QUANTIFICAZIONE DI RESVERATROLO, PICEIDE, … et... · È stata utilizzata una popo-lazione F1...

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L’ENOLOGO � LUGLIO/AGOSTO 2013

QUANTIFICAZIONE DI RESVERATROLO,PICEIDE, PTEROSTILBENE E 11VINIFERINE INDOTTE DA P. VITICOLAIN FOGLIE DI VITI RESISTENTIQuesto è il primo articolo che riporta una analisi metabolica dettagliata,con identificazione e quantificazione, delle principali viniferine presenti in foglie di vite dopo infezione con Plasmopara viticola, mediante uso degli standard corrispondenti. L’analisi è stata condotta mediante LC-MS,utilizzando una colonna a fase inversa.

IntroduzioneGli stilbenoidi sono fenoli

derivanti dalla via metabolicadei fenilpropanoidi e dell’ace-tato-malonato, che è presentein molte famiglie di piante.All’interno delle Vitaceae, glistilbenoidi costituiscono ungruppo relativamente ristrettodi molecole che derivanodalla struttura del trans-resve-ratrolo e rappresentano leprincipali fitoalessine note. Lasintesi di stilbeni nell’uva può

essere costitutiva (Pezet ePont 1988, Korhammer et al.1995, Mattivi et al. 1995) oindotta in risposta a stress bio-tici ed abiotici (Langcake ePryce 1976 Langcake e Pryce1977, Adrian et al. 1996,Sarig et al. 1997, Douillet-Breuil et al 1999, Cantos et al.2001) o da elicitori (Bru et al.2006, Zamboni et al. 2006).

Gli stilbeni hanno suscitatogrande interesse a causa delleloro proprietà antifungine(Hoos e Blaich 1990, Adrian

et al. 1997), in particolareLangcake e Pryce (1977)hanno caratterizzato una seriedi fitoalessine con attivitàantifungina in diverse speciedel genere Vitis. Inoltre è statodimostrato che la presenza diresveratrolo è strettamentecorrelata alla resistenza allemalattie in molte specie divite (Dercks e Creasy 1989,Adrian et al. 1997). Oltre alresveratrolo, anche altri stilbe-noidi derivanti dalla sua dime-rizzazione ossidativa, sono

1Urska Vrhovsek1Giulia Malacarne

1Domenico Masuero2Luca Zulini

Graziano Guella1Marco Stefanini1Riccardo Velasco

1Fulvio Mattivi1Fondazione Edmund Mach, Centro

Ricerca ed Innovazione -San Michele all’Adige (TN)

2Laboratorio di Chimica Bio-organica,Dipartimento di Fisica,

Università di Trento

DOCUMENTO

TECNICO

U. Vrhovsek

Parole chiave: stilbenoidi, vi-niferine, HPLC-DAD-MS,Vitaceae, Plasmopara viticola

Doc tecnico_Vrhovsek_doc tecnico 17/06/13 11.59 Pagina 81

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utilizzato è il sistema di sepa-razione HPLC, accoppiatocon diversi tipi di rivelatoricome DAD (Jeandet et al.1997, Vitrac et al. 2005), fluo-rescenza (Jeandet et al. 1997)e più recentemente spettrome-tri di massa (Pezet et al 2003,Jean-Denis et al 2007, Jerko-vic et al 2007, Godard et al2009). La maggiore difficoltànell’analisi delle viniferine èla mancanza di standarddisponibili in commercio.Questo articolo descrive losviluppo di un nuovo metodoper la separazione cromato-grafica e quantificazioneaccurata delle viniferine. Anostra conoscenza è il primolavoro che descrive un’analisicapace di identificare e quan-tificare con accuratezza leprincipali viniferine accumu-late in foglie di vite in seguitoad infezione con Plasmoparaviticola grazie all’utilizzo deirispettivi standard precedente-mente isolati e caratterizzatinel nostro laboratorio (Mattiviet al., 2011).

Materialie metodi

È stata utilizzata una popo-lazione F1 derivante dall’in-crocio interspecifico traMerzling (M) (un ibrido com-plesso di V. vinifera derivanteda Vitis rupestris e Vitis lin-cecumii) e la cultivar di V.vinifera Teroldego (T), chesono rispettivamente parzial-mente resistente e suscettibilea Plasmopara viticola. Nelprimo anno, Merzling e gliindividui F1 21/122 e 21/103sono stati selezionati e utiliz-zati per ottimizzare un meto-do per l’analisi del contenutodi stilbeni nelle foglie dopoinoculazione con P. viticola.

I genotipi selezionati sonostati replicati mediante taleeinnestate sul portinnesto Ko-ber 5BB, che sono state man-tenute in una camera di cre-scita in vasi da 1 litro pienedi terriccio:sabbia:tor-ba:ver-miculite (3:1:3:3). Per F121/103 sono state eseguitedue ripetizioni, mentre perF1 21/22 e Merzling sonostate eseguite tre ripetizioni.Gli individui F1 21/74 e F121/103 sono stati campionati

attivi contro vari patogeni fun-gini della vite (Jeandet 2002).

La variabilità nella produ-zione di stilbeni è ancheinfluenzata dal genotipo edallo stadio di sviluppo dellavite (Barlass et al. 1987,Dercks e Creasy 1989, Sbaghi et al. 1995, Gatto et al. 2008)o dall’età della foglia (Stein etal. 1985). In particolare, lefoglie molto vecchie e lefoglie più giovani sembranosintetizzare meno stilbenirispetto alle altre a causa dellamaggior chiusura stomaticache limita l’entrata del patoge-no e, indirettamente, la sintesi

di stilbene (Stein et al. 1985).La tossicità di questi compostiè risultata essere correlata allaloro struttura chimica. In par-ticolare si è constatato che δ-viniferina, un dimero di ossi-dazione del resveratrolo, epterostilbene, e l’analogo 3,5-dimetossi del resveratrolo,sono gli stilbeni più tossici intermini di mobilità e sviluppodella malattia causata dall’oo-micete Plasmopara viticola(Pezet et al 2004a, 2004b,Schmidlin et al. 2008).

