identicaconfigurazione relativa edassoluta ai centri chirali 7a,8ae 7d, 8d legati al sistema adanello interno del pallidol(unità B e C) sembra rafforza-re la dissimmetria complessi-va di questa molecola.

Questo tetramero potrebbederivare dalla addizione didue intermedi ossidati trans-resveratrolo, entrambi con ilradicale in posizione α, suldoppio legame stilbenico, aciascuno degli anelli m-dife-nolo del dimero pallidol (2.2).La stereochimica del pallidolviene completamente conser-vata al centro del tetramero(Fig. 6), mentre entrambi glianelli diidrofuranici di nuovaformazione hanno la stereo-chimica trans, in base allemisure NOESY.

I trimeriUn isomero di vaticanol-C

(15). Lo spettro MS del piccoisolato in frazione 7.2 (Fig. 3)corrispondeva a quello di unresveratrolo tetramero, con uncromoforo UV di mediaintensità (ε 281,0 = 14832 M-1cm-1), ed A280/A320 = 0.280(Fig. 2), in accordo con l’as-senza di coniugazione tra glianelli fenolici. Sia i datiNMR, CD che la rotazioneottica erano in accordo con lapresenza di un tetrameroasimmetrico, con un caratteri-stico sistema dibenzobici-clo[3.2.1]ottadiene, contenen-te due anelli diidrofurano coni loro costituenti fenolici inconfigurazione trans- (Fig.6). Mentre i dati NMR delleunità parziali A e D sonofacilmente assegnabili attra-verso tecniche 2D-NMR, l’in-terpretazione degli stessi datiera molto più complessaquando si rivolge l’attenzionealla parte centrale (unità B eC) di questo composto.L’analisi era complicata nonsolo dalla limitata quantità diquesto tetramero ma, princi-palmente, dalla presenza di

svariati picchi di scambio-poco risolti, nel suo spettro1H e per il basso rapportosegnale rumore negli spettriHSQC e HMBC. In particola-re i segnali dei protoni accop-piati in orto ad H2c/H6c (6.92ppm) e H3b/H5b (6.55 ppm)appaino come dei doppiettimolto larghi, indicando quin-di una rotazione ostacolataattorno al legame singoloC1c-C7c. Dato che quattroatomi di idrogeno methinepossono essere assegnati perla loro caratteristica risonanzaH/C alle posizioni benziliche7b/8b e 7c/8c, assumiamo chela struttura di questo tetrame-ro dovrebbe essere quella diun isomero di vaticanol C, masono necessarie più dettaglia-te misure NMR a partire dauna quantità maggiore distandard di 15 per definire lasua struttura.

Il Vaticanol C non è maistato riportato in Vitis, mentreè stato già isolato nel legnodel fusto di Vatica rassak(Dipterocarpaceae) (35)durante una ricerca di stilbe-noidi con proprietà anticancroed epatoprotettive. E’ statotrovato recentemente che è unforte inibitore delle Matrixmetalloproteinases (MMPs)(36). La particolare strutturadell’isomero di vaticanol Cpotrebbe forse derivare dauna condensazione diretta didue unità di E-ε-viniferin, checondensando attraverso idoppi legami stilbenici, pro-ducono un sistema a dibenzo-biciclo ottadiene. Questosarebbe consistente con ilfatto che i dati NMR sonocompatibili con l’ipotesi chesia conservata la configura-zione di 2 ad entrambi glianelli diidrofuranici.

In conclusione, tre tetramerisono stati isolati per la primavolta da foglie di vite infettatecon P. viticola. È probabileche uno di questi corrispondacon la viniferina non caratte-rizzata osservata da Langcakee Pryce (3). Le quantità eranodecisamente elevate, cioècomparabili con quelle di E-ε-viniferin (Tab. 1).

Meccanismo di formazio-ne delle viniferine. Gli enzi-mi necessari per la formazio-ne delle viniferine sono

in accordo con la presenza diun doppio legame cis-stilbe-nico nella struttura. Sia i datiNMR che CD erano in accor-do con la struttura di Z-miya-benol C (11) (Fig. 5) (31) chenon era mai stato riportato invite.

