Aggiornamento tecnico scientifico a cura di:Dr.ssa Simonetta Signorini

Le connettivitiautoimmuni

Dossier N.14

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Dossier N. 14Ottobre 2011

i. Autoimmunologia 4Citochine 8Classificazione delle malattie autoimmuni 10inquadramento clinico delle malattie autoimmuni non organo specifiche 12

ii. Diagnostica 15Nuove prospettive 23Algoritmo diagnostico 24Conclusioni 27Riferimenti bibliografici 27

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i. AUToiMMUNoLoGiA

introduzioneil sistema immunitario ha la funzione di proteggere il nostro organismo dalle infezioni mediante il riconosci­mento dei microrganismi, l’impedimento della loro crescita e l’eliminazione delle cellule senescenti e delle macromolecole. Questi sistemi di difesa sono in grado di fornire uno stato di immunità contro le infezioni e i loro meccanismi e costituiscono le basi del campo di studio definito “immunologia”. Per adempiere a questi compiti, deve distinguere le molecole self e nonself.

Le alterazioni dei meccanismi di controllo della tolleran­za immunologica possono determinare le reazioni autoimmuni verso le molecole self e quindi le malattie autoimmuni.

Fig. 1: Tolleranza centrale verso i linfociti T. I linfociti T immaturi con TCR ad elevata affinità per il complesso peptide-MHC vanno incontro ad un processo di morte programmata o apoptotica (delezione clonale).

Legenda: n = Autoantigene n = Molecola HLA n = Recettore del Linfocita T (TCR)

La tolleranza immunologica consiste nell’incapacità da parte dell’organismo di reagire verso determinati stimoli antigenici per un’inibizione specifica del sistema immu­nitario. i meccanismi di tolleranza immunologica agisc o­no sia a livello centrale che periferico. La tolleranza centrale si verifica quando i linfociti incon­trano il rispettivo antigene durante il loro processo matu­rativo a livello degli organi linfatici centrali (midollo osseo per i linfociti B, timo per i linfociti T) (fig. 1)

LINF. T

CEL

LULA

TIM

ICA

Ottamero istonico Istone H1 DNA

Nucleosoma

il recettore del linfocito T combacia perfet­tamente con il complesso HLA­ auto antige­ne presente nel timocita: l’interazione è ad alta affinità e il linfocito viene eliminato

il recettore del linfocito T riconosce debol­mente il complesso HLA­autoantigene: il linfocita non viene eliminato perché potenzialmente utile

il recettore non riconosce per niente il complesso HLA­autoantigene: il linfocito viene eliminato perché inutile

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La tolleranza centrale per i linfociti B autoreattivi avvie­ne a livello del midollo osseo mediante una delezione dei linfociti B immaturi che hanno recettori ad elevata affinità per gli autoantigeni presenti nel microambiente midollare.

La tolleranza periferica è più importante di quella cen­trale, poiché agisce sui linfociti T e B che sono sfuggi­ti ai meccanismi di delezione clonale e morte apop­totica, e che si trovano a contatto con gli autoantigeni. La tolleranza periferica per i linfociti B si verifica quan­do incontrano l’autoantigene specifico nei tessuti peri­ferici in assenza del linfocito T helper specifico; i linfo­citi B autoreattivi diventano incapaci di rispondere all’antigene. inoltre i linfociti B possono essere esclusi dai follicoli linfatici mediante le perdita dei recettori per le chemochine, che attraggono normalmente i lin­fociti B maturi all’interno dei follicoli.

La tolleranza periferica nei confronti dei linfociti T viene regolata mediante i seguenti meccanismi principali:

• Anergia clonale

il linfocita T maturo riconosce il complesso peptide­MHC della cellula presentante l’antigene, tuttavia manca la sua attivazione completa per assenza delle molecole cosiddette co­stimolatorie, oppure il peptide presenta residui aminoacidici alterati nella zona di contatto con TCR.

• Delezione clonaleLa delezione clonale nei linfociti T maturi è determina­ta dalla persistente stimolazione da parte dell’antigene, con conseguente attivazione di un processo noto come morte cellulare indotta dall’attivazione (“activati­on­induced cell death” AiCD). La AiCD è una forma di apoptosi indotta da segnali che originano da recet­tori “di morte” presenti sulla membrana, il più impor­tante di quali è il Fas. il Fas, interagendo con il suo ligando (FasL), attiva nelle cellule delle cistino­proteasi dette caspasi che determinano la morte apoptotica.

• soppressione da linfociti inibizione della risposta immunitaria ad opera di ci­tochine prodotte dai linfociti T soppressori.L’attivazione di questi linfociti sembra dipendere dalla dose dell’antigene nonché dalla formazione del complesso antigene­anticorpo.

Oltre ai principali meccanismi sopra­menzionati ci sono altri sistemi per il controllo della tolleranza periferica:

• L‘ignoranza clonale, intesa come incapacità dei linfociti autoreattivi di rispondere agli autoantigeni senza tuttavia essere sottoposti ai meccanismi visti precedentemente.

• L‘isolamento anatomico per impedire la possibilità di contatto con i linfociti e quindi una reazione immunitaria specifica.

• i confinamento in organi che normalmente non espri­mono l‘MHC di classe ii determina l’impedi mento alla reazione immunologica per un mancato ricono­scimento.

La deficienza e/o l‘alterazione dei meccanismi re­sponsabili del mantenimento della tolleranza possono provocare l‘insorgenza di fenomeni di autoimmuniz­zazione.

L‘autoimmunità può ovviamente risultare da anomalie dei linfociti B, dei linfociti T o di entrambe le popola­zioni linfocitarie. Le anomalie dei linfociti T sono più importanti, perché i linfociti T rappresentano le cellule centrali di tutte le risposte immuni nei confronti degli antigeni proteici, sia con riferimento alle reazioni cel­lulo­mediate che alla produzione di autoanticorpi. i deficit dei meccanismi di tolleranza immunologica possono manifestarsi a livello centrale o a livello peri­ferico. i deficit dei meccanismi di tolleranza centrale possono spiegare la presenza in circolo di cellule T autoreattive, tuttavia questo difetto può essere control­lato a livello periferico.

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i difetti dei meccanismi di tolleranza periferica posso­no essere determinati da:

• processi infiammatori che possono attivare le APC in fase di riposo presenti a livello tessutale, inducen­do su tali cellule l‘espressione aberrante delle mole­cole co­stimolatorie necessarie alla presentazione di autoantigeni;

• difetto di espressione o di funzione delle molecole coinvolte nella inattivazione dei processi di co­sti­molazione;

• mutazioni che interferiscono con la morte apoptoti­ca dei linfociti maturi;

• difetto nei meccanismi di soppressione mediati dai linfociti T, in particolare di quelli capaci di produrre citochine regolatorie.