In letteratura si trovanodiversi metodi analitici perl’analisi delle viniferine, il più

Tab. 1 - Valore medio determinato sperimentalmente del coefficiente diestinzione molare e picco di assorbanza degli oligomeri usati come stan-dard esterni per la quantificazione

peak N° name Maximal Average molar absorbance extinction coefficient

(nm) at maximal absorbance

1 trans-caffeic acid and (+)-catechincondensation product 281 7340

3 ampelopsin D + quadrangularin A 314 24570

4 isohopeaphenol 281 10930

5 Z-ε-viniferin 280 9920

6 ampelopsin H 281 12710

7 vaticanol C-like 281 14830

8 (+)-E-ε-viniferin 319 30630

9 Z-miyabenol C 282 14030

11 Z+E-ω-viniferin 295 13950

12 α-viniferin 283 6270

13 E-cis-miyabenol C 321 11100a

Tab. 2 - Soglia di rilevabilità (LOD) e soglia di quantificazione (LOQ) per lamisura in UV-Vis (i valori sono espressi in mg/g fw)

LOD (S/N> 3) LOQ (S/N> 10)

trans-piceid 0.02 0.08

trans-resveratrol 0.01 0.05

pallidol (as Ampelopsin H) 0.15 0.51

ampelopsin D+ quadrangularin A (1:1) 0.05 0.15

isohopeaphenol 0.20 0.67

ampelopsin H 0.23 0.78

vaticanol C isomer (as Ampelopsin H) 0.15 0.51

(+)-E-ε-viniferin 0.08 0.26

Z-miyabenol C 0.03 0.09

E-miyabenol C 0.05 0.15

Z-ω-viniferin 0.29 0.97

E-ω-viniferin 0.15 0.49

α-viniferin 0.41 1.36


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anche nelle due annate se-guenti per studiare la riprodu-cibilità in tre annate diverse.

Inoculo fungino ed infe-zione delle piante.

Sporangi di P. viticola(Berk. e Curt) Berl. et DeToni sono stati raccolti dafoglie infette di V. viniferacv Pinot Gris. Le macchiebianche di sporulazione pre-senti sulla pagina inferioredelle foglie sono state spaz-zolate con acqua bidistillataper ottenere una sospensionedi conidi di 104/105 spore/ml.

L’inoculazione delle pian-te è stata ottenuta spruzzandola sospensione di conidi sullasuperficie inferiore di tutte lefoglie completamente espan-se in una camera climatica a24 ° C con 80% di umiditàrelativa.

L’esperimento di infezioneè stato eseguito in tre repli-che. Le foglie di ogni replicasono state raccolte a 0 ore, 2giorni e 6 giorni dopo l’infe-zione (dpi) con P. viticola.Tutte le foglie raccolte sonostate conservate a -20 °Cfino all’analisi.

Reagenti chimici.Acetonitrile, metanolo ed

acido acetico per HPLC sonostati acquistati da Carlo Erba(Italia), acetato di etile daBDH e acido fosforico daMerck. Il trans-resveratrolo èstato acquistato da Sigma, iltrans-4-hydroxystilbene daAldrich, il cis-resveratrolo èstato preparato dal trans-resveratrolo standard tramitefotoisomerizzazione (Mattiviet al., 1995), il trans-piceide(trans-resveratrolo-3-O-β-D-glucopiranoside) è stato isola-to dalle radici di Polygonumcuspidatum. La purezza diciascuno stilbenoide è statacontrollata mediante HPLC el’identità è stata confermatain accordo con Mattivi et al.(1995).

I composti (+)-E-ε-viniferi-na, Z- ed E-ω-viniferina, pal-lidolo, ampelopsina D, qua-drangularina A, Z-miyabeno-lo C ed E-cis-miyabenolo C,α-viniferina, isohopeapheno-lo, ampelopsina H e l’isomerovaticanolo –C-simile sonostati isolati da foglie infette divite in un precedente studio e

Tab. 3 - Accumulo di viniferine nelle foglie di 3 genotipi a diversi tempi dal-l’infezione con P. viticola. I valori sono espressi in ug/g fw (n=3)