I dati NMR per questocomposto sono quasi sovrap-ponibili a quelli di miyabenolC nelle unità A e B, mentre cisono significative differenzenei dintorni della unità C aconseguenza della presenzadel doppio legame Z 7c/8c.Le stereochimiche relativa suicentri chirali 7a/8a e 7b/8b èstata stabilita essere trans inbase agli effetti NOE dei cor-rispondenti segnali dei proto-ni. Inoltre la forte NOEosservata tra H8a e H8b nellospettro NOESY ha suggeritouna relazione cisoide in que-sta struttura.

E-Miyabenol C (12). Lospettro MS del picco isolatoin frazione 5.2 (Fig. 3) corri-spondeva a quello di unresveratrolo trimero e sia idati NMR che CD erano inaccordo con la struttura di E-miyabenol C (12, Fig. 5). Inostri dati NMR e CD eranoin buon accordo con la lette-ratura (31-32). In particolare,la stereochimica dei benzodii-drofurani al C7a/C8a eC8a/8b è stata confermataessere trans e, come osserva-to in 11, è stata osservata unarelazione cisoide di H8arispetto ad H8b. La quantitàdi 12 recuperata dalle nostrefoglie di vite era la terza piùalta tra tutte le viniferine, e lamaggiore tra i trimeri (Tab.1). Questo è in buon accordocon l’osservazione che la suaformazione richiede la addi-zione di un radicale resvera-trolo a 2, che è il principaledimero, ripetendo lo stessomeccanismo che aveva porta-to alla formazione di 2, cosìda ottenere la stereochimicadi 12. E-Miyabenol C vienequi riportato per la primavolta nelle foglie di vite. Lavite è capace di sintetizzarlo,dato che è già stato isolato trai trimeri costitutivi dei germo-gli di V. vinifera (33).

Isohopeaphenol (13). Lospettro MS del picco isolato

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delle viniferine nel nostro stu-dio e quelli ottenuti neglistudi precedenti (40,41,42,43,44), potrebbe essere dovu-ta a differenze nelle varietà divite e nei metodi utilizzati, edè compatibile con l’ipotesiche sia la pianta, piuttosto cheil patogeno, ad essere respon-sabile per il complesso pat-tern di viniferine osservatonelle viti infettate da P. viti-cola. In prospettiva, per valu-tare se il risultato di questostudio sia generalizzabile,sarebbe molto interessantestudiare altri genotipi resi-stenti nel confronto con diver-si patogeni, al fine di analiz-zare il profilo di accumulazio-ne delle viniferine.

Le foglie infettate accumu-lano una quantità sostanzialedi viniferine. Si deve osserva-re che gli stilbenoidi, unaclasse di viniferine “orfane”,trascurata negli studi prece-denti, erano di gran lunga laclasse più importante dalpunto di vista quantitativo neinostri genotipi di Mer-zling xTeroldego (Tab. 1).

Nonostante le inevitabiliperdite che si producono inun complesso processo diisolamento, abbiamo potutoricavare un totale di 14.74mg di viniferine (stilbeni estilbenoidi) a partire da 517 gdi foglie, pari a 28.5 mg/kgFW. Una simile concentra-zione è considerata importan-te per spiegare la resistenzadella pianta, alla luce dellabassa concentrazione - usual-mente nell’intervallo deiμg/mL – richiesta per la bio-attività verso P. viticola.Inoltre, si deve tenere inconto che questi valori sonostati prodotti a partire dall’in-tera foglia, ed è noto chesono assenti nelle foglie sane,mentre la loro presenza èlimitata alla zona infetta e aduna sottile zona fluorescentevicinale (2). È necessarioulteriore lavoro per valutarela bioattività dei nuovi oligo-meri, che nel caso di isoho-peaphenol, E-miyabenol C,l’isomero di vaticanol C epallidol, sono importantimetaboliti di stress che siaccumulano nelle foglieinfettate dei genotipi parzial-mente resistenti di Merzlingx Teroldego.

RiassuntoNelle Vitaceae, le viniferi-

ne rappresentano un grupporelativamente ristretto di oli-gomeri del trans-resveratrolodotati di proprietà antifungi-ne, che permettono alle pian-te di resistere all’attacco deipatogeni.