Altre cause di alterazioni dei meccanismi di controllo sono:

• Attivazione policlonale dei linfociti Th

• Attivazione policlonale dei linfociti B

• Liberazione di antigeni sequestrati:

l’alterazione della barriera anatomica tessutale, de­termina l’esposizione di autoantigeni sconosciuti al sistema immunitario

• Mimicrismo molecolare: Cross­reattività immunologica di alcuni antigeni estra­

nei con le molecole self

• Superantigeni: antigeni in grado di indurre una risposta immunolo­

gica dei linfociti T molto più elevata rispetto alla reazione per gli antigeni proteici convenzionali

• Alterazioni del controllo idiotipo/anti­idiotipo:

la parte variabile degli anticorpi (idiotipo) con la funzione di riconoscere antigeni è immunogenica e genera anticorpi anti­idiotipo. Un’alterazione a cari­co di questo network idiotipico può determinare la perdita della tolleranza al self

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• Heat shock proteins (HSP): famiglia di proteine prodotte in gran quantità quando

si è sottoposti a stress fisico e metabolico con funzione di coadiuvare la ristrutturazione e la funzionalità del­le proteine denaturate. infezioni e reinfezioni persi­stenti determinano una continua esposizione al SiC delle HSP batteriche inducendo una risposta immu­nitaria anche contro le HSP espresse dalle cellule umane con una conseguente risposta autoimmune

• Età

• il sesso: nelle donne le malattie autoimmuni sono più frequenti, circa 10 volte superiori a quella degli uo­mini

• Deficit immunitari

• infezioni e neoplasie

• Farmaci

• Fattori genetici: aplotipi HLA e non HLA

il sistema HLA (Human Leucocyte Antigen) è il princi­pale responsabile per il riconoscimento delle cellule self e non self, in quanto rappresenta il prodotto dei loci genici del Complesso Maggiore di istocompatibi­lità (MHC), il cui compito principale è la presentazio­ne dei peptidi ai linfociti T. La regione che codifica per HLA è localizzata sul braccio corto del cromoso­ma 6 (fig. 2).

Per alcune malattie autoimmuni esiste una correlazio­ne tra la presenza di determinati alleli HLA e una pre­disposizione ad una particolare patologia autoimmu­ne; inoltre la diversa associazione tra gli alleli HLA, esprime un‘ alta o bassa prevalenza di predisposizione alla patologia.

HLA Classe II

DP, DQ, DR

HLA Classe III

Complemento C4, C2, e FB, TNF

HLA Classe I

Antigeni B A C G

Fig. 2: Cromosoma 6

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CiToChiNe

• sono ridondanti nella loro attività poiché funzioni similari possono essere stimolate da differenti ci­tochine;

• una citochina può indurre nelle cellule target la pro­duzione di citochine addizionali;

• possono anche agire sinergicamente (due o più ci­tochine agiscono insieme) o in modo antagonista (le citochine causano opposte attività).

il dosaggio delle citochine è limitato dalle seguenti caratteristiche:

• emivita breve

• concentrazione plasmatica bassa

• pleiotropia: le citochine svolgono differenti effetti su diversi tipi di cellule bersaglio

• ridondanza: più citochine mediano le stesse attività biologiche

• sinergismo: l’effetto combinato di più citochine può risultare maggiore della somma degli effetti biologi­ci delle singole citochine.

La determinazione necessita quindi di diversi sistemi di indagine:

• l‘analisi dell‘espressione dei geni implicati nella sin­tesi delle citochine;

• misura dell‘attività delle citochine

Un altro gruppo di citochine include interferoni e che­mochine. Gli interferoni iFNα e iFNβ inibiscono la replicazione virale nelle cellule infettate, mentre l’iFNγ

stimola anche l’espressione MHC delle cellule presen­tanti l’antigene. Le chemochine attraggono i leucociti nei siti di infezione, hanno residui di cisteina conser­vati che le classificano in 4 gruppi:

• C­C chemochine (CC Beta) ( ad es. RANTES, MCP­1, MiP­1α e MiP­1β);

• C­X­C chemochine (CXC Alfa) (ed es. iL­8);

• C chemochine (C Gamma) (linfoattine);

• CXXXC chemochine (fractaalkine).

Le citochine sono prodotte soprattutto dai linfociti T helper (Th) e macrofagi, e la loro attività è relativa alla differenziazione e proliferazione delle cellule immuni:

• regolano l’intensità e la durata della risposta immu­nitaria, sia cellulare che umorale;

• regolano la proliferazione e il differenziamento di varie cellule;

• inducono la risposta infiammatoria;

• regolano l’ematopoiesi;

• agiscono sulla fisiopatologia dell’endotelio vascola­re e sulla riparazione dei tessuti.

Le citochine sono prodotte dal sistema immunitario du­rante la fase effettrice dell’immunità naturale e di quel­la specifica, per mediare e controllare la risposta im­munitaria, la reazione infiammatoria e la fagocitosi. L’azione delle citochine è determinata dal legame al recettore specifico alla cellula bersaglio. Tale legame, attraverso un secondo messaggero intracellulare (soli­tamente una tirosina chinasi), altera l’espressione geni­ca cellulare che si traduce nell’aumento o diminuzione dell’espressione delle proteine di membrana (incluso i recettori per le citochine), nella proliferazione, nella secrezione di molecole effettrici.

Citochine è una denominazione generica, si suddivi­dono in:

• Linfochine (citochine prodotte dai linfociti)

• Monochine (citochine prodotte da monociti)

• interleuchine (citochine prodotte da un leucocita e che agiscono su altri leucociti).

Le caratteristiche principali delle citochine sono:

• possono agire sulle cellule stesse che le producono (azione autocrina), sulle cellule vicine (paracrina), o in alcune circostanze su cellule distanti (endocrina);

• differenti tipi cellulari secernono le stesse citochine o una citochina prodotta può agire su differenti tipi cellulari;

La produzione delle citochine è regolata da segnali specifici sulla membrana delle cellule. Le citochine agiscono sulle cellule target legando recettori specifici di membrana. i recettori e le corrispondenti citochine sono suddivisi in diverse famiglie:

• Famiglia dei recettori dell’ematopoietina

• Famiglia dei recettori per interferoni

• Famiglia per i recettori del Tumor Necrosis factor, che hanno 4 domain extracellulari, che includono i recettori per TNFα e TNFβ, il CD40 legato alla membrana (importante per l’attivazione delle cellule B e dei macrofagi), e il Fas (che segnala le cellule di procedere all’apoptosi)

• Famiglia di recettori per le chemochine, che hanno 7 eliche transmembrana ed interagiscono con le G protein. Questa famiglia include i recettori per iL8, MiP­1 e RANTES.

La principale attività delle citochine è indurre la proli­ferazione e la differenziazione delle cellule immuni: in

particolare, per quanto riguarda le cellule T helper, l’azione delle citochine determina la differenziazione in Th1 o Th2.

Le cellule T helper hanno due importanti funzioni:

• Stimolare le cellule immunitarie e infiammatorie

• Stimolare le cellule B a produrre anticorpi

L’equilibrio tra l’attività Th1 e Th2 può guidare la rispo­sta nella direzione dell’immunità umorale o cellulo­mediata.

Nelle malattie autoimmuni l’immunità cellulo­mediata e in particolare la risposta linfocitaria T svolge un ruo­lo patogenetico importante.

in particolare, nelle malattie autoimmuni organo­speci­fiche sono coinvolti i meccanismi patogenetici sostenu­ti da risposte di tipo Th1, mentre nelle malattie autoim­muni sistemiche sono prevalentemente coinvolti i meccanismi di tipo Th2.