0 2 dpi 6 dpi

F1 genotype 21/122 average sd average sd average sd

trans-piceid nd nd 0.8 1.4 5.3 0.8

trans-resveratrol 0.2 0.4 1.7 3.0 8.1 1.1

pallidol (ampelopsin H) nd nd nd nd 19.24 10.70

ampelopsin D+quadrangularin A (1:1) nd nd 1.6 1.5 11.1 6.4

isohopeaphenol nd nd 12.2 8.8 118.1 97.5

ampelopsin H + vaticanolC isomer (ampelopsin H) nd nd 3.1 2.9 57.2 23.1

(+)-E-ε-viniferin nd nd 11.1 10.8 34.5 3.4

Z+E-miyabenol C (Zmiyabenol C) nd nd 10.6 10.5 51.2 29.4

Z+E-ω-viniferin (E-ω-viniferin) nd nd 8.6 9.0 47.9 24.8

α-viniferin nd nd 2.8 3.6 68.5 78.1

E-cis-miyabenol C nd nd 3.9 3.4 49.4 46.9

trans-pterostilbene(trans-resveratrol) nd nd 0.9 1.0 8.0 6.0

F1 genotype 21/103

trans-piceid nd nd nd nd 8.8 8.0

trans-resveratrol nd nd nd nd 21.1 13.6


ampelopsin D+quadrangularin A (1:1) nd nd nd nd 67.6 17.5

isohopeaphenol nd nd nd nd 1311.7 81.5

ampelopsin H + vaticanolC isomer (ampelopsin H) nd nd nd nd 453.6 83.2

(+)-E-ε-viniferin nd nd nd nd 98.2 28.6

Z+E-miyabenol C (Zmiyabenol C) nd nd nd nd 121.3 26.4

Z +E-ω-viniferin (E-ω-viniferin) nd nd nd nd 127.1 40.2

α-viniferin nd nd nd nd 120.3 6.8

E-cis-miyabenol C nd nd nd nd 148.6 38.5

trans-pterostilbene(trans-resveratrol) nd nd nd nd nd nd

Merzling

trans-piceid nd nd nd nd 2.7 0.4

trans-resveratrol nd nd nd nd 5.7 3.6


ampelopsin D+quadrangularin A (1:1) nd nd nd nd 8.0 4.2

isohopeaphenol nd nd nd nd 147.0 70.6ampelopsin H + vaticanol

C isomer (ampelopsin H) nd nd nd nd 35.80 19.4

(+)-E-ε-viniferin nd nd nd nd 13.1 6.9

Z+E-miyabenol C (Zmiyabenol C) nd nd nd nd 10.5 2.9

Z+E-ω-viniferin (E-ω-viniferin) nd nd nd nd 9.5 2.7

α-viniferin nd nd nd nd 15.5 7.0

E-cis-miyabenol C nd nd nd nd 16.9 20.4

trans-pterostilbene(trans-resveratrol) nd nd nd nd 6.0 4.0


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zione UV-VIS a 280 nm perle forme Z e 310 nm per leforme E con il metodo dellostandard esterno. I monomeridi trans-resveratrolo, trans-piceide e IS (trans-4-hyroxy-stilbene) sono stati quantifica-ti con rilevazione a 310 nm inUV-VIS. I dimeri (+)-E-ε-viniferina, Z-e E-ω viniferina,ampelopsina D + quadrangu-larina A), i trimeri (Z-miyabe-nolo C ed E-cis-miyabenoloC e α-viniferina) e i tetrameri(isohopeaphenolo, ampelopsi-na H e l’ isomero vaticanolo-C-simile) sono stati quantifi-cati utilizzando le curve dicalibrazione dei singoli com-posti isolati.

Il loro coefficiente di estin-zione molecolare è riportatoin Tabella 1. Il pallidolo èstato espresso come equiva-lenti di ampelopsina H, iltrans-pterostilbene comeequivalenti di trans-resvera-trolo, e i valori espressi inmg/kg di peso fresco (fw). Acausa della coeluzione del-l’isomero vaticanolo-C-similecon l’ampelopsina H, lasomma di entrambi i compo-sti è stata espressa come equi-valenti di ampelopsina H. Acausa della coeluzione di Z +E-miyabenolo C la somma dientrambi i composti è stataespressa come equivalenti diZ miyabenolo-C e similmentela somma di Z + E-ω-viniferi-na è stata espressa come equi-valenti di E-ω viniferina. Lestrutture di tutti i compostisono riportate in Figura 1.

è stato filtrato con un filtro diPVDF 0.22 mm (Millipore,Bedford, MA) in una fialaHPLC e poi analizzato me-diante HPLC.

Metodo HPLC-DAD-MS.L’analisi è stata effettuata

con un sistema LC-MS ZQMicromass (Micromass, Man-chester, UK), dotato di unsistema Waters 2690 HPLC,un rivelatore DAD 996 Waters(Waters Corp., Miliford, MA)e Empower Software (WatersCorp.). La separazione è stataeseguita utilizzando una co-lonna Zorbax SB-Aq (5 mm,2.1x150 mm) e una pre-colon-na Zorbax SB-Aq (5 mm,2.1x12.5 mm) precolonna(Agilent Technologies, PaloAlto, CA). Le fasi mobili uti-lizzate consistevano di 0,1%(v/v) di acido acetico in H2O(A) e acetonitrile (B). La sepa-razione è stata condotta a 40°C in 27 min, alle seguenticondizioni: gradiente lineareda 5% B a 70% B in 25 min, a95% B in 0,1 min, 95% B per2 minuti e ritorno a 5% B in0,1 minuti. La colonna è stataequilibrata per 7 minuti primadi ogni analisi. Il flusso è statodi 0,25 ml/min e il volume diiniezione 6 ml. Gli spettriUV-VIS sono stati registratinell’intervallo 220-400 nm, larilevazione a 310 nm.

La tensione applicata nelcapillare è stata di 3000 V, latensione di cono di 40 V, latensione di estrazione di 6 V,la temperatura della sorgente

di 105 °C, la temperatura didesolvatazione 200 °C, il flus-so di gas (N2) nel cono 30 l/h,il flusso del gas di desolvata-zione (N2) 450 l/ora. L’uscitadel sistema di HPLC è statasuddivisa (9:1) verso l’inter-faccia ESI dell’analizzatore dimassa. Spettri di massa elet-trospray con valori m/z da100 a 1500 sono stati acquisitiin modo positivo con untempo di permanenza di 0,1.

Alla fine dei 27 min dicorsa acquisiti in modalitàpositiva sono stati acquisitianche spettri di massa inmodalità negativa per 1 min.La tensione di cono (CV) èstata impostata in modalità discansione ad un valore di 40V per l’identificazione delpicco basato sull’aglicone eda 25 V per l’identificazionesulla base sia del frammentoaglicone sia dello ione mole-colare. I seguenti ioni singoli(m/z) sono stati monitoratiper l’identificazione: 229,1(CV 25 V) per trans- e cis-resveratrolo, 229,1 (CV 40 V)per i derivati transtrans- ecis-piceide, 455,2 (CV 60 V)per i dimeri stilbenoidi, 681,2(CV 70 V) per i trimeri stilbe-noidi, 907,2 (CV 80 V) per itetrameri stilbenoidi.