Lo scopo di questo studioera di realizzare l’isolamentoe caratterizzazione strutturaledell’intera classe delle vini-ferine che si accumulanonelle foglie dei genotipi degliibridi V. vinifera (Merzling xTeroldego) infettati conPlasmopara viticola . Lefoglie infette sono state rac-colte dalle piante resistenti 6giorni dopo l’infezione. Allaestrazione con metanolosegue una prima purificazio-ne mediante cromatografiaflash usando le resine ENV+e Toyopearl HW. Due frazio-namenti complementari,rispettivamente via cromato-grafia preparativa in fasenormale seguita da cromato-grafia preparativa in faseinversa, hanno permesso diisolare 14 picchi.

I composti isolati sonostati identificati utilizzandotecniche avanzate di spettro-metria di massa, misureestensive di risonanza ma-gnetica nucleare mono ebidimensionale, UV, CD,proprietà ottiche e calcolodelle meccaniche molecolari.I risultati hanno dimostratola presenza nelle foglie infet-tate di sette dimeri (sei stil-beni e uno stilbenoide), deiquali 4 nuovi per la vite(ampelopsin D, quadrangula-rin A, E-ω-viniferin e Z-ω-viniferin), quattro trimeri (trestilbeni e uno stilbenoide),dei quali due (Z-miyabenol Ce E-cis-miyabenol C) nuovinella vite, quattro stilbenoiditetrameri, tutti nuovi nellavite, isohopeaphenol, ampe-lopsin H e un isomero simileal vaticanol C.

L’isolamento di un dimeroche deriva dalla condensa-zione della (+)-catechina conl’acido trans-caffeico indicainoltre che altri compostifenolici presenti vengonomodificati strutturalmentenei tessuti infettati da P. viti-cola.

Finanziamento. Questo lavo-ro ha avuto il supporto daiProgetti “Resveratrol” e ADP2010, entrambi finanziatidalla Provincia Autonoma diTrento, Italia.

Ringraziamenti. I nostri rin-graziamenti a FrancescoBerghi per la sua collabora-zione alla definizione deimetodi di HPLC preparativo.

Supporting Information (ininglese). S1: Schema del-l’esperimento. S2. Dati strut-turali addizionali dei compo-sti isolati. Questo materiale èdisponibile gratuitamente viaInternet (http://pubs.acs.org).

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Viniferine “inducibili” pos-sono derivare dalla oligome-rizzazione del trans-resvera-trolo nei tessuti della vitecome una strategia di difesaattiva della pianta. Sono diffi-cilmente rilevabili nelle fogliesane, e svariati articoli hannoprovato la induzione disostanziali accumuli di questicomposti nelle foglie infette.

Viniferine “metabolizzate”possono essere prodotte omodificate dal rilascio dienzimi esocellulari rilasciatidal patogeno nel tentativo dieliminare indesiderabili com-posti tossici.

Il profilo delle viniferinetrovato nelle foglie infette divite non presenta alcune delleviniferine costitutive riportatenei tessuti di vite sani, qualiad esempio ampelopsin A ehopeaphenol (9), r-viniferin(37), r-2-viniferin (10), gnetinH (37), trans-miyabenol C(33), trans-amurensin B,amurensin G e ampelopsin F(45).

Mentre la presenza neinostri genotipi parzialmenteresistenti di numerose vinife-rine otticamente attive, piutto-sto che di racemi, suggerisceun alto livello di controllodella biosintesi, supportandola teoria delle viniferine“inducibili”, non è stato pos-sibile escludere la possibilepresenza di metaboliti dovutia laccasi e perossidasi fungi-ne. Non abbiamo osservato lapresenza di δ-viniferin né dialcun altro stilbenoide che siaformato attraverso il coinvol-gimento di un radicale diresveratrolo del tipo C (21).

La differenza tra il pattern

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“Translated, adapted and re-produced with permission fromJ. Agric. Food Chem., 2011, 59,5364-5375. Copyright 2011American Chemical Society.This is an unofficial translationof an article that appeared inan ACS publication. ACS hasnot endorsed the content of thistranslation or the context of itsuse.”

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