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CeLLULe T CiToChiNe ATTiViTA’

Th1 iL­2, iFNγ , TNFβ

iL­3 e GM­CSF

Cellule T e macrofagi, stimolazione delle cellule immunitarie e dell’infiammazione. immunità cellulo­mediata

Stimola la produzione dei leucociti a livello del midollo osseo

Th2 iL­4, iL­5, iL­6, iL­10 Produzione di anticorpi dalle cellule B.immunità umorale e ipersensibilità tipo i (igE)

Tab. 1: Elenco citochine ed attivita’

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CLAssifiCAzioNe DeLLe

MALATTie AUToiMMUNi

Le malattie autoimmuni sono classificate in organo e non organo specifiche in base al tipo di autoanticor­po coinvolto nella malattia. in realtà esiste anche un terzo tipo di malattia autoimmune che è definita inter­media, poichè gli autoanticorpi coinvolti sono non­or­gano specifici (contro antigeni nucleari, mitocondri, gammaglobuline), tuttavia sono presenti infiltrati linfo­citari limitati ad un solo organo o apparato (parotide, fegato, colon).La alterazioni a livello dei tessuti sono mediate dalle immunoreazioni definite da Coombs e Gell in quattro tipi principali di ipersensibilità, con aggiunta di un quinto di tipo “stimolatorio”.

in particolare, nelle malattie autoimmuni organo speci­fiche le lesioni indotte a livello dell’organo bersaglio vengono indotte da immunoreazioni di tipo ii, iV, V; nelle malattie autoimmuni non organo specifiche o si­stemiche le alterazioni prodotte sono indotte da mec­canismi immunopatogeni di tipo iii; nelle malattie auto­immuni intermedie le immunoreazioni sono mediate da meccanismi di tipo ii, iii, o iV.

Di seguito le tabelle riassuntive relative ai bersagli anti­genici specifici e malattie autoimmuni associate.

orGANo ANTiCorPo PAToLoGiA AUToiMMUNe

Stomaco Anti fattore intrinseAnti­cellule parietali gastriche

Anemia perniciosaGastrite atrofica tipo A

Pancreas Anti insula pancreatica = iCAAnti decarbossilasi dell’acido glutammico 65 = Gad 65Anti tirosina fosfatasi = iA2Anti insulina = iAA

Diabete Mellito tipo i

Surrene, Ovaio Anti­cortico­surrenaleAnti­21 idrossilasiAnti ovaio

Malattia di Addison

Menopausa precoce

Tiroide Anti­recettori del TSH= TRAK

Anti­tireoperossidasi = TPOAnti­tireoglobulina = Tg

Malattia di Basedow

Tiroidite Hashimoto­ Mixedema primitivo

Rene, Polmone Anti membrana basale del glomerulo = GBM Sindrome di Goodpasture

Giunzione neuromuscolare

Anti­recettori dell’acetilcolina = AchAnti Proteina Chinasica Specifica = MuSKAnti muscolo striato

Anti canali del calcio

Miastenia Gravis

Sindrome miastenica di Lambert­Eaton

Tab. 2: Malattie autoimmuni organo specifiche

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orGANo ANTiCorPo PAToLoGiA AUToiMMUNe

Fegato Anti­mitocondri di tipo 2 (anti­piruvato deidrogenasi) = PDH

Anti­muscolo liscioAnti­ F Actina Anti­antigene solubile epatico = SLA/LP

Anti­microsomi epatici e renali di tipo anti­citocromo P450 ii D6 = LKM1Anti­citosol epatico = LC1

Cirrosi biliare primitiva

Epatite autoimmune tipo i

Epatite autoimmune tipo ii

Cute Anti­sostanza inter­cellulare (Desmogliena 1 e 3)

Anti­membrana basale epidermica (BP180 e 230)

Anti­transglutaminasi e Anti­endomisio

Anti­SSA

Pemfigo

PemfigoideHerpes gestationisDermatite erpetiforme

Lupus cutaneo subacutoIntestino Anti­transglutaminasi

Anti­endomisioAnti­gliadina

Anti­saccharomyces cerevisiae = ASCA

Malattia celiaca

Morbo di Crohn

ANTiCorPo PAToLoGiA AUToiMMUNe

Anti­nucleo; Anti­Dna nativoAnti­nucleosomaAnti­Sm, anti­SSA/RoAnti­Ribosoma

Lupus Eritematoso Sistemico (LES)

Anti­nucleoAnti SSA/Ro, anti SSb/La

Sindrome di Sjögren

Anti­nucleoAnti­RNP

Malattia mista del tessuto connettivo (MCTD)

Anti­nucleo; Anti­Jo1; Anti­Pm­SclAnti­aminoacil tRNA sintetasi(PL­12, PL­7, EJ, OJ, KS)Anti­Mi­2; Anti­SRP

PolimiositeDermatomiosite

Anti­nucleoAnti­Scl70

Sclerosi Sistemica

Anti­centromero Sindrome di CREST

Anti­cardiolipinaLACAnti­Beta2 glicoproteina i

Anti­fosfolipidi

Anti­citrullinaFattore reumatoide

Artrite reumatoide

Tab. 3: Malattie autoimmuni intermedie

Tab. 4: Malattie autoimmune non organo specifiche

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iNqUADrAMeNTo CLiNiCo DeLLe MALATTie AUToiMMUNi NoN orGANo sPeCifiChe

Lupus eritematoso sistemico (Les)Prevalenza: 14.6 a 50.8 per 100.000 abitanti. in italia 20 ogni 100.000 abitanti.incidenza: 2.6 a 4.6 ogni 100.000 abitanti

Artrite reumatoide (Ar)Prevalenza 500 casi /anno. incidenza 1 milione /anno. La diagnosi è principalmente clinica.

CriTeri CLiNiCi

Alterazioni ematologiche:• anemia emolitica• leucopenia• linfocitopenia• Trombocitopenia

Disordini immunologici:• autoanticorpi anti dsDNA• autoanticorpi anti Sm• positività degli anticorpi antifosfolipidi (LAC)• aumentati livelli di anticardiolipina igG o igM

• autoanticorpi anti nucleo (ANA)

CriTeri CLiNiCi

• Rigidità mattutina della durata di almeno un’ora• Artrite a livello di almeno 3 articolazioni, inter­

essate simultaneamente, con tumefazione e versamento rilevati da un medico.

• Artrite delle mani a livello delle articolazioni interfalangee, prossimali, metacarpofalangee o radio­carpiche.

• Artrite simmetrica ad interessamento simultaneo delle stesse articolazioni.

• Noduli reumatoidi sottocutanei sulle superfici ossee estensorie o iuxtaarticolari, osservate da un medico.

• FR presente a livello del siero.• Segni radiologici (osteoporosi iuxtaarticolare o

erosioni a livello delle mani o polsi).