Ciascun composto è statoidentificato sulla base deiseguenti parametri: 1) tempodi ritenzione, 2) spettri UV-VIS 3) frammento base corri-spondente all’aglicone 4) ionemolecolare. I campioni sonostati quantificati con rileva-

Tab. 4 - Riproducibilità fra piante. Concentrazione media (ug/g fw), Deviazione standard (Sd) e Co-efficiente di variazione (cv) sono stati ottenuti considerando la seconda e terza foglia di tre repli-che per genotipo. Le misure sono state effettuate a 6 dpi dopo infezione con P.viticola

transtrans- pallidol ampelop isohope Ampelop (+)-E-ε- Z+E Z+E-ω- α- E-cis trans-

piceid resverat sin D+ aphenol sin H + viniferin miyabe viniferi vinifer miyaben ptero-rol quadran vaticano nol C n in ol C stilb

gularin l C eneA (1:1) isomer

21/122

Average 4.9 7.2 16.40 9.0 107.4 49.6 31.8 41.2 40.9 51.8 42.1 8.1

Sd 1.3 1.0 4.22 2.4 34.3 13.3 6.8 12.4 10.3 36.2 19.1 0.8

cv (%) 25.6 14.6 25.8 27.0 31.9 26.8 21.5 30.2 25.3 69.9 45.3 10.0

Merzling

Averag 1.3 4.7 25.79 5.6 135.5 32.1 12.8 9.1 7.9 11.8 15.1 5.2

Sd 0.2 2.4 15.86 2.5 67.1 18.1 7.3 4.6 0.9 7.3 14.6 2.3

cv (%) 15.2 51.6 61.5 44.9 49.6 56.5 57.4 50.1 11.3 61.5 97.1 44.2

la loro caratterizzazione strut-turale è riportata in Mattivi etal. (2011).

Preparazione del cam-pione.

Campioni rappresentatividi foglie sono stati pesati(0.2-0.3 g) e ad essi sono statiaggiunti 40 ml di metanolo e50 ml di standard interno (4-hydroxystilbene, 200 mg/l).Ogni campione è stato omo-genato in un frullatore ali-mentare per 30 s e poi centri-fugato a 3300xg per 7 min. Ilsurnatante è stato filtrato(0.45 mm, Sartorius, Germa-nia) e concentrato ad un volu-me finale di 0.5 ml medianteun rotavapor (Büchi, Germa-nia) a 38 °C, trasferito in unasiringa da 50 ml a cui eranostati precedentemente aggiun-ti 40 ml di H2O. La siringa èstata posta su una cartucciaSPE Bakerbond, SDB (ISO-LUTE ENV +) 100 mg/3 ml(JT Baker, Deventer, Olan-da), che era stata precedente-mente condizionata con 2 mldi metanolo seguiti da 5 ml diH2O, e ciascun campione èstato caricato sulla cartucciapre-condizionata. La cartuc-cia è stata quindi lavata con 5ml di H2O e gli stilbeni sonostati eluiti mediante 2 ml diacetato di etile.

La frazione di acetato dietile è stata quindi portata asecco a 38 °C. Il residuo èstato immediatamente ridi-sciolto in 0.5 ml di 50% (v/v)metanolo in H2O. Il campione


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Al fine di misurare la sinte-si di stilbenoidi nel tempo, laterza foglia di ciascuna piantaè stata analizzata a tempidiversi dopo l’infezione (0, 2,6 giorni post-infezione). Laterza foglia è stata scelta per-ché secondo la letteratura lefoglie molto giovani e moltovecchie non sintetizzano ele-vate concentrazioni di stilbeni(Stein et al. 1985, Dercks eCreasy 1989). Nelle foglie deitre genotipi raccolte al tempo0, non è stata trovata alcunaviniferina, con l’eccezione ditrans-resveratrolo nel genoti-po 21/122 (Tabella 3).Durante i primi due giornipost-infezione non sono stateevidenziate differenze nei sin-tomi di infezione. A 2 dpisolo il genotipo 21/122 avevasintetizzato tutti i composti,ad eccezione del pallidolo,mentre nel genotipo 21/103 ein Merzling non è stata rileva-ta alcuna viniferina. Tuttaviaa 6 dpi tutti i genotipi (inclusoil 21/122) mostravano la mas-sima concentrazione con unprofilo complesso di stilbeni(Figura 2) caratterizzato dallapresenza di trans-piceide,trans-resveratrolo, (+) -E-ε-viniferina, e anche Z + E-ω-viniferina e pterostilbene,composto precedentementesegnalato come mediatore diresistenza nelle uve (Pezet etal. 2004b). Oltre a questicomposti noti, siamo stati ingrado di rilevare e quantifica-re ulteriori 7 stilbenoidi, chesono stati caratterizzati recen-

temente (Mattivi et al., 2011).In questo lavoro per la primavolta la maggior parte di essiviene incluso in un metodoanalitico e quantificato. Conl’eccezione del trans-ptero-stilbene nel genotipo 21/103,tutti gli altri stilbeni sono statitrovati in tutti i campioni ana-lizzati. Inoltre, abbiamoosservato la formazione di undimero fenolico (picco 1 inFigura 2) derivato dalla con-densazione di (+)-catechina eacido caffeico, già caratteriz-zato in una parte dello studioprecedente (Mattivi et al.,2011), e non ulteriormenteindagato.