CriTeri DiAGNosTiCi

• Eritema a farfalla

• Eritema discoide

• Fotosensibilità

• Ulcere orali

• Artrite

• Sierosite (pericardite e/o polmonite)

• (proteinuria > 0.50 g/die e/o cilindri)

• Manifestazioni neurologiche

• (psicosi/convulsioni)

CriTeri DiAGNosTiCi

• FR presente nel 70% dei casi

• Anti CCP presente nell’80% dei casi

• Esami sul liquido sinoviale, caratteristiche

chimico­fisiche:

– Volume: > 4 ml

– Colore: giallo carico

– Trasparenza: opaco

– Viscosità: ridotta

– Coagulo: friabile

– Cellule/mm3 : 2000­50000

– Polinucleati (%): > 70

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E’ inoltre possibile eseguire i seguenti esami nel liqui­do sinoviale ma con una sensibilità e specificità non adeguate e sufficienti ai fini diagnostici :Proteine che sono aumentate fino a 4­7 g/dlGlucosio diminuitoFrazioni del complemento diminuiteFR che si comporta come nel siero e talvolta può esse­re presente nel liquido sinoviale ma assente nel siero e quindi utile per le AR sieronegative.Conteggio dei globuli bianchi tra 2000 e 50000 ed il 90% sono granulociti neutrofili

Livelli elevati di tutte le citochine proinfiammatorie iL1, iL6, iL8, TNFα , iL1β. TNFα e iL1β sono i maggiori responsabili del danno articolare.L’esame sul liquido sinoviale nei pazienti in corso di Artrite Reumatoide può risultare utile per identificare l’origine flogistica del campione, potendo fornire in­formazioni al clinico sia di tipo prognostico che di un’efficace terapia, anche se non è possibile raggiun­gere una diagnosi precisa.

sindrome sjögren (ss) e crioglobulinemia mistai dati di prevalenza ed incidenza della SS non sono noti.

CriTeri CLiNiCi

• Sintomi oculari: risposta affermativa ad almeno 1 delle 3 domande validate

• Sintomi orali: risposta affermativa ad almeno 1 delle 3 domande validate

• Segni oculari: risultato positivo al test di Schir­mer i e/o test con Rosa bengala

• Analisi istopatologica delle ghiandole salivari minori

• Coinvolgimento delle ghiandole salivariAutoanticorpi: presenza di anticorpi anti­SSA o anti­SSB o entrambiPer la definizione di SS primariaLa presenza di almeno 4 su 6 dei precedenti criteri, di cui uno almeno istopatologico e uno almeno sierologico.Criteri di esclusioneirradiazione testa­collo, infezione da HCV e HiV, linfoma pre­esistente, sarcoidosi, GVHD, uso di farmaci anticolinergici.

CriTeri DiAGNosTiCi

• Leucopenia (<4000/ul)

• Linfopenia (<1500/ul)

• ANA (≥1/80) speckled

• Anti SSA

• Anti SSB

• Fattore Reumatoide (>20Ui/ml)

• Crioglobuline

• ipergammaglobulinemia (> 1800 mg/ml)

• Componente monoclonale sierica

• C3 ridotto

• C4 ridotto

• LDH elevato

• Beta2­microglobulina sierica elevata

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Poli/DermatomiositiGli autoanticorpi anti nucleo ANA si rilevano nel 60­80% dei pazienti con miopatia autoimmune. Tuttavia il test ANA non è specifico e risulta negativo nel 20% dei pazienti con miosite autoimmune.

il test ANA deve essere affiancato da test più specifici per la ricerca delle specificità antigeniche. Di seguito i tests specifici e le ricerche autoanticorpali associate alla Miosite.

CriTeri CLiNiCi

Malessere generalizzato (astenia, calo ponderale, febbricola)

• interessamento cutaneo (diffuso, limitato)

• Fenomeno Raynaud

• interessamento gastrointestinale

• interessamento polmonare

• interessamento cardiaco

• interessamento renale

CriTeri DiAGNosTiCi

Miosite specifici

Gli anticorpi miosite­specifici (MSA) sono caratte­ristici di miosite e considerati markers di malattia:

• Anti­Jo1 (istidil­tRNA sintetasi)

• Anti­aminoacil tRNA sintetasi (PL­12, PL­7, EJ, OJ, KS)

• Anti­Mi­2

• Anti­SRP

CriTeri DiAGNosTiCi

• Topoisomerasi i (Scl70) nel 70% in SSc cutanea

diffusa

• Centromero nel 70­80% in SSc cutanea limitata

– RNA pol i 4% dei casi (marker diagnostico)

– Fibrillarina 8% dei casi (marker diagnostico)

– PM­Scl 3% dei casi

– To/Th rara

– Ku rara

– NOR­90 rara

CriTeri DiAGNosTiCi

• Topoisomerasi i (Scl70) nel 70% in SSc cutanea

diffusa

• Centromero nel 70­80% in SSc cutanea limitata

– RNA pol i 4% dei casi (marker diagnostico)

– Fibrillarina 8% dei casi (marker diagnostico)

– PM­Scl 3% dei casi

– To/Th rara

– Ku rara

– NOR­90 rara

sclerosi sistemica progressivaPrevalenza 240­280 casi per milione, incidenza 18­20 casi per milione di abitanti/anno.

ii. DiAGNosTiCA

1. Linee Guidail metodo di riferimento per la ricerca degli autoanti­corpi anti nucleo è l’immunofluorescenza indiretta su cellule Hep­22. Con questa metodica è possibile rile­vare la presenza di autoanticorpi che riconoscano antigeni nucleari e citoplasmatici senza identificarli in modo specifico: quindi, in caso di positività per gli

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autoanticorpi anti nucleo è consigliata la ricerca spe­cifica degli antigeni nucleari estraibili (ENA screen) ed ENA profilo come conferma.Con la metodica in immunofluorescenza indiretta, in caso di esito positivo vengono descritti i seguenti qua­dri fluoroscopici o patterns2:

PATTerN ANTiGeNi AssoCiAzioNe CLiNiCA

Omogeneo istoni,dsDna ,Complessi Dna­istoni

LES, LES indotto da farmaci

Granulare (punteggiato)

Sm, RNP, SSA(Ro), SSB(La) Malattie autoimmuni reumatiche, LES, MCTD, SS

Nucleolare fibrillarina, RNA polimerasi, NOR90, Scl70, PM/Scl

Malattie autoimmuni reumatiche, LES, Sclerodermia, Miositi

Centromerico (CENP-A; B, C)

Proteine centromeriche A,B,C Sclerodermia, Sindrome CREST

Nuclear Dots Sp 100, PBC 95NSpl (proteina 95/100 kD)

Malattie autoimmuni epatiche e reumatiche

quadri fluoroscopici più comuni:

PATTerN ANTiGeNi AssoCiAzioNe CLiNiCA

Fuso mitotico NUMA

Proteina 235­kDa LES e altre patologie reumatiche

Fibre del fuso mitotico

Antigeni dei poli del fuso comprendenti la tubulina

Non definite

Midbody Antigeni presenti nel solco di clivaggio delle cellule in divisione

SSc

Cetrioli Antigeni del centrosoma Non definite raramente SSc

quadri fluoroscopici mitotici:

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PATTerN ANTiGeNi AssoCiAzioNe CLiNiCA

Mitocondri Antigeni associati al complesso Piruvato Deidrogenasi

Tipo M2­M4 Cirrosi Biliare Primitiva

Ribosoma Fosfoproteine dei ribosomi P0, P1, P2

LES con coinvolgimento del sistema nervoso centrale

Lisosoma Antigeni lisosomiali Non definite

Golgi Proteine del Golgi Non definite

Granulare (Jo1) istidil­tRNA sintetasi PM

Citoscheletro Actina, Vimentina, Citocheratina Epatopatie, AR, MCTD

quadri fluoroscopici Citoplasmatici:

PATTerN ANTiGeNi AssoCiAzioNe CLiNiCA

PCNA Proliferating Nuclear Antigen LES

CENP-F Proteina Centromerica F Tumori, malattie croniche epatiche, malattie sistemiche reumatiche

Nuclear Matrix hnRNP LES, SSc, MCTD

NOR90 Nucleolar Organizing Regions SSc

Membrana nucleare

Lamine nucleari A,B,C, e pori nucleari Epatopatie autoimmuni

quadri fluoroscopici rari:

Legenda: LES = Lupus Eritematoso sistemico; SS = Sindrome di Sjögren; SSc = Sclerosi Sistemica cutanea; MCTD = Malattie del Tessuto Connettivo Miste; PM = Polimiosite; AR = Artrite Reumatoide; CREST = Calcinosi, fenomeno di Raynaud, Esofagodattilia, Sclerodattilia, Telangectasia.

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2. Descrizione degli antigeni e associazioni cliniche

SSAL‘antigene intracellulare SS­A/Ro è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Lupus Erite­matoso Sistemico (LES), Sindrome di Sjögren (SS) ed altre malattie del connettivo2. Gli studi hanno dimostra­to che gli anticorpi anti­SS­A/Ro si trovano nel 95% dei pazienti con la Sindrome di Sjögren primaria e nel 30­50% dei pazienti con LES, essendo associati parti­colarmente con dermatite fotosensibile. Gli autoanti­corpi si trovano spesso anche nella maggioranza di pazienti con Lupus Eritematoso cutaneo subacuto o LES anticorpo antinucleare negativo.

ANTICORPI ANTI SSA (Ro) 52 kD ANTICORPI ANTI SSA (Ro) 60 kD L’antigene SSA (Ro) è costituito da due proteine 52 kD e 60 kD.

La positività solo per autoanticorpi anti SSA 52 kD, secondo alcuni studi, è rilevabile quasi esclusivamente in soggetti con SS (Sindrome di Sjögren), mentre la presenza di solo autoanticorpi anti SSA 60 kD è rile­vabile nei soggetti affetti da LES2. inoltre la positività soprattutto per anticorpi anti SSA 52 kD , ma anche per SSA 60 kD nel siero materno, possono causare lo sviluppo del LES neonatale, con conseguente manife­stazione clinica del blocco atrio­ventricolare congenito.

SSBL‘antigene intracellulare SS­B/La è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Sindrome di Sjögren (SS), Lupus Eritematoso Sistemico (LES), e altre malattie del connettivo. Gli studi hanno dimostra­to che gli anticorpi anti­SS­B/La si trovano nell’87% dei pazienti con la Sindrome di Sjögren primaria e nel 15% circa dei pazienti con LES. Gli autoanticorpi si trovano spesso anche in presenza di anti­SS­A/Ro.

SML‘antigene intracellulare Sm è un bersaglio per la rispo­sta autoimmune in molti pazienti con Lupus Eritemato­so Sistemico (LES) ed è considerato altamente specifi­

co per questa malattia2. Gli anticorpi anti­Sm reagiscono con le piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNP) che contengono almeno 9 polipeptidi. Gli studi di immunoblotting hanno comunque dimostrato che gli anticorpi anti­Sm si legano principalmente alle proteine SmB, SmBi e SmD. Gli studi hanno anche dimostrato che gli anticorpi anti­Sm si manifestano nel 30­40% dei pazienti con LES, ma sono state osservate percentuali più elevate in pazienti non caucasici.

SM/RNPL‘antigene intracellulare Sm/RNP è un complesso di componenti Sm e RNP. il complesso antigene Sm/RNP è un bersaglio per la risposta immune in molti pazienti con la malattia mista del connettivo (MCTD), Lupus Eritematoso Sistemico (LES), Sindrome di Sjo­gren primaria (SS) e Sclerodermia (PSS)2. Gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi anti­Sm/RNP si ma­nifestano in oltre il 95­100% dei casi di MCTD, nel 35­45% dei pazienti con LES e nel 30% circa dei pazienti con SS.

ANTICORPI ANTI RNP ANTI RNP 68 ANTI RNP A Gli autoanticorpi anti RNP (ribonucleoproteina) rico­noscono nella maggior parte dei casi gli antigeni U1 68­70 kD e U1­A. La positività per questi antigeni si rileva nei pazienti affetti da Artrite reumatoide, miocar­dite e nei pazienti affetti da LES. Gli autoanticorpi anti RNP sono presenti in pazienti affetti da LES con una sensibilità diagnostica del 30% e 40%, ma hanno una bassa specificità, poiché presenti in elevata percentu­ale nei soggetti con MTCD (malattie del tessuto con­nettivo miste).

Sono significativi quando presenti a titolo elevato poiché sono criterio diagnostico importante nei pa­zienti affetti da MTCD, anche se il dato quantitativo non correla con l’andamento della patologia.

Non sono indicativi di patologia specifica quando presenti in basse concentrazioni perché sono rilevabi­li in altre malattie reumatiche come la sclerosi sistemi­ca e l’artrite reumatoide.

anche in altre condizioni patologiche come AR, LES, SS e PBC (Cirrosi Biliare Primitiva)2.

La SSc limitata cutanea è una patologia limitata alla pelle, alle estremità delle braccia, basse gambe e tal­volta faccia e collo. E’ denominata anche CREST (Cal­cinosi, fenomeno Raynaud, Esofagodattilia, Sclerodat­tilia, Telangectasia).

L’utilizzo diagnostico di questo test è stimato con una sensibilità del 33% e una specificità del 99.9%.

L’utilizzo come marcatore prognostico e di definizione del subset cutaneo limitato è caratterizzato da una sensibilità del 61% e specificità del 84%, mentre non si riscontra una rilevanza clinica come marcatore per il monitoraggio della patologia.

ANTI DNA NATIVO o dsDNA (double-strand DNA = DNA a doppia elica)il DNA è un antigene presente sia sotto forma di dop­pia elica (ds = double strand) o nativo che in singola elica (ss = single strand). La ricerca degli autoanticor­pi è rivolta soprattutto verso la forma nativa del DNA o a doppia elica perché è più specifico per la patolo­gia LES.

Ci sono due importanti ma differenti utilizzi diagnosti­ci della ricerca degli autoanticorpi anti Dna nativo:

• screening e ausilio diagnostico in caso di sospetta malattia autoimmune

• monitoraggio clinico di pazienti affetti da LES

in pazienti con LES in fase attiva si rilevano livelli ele­vati di autoanticorpi anti dsDNA, mentre in pazienti in fase di remissione questi autoanticorpi sono presenti in basse concentrazioni, o assenti.

Gli autoanticorpi presenti in circolo, tuttavia, compren­dono una popolazione anticorpale che differisce per:

• Avidità (bassa o alta avidità)

• Classe immunoglobulinica

• Specificità antigenica

Tuttavia è stato recentemente dimostrato un ruolo pre­dittivo nel lupus, dato che possono essere evidenziati nel siero fino a 7 anni prima della comparsa della patologia.