Lavorando con una popola-zione di vite diversa, Pezet etal (2004b) hanno riportato unprecoce aumento fino a 2 dpie successiva riduzione delleviniferine nelle foglie infetta-te con P. viticola. Nel nostroesperimento, l’accumulo diviniferine nelle foglie è risul-tato ritardato rispetto agliesperimenti di Pezet et al.(2004b). Nel caso della nostrapopolazione di vite, un tempodi induzione di 6 dpi sembra-va il momento più appropria-to per saggiare la produzionedi fitoalessine.

Una volta selezionato ungenotipo con una elevatarisposta sarebbe anche inte-ressante dal punto di vistapratico studiare la presenza didifferenti cinetiche di rispo-sta, come osservato nel casodi 21/122 (Tabella 3).

Per una caratterizzazione

dettagliata di un genotiporesistente andrà consideratoanche il tempo di induzionedelle fitoalessine, dato cheper viti infettate con Botrytiscinerea è stato suggerito chenon solo la quantità, maanche la velocità di produzio-ne di stilbenoidi correlavanocon la loro resistenza alla cre-scita del micelio di Botrytis(Stein e Blaich 1985).

Accumulo di viniferine infoglie diverse dopo l’infezio-ne con P. viticola.

La sintesi di stilbenoidi èanche strettamente dipenden-te dalle condizioni ambientalie dalla fase di sviluppo dellapianta, in quanto esse posso-no influenzare il processo diinfezione. È stato infattiriportato che le foglie moltogiovani e molto vecchie nonsintetizzano livelli elevati distilbeni, probabilmente acausa dello sviluppo incom-pleto degli stomi (Stein et al.1985, Dercks e Creasy 1989).

Tutte le foglie di ogni repli-ca state analizzate a 6 dpi, alfine di verificare la variabilitànell’accumulo di stilbeni trafoglie diverse. E’ stato evi-denziato che l’accumulo diviniferine nelle diverse foglienon era la stessa sia nei dueindividui F1 che in Merzling(Figura 3). Nel genotipo21/103 le concentrazioni piùelevate sono state riscontratenelle foglie 2 e 3 e il piùbasso nella foglia apicale. Ilcontenuto di viniferine era

Risultati ediscussione

Validazione del metodo.La soglia di rilevabilità(LOD) e la soglia di quantifi-cazione (LOQ) per ogni sin-golo composto sono stati sti-mati sperimentalmente a tre edieci volte il rapporto segna-le-rumore (S/N) rispettiva-mente. I valori ottenuti nellemisure UV-Vis sono indicatenella Tabella 2. Le curve dicalibrazione sono lineari aconcentrazioni comprese tra0,1 - 20 mg/L. Il coefficienteR2 era ≥ 0,9981. La ripetibili-tà strumentale è stato misura-ta ripetendo 14 iniezioni con-secutive della miscela stan-dard (trans-piceide, trans-resveratrolo, isohopeaphenoloe α-viniferina). I coefficientidi variazione del segnaleDAD sono stati i seguenti:trans-piceide CV (%) 0,3,trans-resveratrolo 0.2, isoho-peaphenolo 1.5 e α-viniferin2.7. Tali valori sono nel rangetipico osservato fra ripetizionitecniche. Questo aspetto nonè stato indagato ulteriormen-te, poiché è principalmente lavariabilità biologica che deveessere considerata essendomolto più elevata, comeriportato più avanti in questoarticolo.

Analisi dell’accumulo diviniferine nelle foglie indiversi momenti dopo l’in-fezione con P. viticola.

Tab. 5 - Riproducibilità fra annate. Concentrazione media (ug/g fw), Deviazione standard (Sd) e Co-efficiente di variazione (cv) sono stati ottenuti considerando la seconda e terza foglia di ciascun ge-notipo in tre annate successive a 6 dpi dopo infezione con P. viticola

transtrans- pallidol ampelop isohope Ampelop (+)-E-ε- Z+E Z+E-ω- α- E-cis trans-

piceid resverat sin D+ aphenol sin H + viniferin miyabe viniferi vinifer miyaben ptero-rol quadran vaticano nol C n in ol C stilb

gularin l C eneA (1:1) isomer

21/103

average 5.2 11.0 22.52 21.4 1214.8 143.6 32.3 42.5 40.2 44.0 45.5 nd

Sd 2.5 4.1 19.82 20.9 1948.5 150.6 30.7 41.9 40.9 48.1 43.4 nd

cv (%) 47.9 37.4 88.1 97.8 160.4 104.9 95.0 98.5 101.6 109.4 95.5

21/74

average 5.1 11.7 24.71 192.5 112.2 33.3 15.6 21.5 22.5 12.8 27.0 nd

Sd 1.4 8.9 29.75 329.5 139.7 41.7 20.8 25.8 32.7 14.9 35.8 nd

cv (%) 26.6 75.8 123.4 171.2 124.6 125.1 133.8 119.9 145.7 116.7 133.0


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altamente variabile e general-mente più alto nelle seconde,terze e quarte foglie (Figura3). La seconda e quinta fogliahanno mostrato il più altocontenuto di viniferine nelgenotipo 21/122, mentre nelMerzling è stata osservatauna diversa distribuzione,infatti la concentrazione piùalta è stata trovata nell’ottavafoglia e il secondo più altonella quarta foglia. I nostririsultati non sono in completo

accordo con la letteratura, inparticolare per il campioneMerzling, in quanto è statoriportato che le foglie moltogiovani e molto vecchie nonsintetizzano elevate concen-trazioni di stilbeni (Dercks eCreasy, 1989). Tuttavia altriautori hanno suggerito che lefoglie giovani campionate ingiugno-luglio nelle posizionicomprese fra la 4a e la 7a delgermoglio sono le più adatteper studiare gli stilbeni indotti

da Botrytis (Stein e Blaich,1985). Nel nostro caso si puòconcludere che l’intensità diinduzione di stilbeni nonmostra una correlazione chia-ra e omogenea con la posizio-ne delle foglie sul germoglio.