SCL70L‘antigene intracellulare Scl­70 è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Scleroder­mia o Sclerosi Sistemica Progressiva (SSP) ed è consi­derato specifico per questa malattia. Gli anticorpi anti­Scl­70 si trovano nel 20­30% circa dei pazienti affetti da Sclerodermia2. Circa il 20­30% dei pazienti affetti da Sclerodermia presentano caratteristiche sinto­matologiche tipiche della sindrome di CREST (Calci­nosi­Raynaud­Esofagodattilia­Sclerodattilia­Telangecta­sie).

JO1L‘antigene ENA Jo­1 è un bersaglio per la risposta autoimmune in molti pazienti con Polimiosite e Derma­tomiosite e gli anticorpi anti Jo­1 sono considerati indi­catori per queste malattie. Nella Polimiosite il muscolo striato si infiamma e la fibra muscolare si degrada2. Quando sussiste questa condizione, assieme ai cam­biamenti tipici cutanei, è conosciuta come Dermatomi­osite. Circa il 25% dei pazienti affetti da queste malattie autoimmuni dimostrano livelli superiori di anticorpi anti­Jo­1. Gli anticorpi Jo­1 sono inoltre associati alla fibrosi polmonare ed al fenomeno di Raynaud (estremo spasmo dei vasi sanguigni in risposta al freddo o allo stress).

ANTI CENTROMERO CENP-B Gli anticorpi anti centromero riconoscono una fami­glia di proteine localizzata nella regione centromerica delle cellule eucariotiche. Le proteine associate al cen­tromero sono CENP­A, CENP­B, CENP­C, CENP­D, CENP­E, CENP­F e CENP­G. Le tre principali proteine sono CENP­A, CENP­B, CENP­C.

La positività per gli anticorpi anti centromero è asso­ciata alla Sclerosi Sistemica Cutanea limitata (lcSSc), soprattutto la sua variante limitata o CREST. Gli anti­corpi anti centromero possono essere identificati

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Per la diagnosi del LES il test utilizzato per la ricerca degli autoanticorpi anti ds­DNA deve avere un’elevata specificità, tuttavia per quanto riguarda l’avidità anti­corpale, questa caratteristica è inversamente proporzio­nale alla sensibilità del test; infatti per rilevare gli auto­anticorpi a bassa avidità è necessario utilizzare metodi con una maggiore sensibilità a scapito della specificità.

Esiste una correlazione tra l’avidità anticorpale e l’implicazione dell’organo:

• gli anticorpi ad alta avidità sono correlati all’implicazione renale, mentre gli anticorpi a bassa avidità sono presenti anche in patologie reumati­che diverse dal LES oppure in pazienti con forme di LES meno aggressive o con bassa frequenza di epi­sodi di nefrite.

Per i motivi sopra descritti in funzione della diversa avidità anticorpale, per lo screening è consigliabile eseguire un metodo con un’elevata sensibilità e suc­cessivamente, in caso di positività, eseguire un secon­do test con elevata specificità.

ANTI ssDNA (single-strand DNA = DNA a singola elica)Gli autoanticorpi anti ssDNA sono rivolti contro la componente basica che nel DNA a doppia elica (dsDNA) è mascherata all’interno della struttura a eli­ca. Sono presenti nell’87% dei pazienti affetti da LES nelle fasi acute e nel 43% dei pazienti nelle fasi inatti­ve. Rappresentano un utile strumento diagnostico nel­la diagnosi differenziale tra LES e LES indotto da far­maci, tuttavia sono rilevabili in concentrazioni elevate anche in pazienti affetti da Mononucleosi, Epatite e varie forme di Leucemia.

ANTICORPI ANTI CROMATINA (NUCLEOSOMA)il DNA nella cellula è presente complessato in nucleo­somi che rappresentano la struttura base della croma­tina.

i nucleosomi sono costituiti da un dimero di quattro proteine istoniche H2A, H2B, H3, H4 complessate con il DNA. i nucleosomi sono uniti tra loro mediante un filamento di DNA a cui è attaccato la proteina isto­nica H1.

Gli autoanticorpi anti nucleosomi sono presenti in di­verse patologie autoimmuni, anche se prevalenti nel

LES (3) :

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LINF. T

CEL

LULA

TIM

ICA

Ottamero istonico Istone H1 DNA

Nucleosoma

Fig. 3: Nucleosoma

PAToLoGiA% ANTiCorPi ANTi

NUCLeosoMALES (Lupus Eritematoso Sistemico) 85.1%

AR (Artrite Reumatoide) 45.4%

MTCD (Malattie del tessuto con­nettivo miste)

41.1%

SSc (Sclerosi Sistemica cutanea) 36.3%

SS (Sindrome di Sjögren 10%

Tab. 5: Patologie autoimmuni e anticorpi anti nucleosoma

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ANTICORPI ANTI ISTONIGli autoanticorpi anti istoni sono rivolti contro le prote­ine H1, H2A, H2B, H3, H4, e sono presenti in diver­se patologie autoimmuni, sistemiche e organo speci­fiche come LES (Lupus Eritematoso Sistemico), AR (Artrite Reumatoide), Artrite cronica giovanile, Cirrosi biliare primitiva, Epatite Autoimmune, Polimiosite/Der­matomiosite. inoltre sono presenti in pazienti con pa­tologie autoimmuni indotte da farmaci, patologie neu­rologiche e infettive.

A differenza degli autoanticorpi anti nucleosoma la positività per gli anticorpi anti istoni non è indicativa di patologia, data anche la loro presenza in diverse patologie: quindi non hanno nessuna utilità dal punto di vista diagnostico e prognostico.

Data la maggiore prevalenza di positività nel LES, la presenza di questi anticorpi potrebbe precedere la formazione di anticorpi specifici anti nucleari come anti ds­Dna e anti istoni (8).

Esistono dati contrastanti relativamente all’utilità diagno­stica della ricerca degli autoanticorpi anti nucleosomi, al significato clinico e specificità di questi autoanticor­pi per il LES, ed il loro utilizzo come indicatori per il monitoraggio della patologia e di coinvolgimento d’organo.

Da alcuni studi è emerso che proprio per la maggiore prevalenza di positività nella patologia LES possono essere inseriti come test aggiuntivo nella diagnostica della patologia per le seguenti caratteristiche (7) :

• per alcuni pazienti affetti da LES sono presenti in maggiore prevalenza rispetto agli autoanticorpi anti dsDNA

• presentano una migliore correlazione con il lupus nefritico o l’attività della patologia nel LES rispetto agli anticorpi anti dsDNA

• la reattività per gli autoanticorpi anti nucleosomi può essere rilevata nel 40% dei pazienti con lupus che sono negativi per gli autoanticorpi anti dsDNA

il valore prognostico degli autoanticorpi anti nucleoso­mi per la progressione della patologia ed il monito­raggio nelle fasi culminanti della malattia autoimmune non è ancora chiaro.

Secondo altri studi, nonostante l’elevata prevalenza di presenza di questi autoanticorpi in pazienti affetti da LES, non sono ancora ben chiari alcuni punti:

• se rappresentano markers specifici della patologia;

• se sono effettivamente indicatori utili per il monito­raggio;

• se esiste un’effettiva correlazione tra la positività per questi autoanticorpi, l’attività della malattia e il dan­no renale(3).

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il metodo di riferimento per la ricerca degli autoanti­corpi per le patologie sistemiche non organo­speci­fiche è l’immunofluorescenza indiretta. Questa metodi­ca prevede l’utilizzo di un substrato costituito da cellule Hep­2 (cellule epiteliali da carcinoma di larin­ge). il siero viene dispensato su questo substrato ed incubato per la ricerca degli eventuali autoanticorpi presenti. Per l’identificazione anticorpale e la visione mediante microscopia a fluorescenza si utilizza un co­niugato associato ad un fluoroforo FiTC specifico.

Questa metodica è caratterizzata da un’elevata sensi­bilità perché permette di rilevare autoanticorpi contro tutti gli antigeni nucleari e citoplasmatici, ma ha una scarsa specificità poiché non riesce ad individuare in modo specifico l’antigene. Per l’identificazione degli antigeni nucleari e citoplasmatici specifici (ENA) è ne­cessario procedere all’approfondimento diagnostico con Ena profilo cioè il dosaggio degli antigeni: Ssa, SSb, Sm, Sm/RNP, Jo1, Scl70, CENP­B.

La metodica in immunofluorescenza presenta delle li­mitazioni determinate da:

• perdita di alcuni antigeni critici (Ssa, SSb, Jo1, Ri­bosoma P, RNP) legato alla metodica stessa o per difficoltà interpretative

• difficoltà di riproducibilità dei dati legato alla lettura soggettiva a microscopio e alla metodica

• tempistica di refertazione

• bassa specificità

Fig. 4: Immagini di autoanticorpi anti nucleo con metodica immunofluorescenza indiretta. Substrato cellule Hep-2

22

Per i motivi sopra descritti, sono state valutate metodi­che di screening alternative.

Le metodiche valutate sono ELiSA e nuove tecnologie (chemiluminescenza, luminescenza), che utilizzano substrati costituiti da un mix di antigeni nucleari e cito­plasmatici specifici per le connettiviti autoimmuni.

Le caratteristiche di sensibilità e specificità dei diffe­renti metodi sono di seguito riportate:

Le linee guida per la ricerca degli autoanticorpi anti nucleo (2), identificano come test di riferimento la me­todica in immunofluorescenza indiretta su cellule Hep­2, tuttavia è possibile utilizzare un metodo di scree­ning alternativo solo se soddisfa i seguenti requisiti:

• Concordanza con il metodo iFA non inferiore al 90% (livello decisionale > o = 1/160)

• Ogni laboratorio deve valutare l’applicabilità di questi livelli decisionali in base alle caratteristiche della propria casistica/popolazione

• Riconoscere autoanticorpi importanti dal punto di vista prognostico, come quelli diretti verso i nucleoli o la membrana nucleare

• i risultati positivi devono essere successivamente confermati con il metodo iFA, con specificazione del pattern e del titolo

• i dati discordanti (positivi con metodo di screening e negativi in iFA) vanno valutati per la presenza di anti­Ssa e Jo1; se questi antigeni sono negativi la positività con il metodo di screening è da consider­arsi come falso positivo, tranne in caso di sospetto clinico di MAiS (Malattie autoimmuni immunitarie sistemiche), dove i pazienti vanno monitorati nel tempo.

MeToDi % seNsiBiLiTÀ e sPeCifiCiTÀ

iFA (immunofluorescenza indiretta) sensibilità 92%specificità 65%

ELiSA sensibilità compresa tra 32% e 69%specificità compresa tra 68% e 98%

MULTiPLEX LUMiNEX sensibilità compresa tra 77% e 100% specificità compresa tra 92% e 100%

CHEMiLUMiNESCENZA sensibilità 96.30% specificità 97.60%

Tab. 6: Specificità dei differenti metodi

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NUoVe ProsPeTTiVe

La disponibilità di nuove tecnologie ci ha permesso di valutare metodiche alternative all’immunofluorescenza indiretta: in particolare abbiamo analizzato 1205 sie­ri richiesti in routine per la ricerca degli autoanticorpi antinucelo con la metodica in immunofluorescenza in­diretta e con la tecnologia Multiplex Luminex, median te la strumentazione automatica Bioplex 2200.

A seguito di questo studio descritto in un poster pre­sentato al Congresso internazionale di Autoimmunità tenutosi a Porto nel Settembre 2008, “BioPlexTM2200 MULTiPLEX ANASCREEN ASSAY: A NOVEL AP­PROACH FOR THE DETECTiON OF ANTiNUCLEAR AUTOANTiBODiES”, abbiamo inserito questo sistema per lo screening degli autoanticorpi anti nucleo.

il nuovo test ANA screen prevede la ricerca degli auto­anticorpi contro gli antigeni dsDNA, Cromatina (nu­cleosoma), P­ribosoma, SSA, SSB, Sm, snRNP, Sm/RNP, Scl­70, Jo1, centromero CENP­B per le malattie autoimmuni non organo specifiche, connettiviti autoim­muni: Lupus Eritematoso Sistemico (LES), Malattie del Tessuto Connettivo Miste (MCTD), Polimiositi/Derma­tomiositi (PM/DM), Artrite Reumatoide (AR), Sclerosi Sistemica cutanea (SSc), Sindrome di Sjögren (SS), Sclerodermia, CREST (Calcinosi, fenomeno di Rayn­aud, disfunzione esofagea, sclerodattilia e telangecta­sia) (tab. 7).

Questa tecnologia consente l’identificazione di diversi analiti contemporaneamente sullo stesso campione, utilizzando beads (microsfere) magnetiche con adesi gli antigeni nucleari e citoplasmatici.

il siero viene incubato con la miscela delle beads e dopo l’aggiunta di un anticorpo anti igG umano lega­to ad un secondo fluoroforo specifico, le beads pas­sano attraverso un citometro a flusso che identifica e quantifica il segnale.

il sistema prevede inoltre l’utilizzo di 3 beads speci­fiche per la verifica del funzionamento del sistema di lettura, delle interferenze causate da legami aspecifi­ci, della presenza del volume di campione necessario per l’esecuzione del test.

Le caratteristiche principali del test ANA screen, in confronto alla metodica in immunofluorescenza indi­retta, sono rappresentate dalla possibilità di rilevare gli autoanticorpi contro antigeni critici non rilevabili con la metodica in immunofluorescenza indiretta, dal­la standardizzazione e riproducibilità dei dati, in par­ticolare per i campioni con esiti di dubbia o bassa positività, e dalla riduzione delle tempistiche di refer­tazione.

il test in immunofluorescenza indiretta viene utilizzato solo a seguito della positività del test ANA screen con metodica Multiplex Luminex.

il test in immunofluorescenza indiretta viene comunque eseguito su richiesta per i pazienti con patologie au­toimmuni in monitoraggio (Artrite Reumatoide, Epato­patie Autoimmuni etc.), o pazienti con forte sospetto e sintomatologia decisamente suggestiva di patologia autoimmune, con esito ANA screen negativo.

Queste richieste particolari e le informazioni cliniche del paziente vengono raccolte mediante una Scheda Anamnestica che abbiamo consegnato a tutti i nostri punti prelievo e ai nostri laboratori clienti service.

E‘ molto utile quindi per la diagnostica delle patologie autoimmuni avere le informazioni cliniche del pazien­te e una collaborazione diretta con il Medico/Spe­cialista.