Sulla base dei risultati otte-nuti, abbiamo quindi deciso dieffettuare l’analisi delle vini-ferine nell’incrocio Merzlingx Teroldego (Malacarne et al.,2011) raggruppando le secon-de e terze foglie.

L’accumulo di viniferinedopo l’infezione con P. viti-cola: riproducibilità tra lepiante.

Per questa prova sono statiscelti i genotipi 21/122 eMerzling. Per valutare la ripro-ducibilità sono state considera-te come ripetizioni la secondae terza foglia infetta di piantedifferenti. La deviazione stan-dard più alta in entrambi icampioni è stata misurata perl’α-viniferina (Tabella 4).

Nel genotipo 21/122, lavariabilità tra le piante è statapiù bassa per trans-resveratro-lo (14,6%) e trans-pterostilbe-ne (10%), e la più alta per α-viniferina (69,9%) e E-miya-benol C (45,3%). La situazio-ne era diversa per Merzling, lavariabilità minima è stata tro-vata per trans-piceide (15,2%)e Z + E-ω-viniferina (11,2%),mentre E-myabenolo C e pal-lidolo hanno mostrato la varia-bilità maggiore tra piantediverse, 97,1 % e 61,5%rispettivamente. In generale, cisi aspetterebbe che la variabili-tà dipenda fortemente dalla viabiosintetica del composto, poi-ché alcuni composti, come imonomeri, devono accumular-si inizialmente e quindi dimi-nuire per generare gli oligo-meri minori, che nel tempovengono poi convertiti in oli-gomeri superiori mediantemeccanismi ossidativi. Pur-troppo ad oggi, non è peròdisponibile un modello mecca-nicistico dettagliato.

In conclusione, i dati delleinfezioni in vivo hanno mo-strato una notevole variabilitàdi tutti i composti e i risultatisperimentali ci hanno dato unastima dell’ordine di grandezzadi variabilità biologica. Lapresenza di tale forte variabili-tà suggerisce l’opportunità di

Fig. 1 - Strutture delle viniferine accumulate nelle foglie degli ibridi diVitis vinifera (Merzling x Teroldego) in seguito ad infezione con Plasmo-para viticola


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includere un certo numero direpliche biologiche (piuttostoche tecniche) nel disegno spe-rimentale.

L’accumulo di viniferinedopo l’infezione: riproduci-bilità tra annate

La suscettibilità di unapianta all’infezione va spessoverificata in diverse annate.Una sola osservazione nonpuò essere conclusiva, ed èpossibile perdere piante oripetizioni quando si lavoramediante infezione in vivo diuna barbatella. Per la prova diriproducibilità tra gli anni èstato analizzato il contenuto di

stilbeni dei genotipi 21/103 e21/74 per tre anni consecutivi.Le seconde e terze foglie sonostate raccolte a 6 dpi da trepiante diverse per ogni genoti-po. I risultati di questo esperi-mento sono riportati in Ta-bella 5. Le variazioni tra glianni erano molto più elevaterispetto alle variazioni trapiante dello stesso anno(Tabella 4). Nel caso delgenotipo 21/103 solo trans-picede e trans-resveratroloerano inferiori al 50% coeffi-ciente di variazione (CV),mentre nel caso di Merzlingsolo trans-piced aveva un CVrelativamente basso (26,6%).

Tutti gli altri composti mostra-vano CV superiori al 50%, ecome caso estremo per ampe-lopsina D + quadrangularinaA è stato registrato un CV di171,2%. Tali valori di variabi-lità biologica non erano ina-spettati in quanto le barbatellee la raccolta dell’inoculo natu-rale di P. viticola sono statipreparati nelle diverse stagionie sono quindi fattori di varia-bilità aggiuntiva. Tuttavia,anche nei casi di estremavariabilità crediamo che ci sipossa aspettare che l’ordine digrandezza della concentrazio-ne assoluta di stilbeni prodottain annate diverse sia conserva-

Fig. 2 ‐ Cromatogramma del profilo di viniferine nel genotipo 21/122 144ore dopo l’infezione con P. viticola (modalità SIM e traccia DAD)

Legenda: 1 prodotto di condensazione fra trans-caffeic acid e (+)-catechin; 2 pallidol, 3 ampelopsin D+ quadrangularin A; 4 isohopeaphenol; 5 Z-ε-viniferin; 6 ampelopsin H; 7 vaticanol C-like; 8 (+)-E-ε-viniferin; 9 Z-miyabenol C; 10 E-miyabenol C; 11 Z +E-ω-viniferin; 12 α-viniferin; 13 E-cismiyabenolC; 14 trans-piceid; 15 trans-resveratrol; 16 trans-pterostilbene.


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Ringraziamenti. Questo lavo-ro è stato supportato dalProgetto “Resveratrolo” eADP 2009, entrambi finanzia-ti dalla Provincia Autonomadi Trento.

RiassuntoLo scopo di questo lavoro è

stato lo sviluppo di un nuovometodo di separazione croma-tografica e quantificazioneaccurata delle viniferine pre-senti nelle foglie di vite dopol’infezione con Plasmoparaviticola. È stato condotto suuna popolazione interspecifi-ca F1, derivante dall’ incrociotra Merzling e Teroldego, ilprimo parzialmente resistentee il secondo suscettibile aPlasmopara viticola. L’ana-lisi è stata condotta medianteuno ZQ Waters LC-MS, uti-lizzando una colonna a faseinversa. Il metodo è statovalidato per l’analisi metabo-lica e permette l’accurataidentificazione e quantifica-zione di trans-resveratrolo,trans-piceide, trans-pterostil-bene, un prodotto di conden-sazione tra (+)-catechina eacido caffeico, e tutta la clas-se delle viniferine in foglie divite infettate con Plasmoparaviticola, grazie all’uso deicorrispondenti standard. Seigiorni dopo l’infezione è statoriscontrata la concentrazionemassima di stilbenoidi in tuttii genotipi testati. Inoltre l’in-tensità di induzione di stilbeninon mostra una correlazionechiara con la posizione dellefoglie nel germoglio.