• identificazione di autoanticorpi contro gli antige­ni critici per la metodica immunofluorescenza in­diretta (iFi), quali: Ssa/Ro con la possibilità di distinguere e dosare SSA 52 kD e 60 kD, Jo1, P Ribosoma, U1 snRNP distinto nelle frazioni A e 68 kD associati alle Malattie del Tessuto Connet­tivo Miste (MCTD)

• standardizzazione e riproducibilità dei dati

• riduzione delle tempistiche di refertazione

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ALGoriTMo DiAGNosTiCo

Per le richieste di screening per le Connettiviti Autoimmuni abbiamo introdotto il seguente algoritmo diagnostico:

*In caso di esiti negativi per ANA screen e forte sospetto di malattia autoimmune e/o su richiesta specifica del Medico/ Specialista eseguiamo il test in Immunofluorescenza Indiretta.Legenda: iFA= immunofluorescenza indiretta; REF=Refertazione

POS/DUB NEG

ifT ref* ifT ref eNA refProf.

POS/DUB NEG POS NEG

dsDNA Multiplex Luminex

ENA screen Multiplex Luminex

ANA screen Multiplex Luminex

Fig. 5: Screening per le Connettiviti Autoimmuni

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Legenda: LES= Lupus Eritematoso Sistemico. SS= Sindrome di Sjögren. SSc= Sclerosi Sistemica cutanea CREST= Calcinosi, fenomeno di Raynaud, disfunzione esofagea, sclerodattilia e telangectasia. MCTD= Malattia del Tessuto Connettivo Mista

ANTiGeNi oriGiNeANTiGeNi

AssoCiAzioNi CLiNiChe

PerCeNTUALe PreVALeNzAANTiCorPALe

DsDNA(1) Sintetizzato da PCR LES 40­80%

CROMATINA(3) Nucleoistone purificato LESARMTCDSScSS

85.1%45.4%41.1%36.3%10%

SSA(4,5)

SSA 52 kDSSA 60 kD

Antigene purificato per affinità

SS, LES, LES neonatale incluso il blocco cardiaco congenito

25­30% LES 40% SS

SSB(4,5) Antigene purificato per affinità

LESSS

15%50­60% di solito associati a SSA

SM(4,5) Antigene purificato per affinità

LES 25­40%

SM/RNP(1,4,5,) Antigene nativo purifica­to

MTCDLES

95%30­70%

RNP(4,5)

RNP 68 kD RNPA

Antigene ricombinante MTCD 46%

CENTROMERO CENP B(6)

Antigene ricombinante CRESTSclerosi cutanea limitata (lcSSc)

70­80%

P RIBOSOMA(1,7) Antigene purificato per affinità

LES associato con nefrite e coinvolgi­mento del SNC, incluso epilessia e disordini psichiatrici

10­40%

SCL 70(4,5,6) Antigene ricombinante SclerodermiaSSc diffusa

20­28%70%

Jo1(4,5) Antigene ricombinante Polimiosite 18­36%

in tabella 6 riportiamo l’elenco degli antigeni, utilizzati per lo screening degli autoanticorpi antinucleo mediante tecnologia Multiplex Luminex, con la descrizione dell’origine dell’antigene e le associazioni cliniche.

Tab. 7: Elenco antigeni e associazioni cliniche

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Per ottimizzare ed utilizzare al meglio le potenzialità di questa nuova tecnologia, consigliamo di seguire il seguente algoritmo diagnostico:

Legenda: Pannello connettiviti Pannello LES Pannello MCTD Pannello SS Pannello scleroder-

mia (SSP)/CREST

DsDNA, Cromatina, Ssa (52&60 kD), SSb, Sm, Sm/RNP,RNP(A&68 kD), Scl70, Jo1, Riboso­ma P, CENP­B

dsDNA, Cromatina, Ssa (52&60 kD), SSb, Sm, Sm/RNP, Ribosoma P

RNP68&A kD Sm/RNP

Ssa52&60 kDSSb

Scl70, CENP­B

ANA sCreeN MULTiPLeX LUMiNeX(ANA-eNA sCreeN-dsDNA)

POS/DUBBIO

PANNELLI SPECIFICI MULTIPLEX LUMINEX:Connettiviti

LESMCTD

SSSclerodermia/SSP

in caso di forte sospetto di malattia autoim­mune e/o richiesta specifica del Medico/Specialista, si procede con l’esecuzione del test immunofluorescenza indiretta su cellule Hep­2. Per sospetto di Polimiosite/Dermato­miosite e patologie autoimmuni del fegato si procede con l’esecuzione dei test specifici in immunoblot

NEG

Fig. 6: Seguente algoritmo diagnostico

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CoNCLUsioNiriferiMeNTi BiBLioGrAfiCi

Con questa brochure abbiamo tracciato un percorso sintetico relativo alle nozioni base di immunologia, le problematiche immunologiche che possono determi­nare le patologie autoimmuni, la descrizione delle patologie stesse e i metodi diagnostici.La diagnostica di queste patologie è tuttavia comples­sa e la Medicina di Laboratorio può solo fornire un supporto al clinico che in funzione della sintomatolo­gia valuterà attentamente tutto il quadro degli esami eseguiti.Per questo il nostro Laboratorio è sempre attento alle nuove tecnologie che possano facilitare ed aiutare lo specialista nell’inquadramento delle patologie autoim­muni in tempistiche ristrette mantenendo la qualità del dato analitico o in alcuni casi migliorandola.i nuovi algoritmi diagnostici proposti hanno proprio l’obiettivo di snellire la richiesta di questi esami e di fornire utili informazioni per gli eventuali approfondi­menti diagnostici specifici.Per la caratteristica di questa diagnostica sempre in evoluzione, a questa prima edizione della Brochure relativa all’autoimmunità faranno seguito degli aggior­namenti.

1) R.Tozzoli, N. Bizzarro, D. Villalta, E. Tonutti. il labo­ratorio nelle malattie reumatiche autoimmuni.2) . R. Tozzoli; N. Bizzarro. La diagnostica di labora­torio delle malattie autoimmuni sistemiche. La Medici­na di Laboratorio Vol. iX N.1, 1998.3) P. Quattrocchi e coll. Ruolo degli anticorpi anti­nu­cleosoma nel lupus eritematoso sistemico. Risultati di uno studio condotto in pazienti con lupus eritematoso sistemico ed altre connettiviti sistemiche. Reumatismo, 2005; 57(2):109­113.4) White, R. H.; Robbins, D. L: Clinical Significance and interpretation of Antinuclear Antibodies. West. J. Med. 1987, 147, 210­213.5) Maddison, P. J.; Skinner, R. P.; Vlachoyannopoulos, P. ; Brennand, D. M. ; Hough, D. Antibodies to nRNP, Sm, Ro(SSA) and La(SSB) detected by ELiSA: their spe­cificity and inter­relations in connective tissue disease sera. Clin.Exp. immunol. 1985, 62 337­345.6) D. Bassetti. Gli esami di autoimmunologia nella diagnosi e nel monitoraggio della Sclerosi Sistemica. La risposta del laboratorio. RiMeL/iJLaM 2007; 3 (suppl).7) Y.Sherer, Y. Shoenfeld. Autoantibodies guide in Systemic Lupus Erythematosus. First Edition.E. Jenny Heathcote Management of Primary Biliary Cirrhosis. Hepatology Vol 31, No. 4, Aprile 2000.

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