A nostra conoscenza que-sto è il primo articolo cheriporta una analisi metabolicadettagliata, con identificazio-ne e quantificazione, delleprincipali viniferine presentiin foglie di vite dopo infezio-ne con Plasmopara viticola,mediante uso degli standardcorrispondenti.

Adattamento italiano delmanoscritto dal titolo “Pro-filing and accurate quantifi-cation of trans-resveratrol,trans-piceid, trans-pterostil-bene and 11 viniferins indu-ced by Plasmopara viticola inpartially resistant grapevineleaves” degli autori VrhovsekU., Malacarne G., MasueroD., Zulini L., Guella G.,Stefanini M., Velasco R. eMattivi F. pubblicato dallarivista Australian Journal ofGrape and Wine Research edisponibile in versione inte-grale al sito http://onlineli-brary.wiley.com/doi/10.1111/j.1755-0238.2011.00163.x/abstract.

BibliografiaAdrian, M., Jeandet, P.,

Bessis, R. and Joubert, J.M.(1996) Induction of phy-toalexin (resveratrol) synthe-sis in grapevine leaves treatedwith aluminum chloride(AlCl3). Journal of Agricul-tural and Food Chemistry 44,1979-1981.

Adrian, M., Jeandet, P.,Veneau, J., Weston, L.A. andBessis, R. (1997) Biologicalactivity of resveratrol, a stil-

benic compound from gra-pevines, against Botrytiscinerea, the causal agent forgray mold. Journal of Che-mical Ecology 23, 1689-1702.

Barlass, M., Miller, R.M.and Douglas, T.J. (1987)Development of Methods forScreening Grapevines forResistance to Infection byDowny Mildew.2. Resvera-trol Production. AmericanJournal of Enology andViticulture 38, 65-68.

Bru, R., Selles, S., Casado-Vela, J., Belchi-Navarro, S.and Pedreno, M.A. (2006)Modified cyclodextrins arechemically defined glucaninducers of defense responsesin grapevine cell cultures.Journal of Agricultural andFood Chemistry 54, 65-71.

Cantos, E., Espin, J.C. andTomas-Barberan, F.A. (2001)Postharvest induction model-ing method using UV irradia-tion pulses for obtainingresveratrol-enriched tablegrapes: A new “functional”fruit? Journal of Agriculturaland Food Chemistry 49,5052-5058.

Dercks, W. and Creasy,L.L. (1989) The significanceof stilbene phytoalexins in thePlasmopara Viticola grape-vine interaction. Physiolo-gical and Molecular PlantPathology 34, 189-202.

Douillet-Breuil, A.C., Jean-det, P., Adrian, M. and Bes-sis, N. (1999) Changes in thephytoalexin content of variousVitis spp. in response to ultra-violet C elicitation. Journal ofAgricultural and Food Che-mistry 47, 4456-4461.

Fig. 3 - Valore medio della concentrazione di viniferine totali (ug/g fw) nelle diverse foglie a 6giorni dall’infezione con P. viticola. La deviazione standard è riportata nei casi in cui erano dispo-nibili 2 o 3 foglie

to ed utilizzabile per eviden-ziare i genotipi con rispostapiù elevata. Alla luce di questidati è consigliabile analizzarei genotipi di vite in più stagio-ni prima di trarre qualsiasiconclusione così da rendereveritiera la caratterizzazionechimica.

Considerazioniconclusive

È stato sviluppato e valida-to su un periodo di 3 anni unnuovo metodo di analisi deglistilbeni che può essere appli-cato in numerosi studi. Ilmetodo che combina HPLC-DAD e MS è stato validatoper l’analisi dell’intera classedegli stilbeni trovati in fogliedi vite dopo l’infezione conP. viticola.

Il processo di infezione diquesto oomicete è strettamen-te dipendente dalle condizioniambientali e dalle fasi di svi-luppo della pianta che si riflet-tono sul processo di infezione(Stein et al. 1985, DercksCreasy e 1989). Quindi duefattori cruciali sono stativalutati, il tempo di campio-namento dopo l’infezione e iltipo di foglie più sensibilialle infezioni fungine, cosìcome le principali fonti divariabilità biologica. Il meto-do HPLC-DAD-MS descrittoin questo lavoro fornisce labase per la misura in unasola analisi di resveratrolo,piceide, pterostilbene e l’in-tera classe di stilbenoidi ingenotipi di vite infettati da P.viticola.


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Gatto, P., Vrhovsek, U.,Muth, J., Segala, C., Romual-di, C., Fontana, P., Pruefer, D.,Stefanini, M., Moser, C.,Mattivi, F. and Velasco, R.(2008) Ripening and genotypecontrol stilbene accumulationin healthy grapes. Journal ofAgricultural and Food Che-mistry 56, 11773-11785.

Godard, S., Slacanin, I.,Viret, O., Gindro, K. (2009)Induction of defence mecha-nisms in grapevine leaves byemodin- and anthraquinone-rich plant extracts and theirconferred resistance to downymildew. Plant Physiology andBiochemistry 47, 827-837.

Hoos, G. and Blaich, R.(1990) Influence of resvera-trol on germination of conidiaand mycelial growth of Bo-trytis cinerea and Phomopsisviticola. Journal of Phytopa-thology 129, 102-110.

Jeandet, P., Breuil, A.C.,Adrian, M., Weston, L.A.,Debord, S., Meunier, P.,Maume, G. and Bessis, R.(1997) HPLC analysis ofgrapevine phytoalexins cou-pling photodiode array detec-tion and fluorometry. Ana-lytical Chemistry, 69, 5172-5177.

Jeandet, P. (2002) Phyto-alexins from the vitaceae:Current problems and futureprospects. Journal Internatio-nal des Sciences de la Vigneet du Vin, 36, 107-107.

Jerkovic, V., Nguyen, F.,Nizet, S. and Collin, S.(2007) Combinatorial synthe-sis, reversed-phase and nor-mal-phase high-performanceliquid chromatography elu-tion data and liquid chro-matography/positive atmos-pheric pressure chemical ion-ization tandem mass spectraof methoxylated and glycosy-lated resveratrol analogues.Rapid Communications inMass Spectrometry 21, 2456-2466.

Korhammer, S., Reniero, F.and Mattivi, F. (1995) Anoligostilbene from Vitis roots.Phytochemistry 38, 1501-1504.

Langcake, P. and Pryce,R.J. (1976) Production ofresveratrol by Vitis viniferaand other members ofVitaceae as a response toinfection or injury. Plant

Physiology and Plant Patholo-gy 9, 77-86.

Langcake, P. and Pryce,R.J. (1977) Production ofresveratrol and viniferins bygrapevines in response to UVIrradiation. Phytochemistry16, 1193-1196.

Mattivi, F., Reniero, F. andKorhammer, S. (1995) Isola-tion, characterization, andevolution in red wine vinifi-cation of resveratrol mono-mers. Journal of Agriculturaland Food Chemistry 43,1820-1823.

Malacarne, G., Vrhovsek,U., Zulini, L., Cestaro, A.,Stefanini, M., Mattivi, F.,Delledonne, M., Velasco, R.and Moser, C. (2011)Resistance to Plasmoparaviticola in a grapevine segre-gating population is associa-ted to stilbenoids accumula-tion and to specific transcrip-tional responses. BMC PlantBiology, in press.

Mattivi, F., Vrhovsek, U.,Malacarne, G., Masuero, D.,Zulini, L., Stefanini, M.,Moser, C., Velasco, R. andGuella, G.. (2011) Profilingof resveratrol oligomers,important stress metabolitesaccumulating in the leaves ofhybrid V. vinifera (Merzling xTeroldego) genotypes infec-ted with Plasmopara viticola,Journal of Agricultural andFood Chemistry, 59, 5364-5375.

Pezet, R. and Pont, V.(1988) Identification of ptero-stilbene in grape berries ofVitis Vinifera. Plant Physio-logy and Biochemistry 26,603-607.

Pezet, R., Perret, C., Jean-Denis, J.B., Tabacchi, R.,Gindro, K. and Viret, O.(2003). delta-Viniferin, aresveratrol dehydrodimer:One of the major stilbenessynthesized by stressedgrapevine leaves. Journal ofAgricultural and FoodChemistry 51, 5488-5492.

Pezet, R., Gindro, K., Viret,O. and Richter, H. (2004a)Effects of resveratrol, vini-ferins and pterostilbene onPlasmopara viticola zoosporemobility and disease develop-ment. Vitis, 43, 145-148.

Pezet, R., Gindro, K.,Viret, O. and Spring, J.L.(2004b) Glycosylation and

oxidative dimerization ofresveratrol are respectivelyassociated to sensitivity andresistance of grapevine culti-vars to downy mildew.Physiological and MolecularPlant Pathology, 65, 297-303.

Sarig, P., Zutkhi, Y.,Monjauze, A., Lisker, N. andBen-Arie, R. (1997) Phyto-alexin elicitation in grapeberries and their susceptibilityto Rhizopus stolonifer.Physiological and MolecularPlant Pathology 50, 337-347.

Sbaghi, M., Jeandet, P.,Faivre, B., Bessis, R. andFournioux, J.C. (1995) Deve-lopment of methods, usingphytoalexin (resveratrol)assessment as a selection cri-terion to screen grapevine invitro cultures for resistance togrey mould (Botrytis cinerea).Euphytica 86, 41-47.

Schmidlin, L., Poutaraud,A., Claudel, P., Mestre, P.,Prado, E., Santos-Rosa, M.,Wiedemann-Merdinoglu, S.,Karst, F., Merdinoglu, D. andHugueney. P. (2008) Astress-inducible resveratrol O-methyltransferase involved inthe biosynthesis of pterostil-bene in grapevine. PlantPhysiology 148, 1630-1639.

Stein, U., Heintz, C. andBlaich, R. (1985) The In vitroexamination of grapevinesregarding resistance to pow-dery and downy mildew.Journal of Plant Diseases andProtection . 92, 355-369.

Stein, U., Blaich, R. (1985)Studies on stilbene produc-tion and susceptibility toBotrytis in Vitis species. Vitis24, 75-87.

Vitrac, X., Bornet, A.,Vanderlinde, R., Valls, J.,Richard, T., Delaunay, J.C.,Merillon, J.M. and Teissedre,P.L. (2005) Determination ofstilbenes (delta-viniferin,trans-astringin, trans-piceid,cis- and trans-resveratrol,epsilon-viniferin) in Brazilianwines. Journal of Agriculturaland Food Chemistry 53,5664-5669.

Zamboni, A., Gatto, P.,Cestaro, A., Pilati, S., Viola,R., Mattivi, F., Moser, C. andVelasco, R. (2009) Grapevinecell early activation of specif-ic responses to DIMEB, aresveratrol elicitor. BMCGenomics, 10, 363.


QUANTIFICAZIONE DI RESVERATROLO, PICEIDE, … et... · È stata utilizzata una popo-lazione F1...

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