DIPARTIMENTO DI MEDICINA SPERIMENTALE

TESI DI

DOTTORATO DI RICERCA

IN

GENETICA MEDICA - XXVI CICLO -

Coordinatore: Prof.ssa Paola Grammatico

Caratterizzazione funzionale della proteina SHOC2 e

della sua forma miristilata implicata nella sindrome di Mazzanti

DOTTORANDA Marialetizia Motta

TUTOR

Dott. Marco Tartaglia

Direttore del reparto di fisiopatologia delle malattie genetiche

Dip. EOMM, Istituto Superiore di Sanità, Roma

2

INDICE

ABBREVIAZIONI 4

INTRODUZIONE 6

La sindrome di Noonan 6

Caratteristiche cliniche 6

Aspetti genetici 8

Diagnosi 9

Terapia 11

La sindrome di Noonan con “loose anagen hair” o 12

sindrome di Mazzanti

La proteina SHOC2 13

FINALITÀ DELLA RICERCA 16

MATERIALI E METODI 17

Analisi in silico 17

Preparazione dei costrutti 17

Colture cellulari e trasfezione 20

Omogenati cellulari e dosaggio proteico 20

Preparazione di microdomini di membrana (lipid rafts) 21

Elettroforesi e Western Blotting 21

Microscopia confocale a scansione laser (CLSM) 22

3

RISULTATI 24

Espressione delle proteine SHOC2 mutate 24

La traslocazione nel nucleo di SHOC2WT

non è mediata dalla NLS 25

La stabilità in membrana di SHOC2S2G

non dipende dalla palmitolazione 25

Il targeting alla membrana di SHOC2S2G

è mediato dalle LRR N-terminali 26

La traslocazione nel nucleo di SHOC2WT

dipende dalle LRR N-terminali 28

Il ruolo dei motivi KEKE 28

I motivi KEKE sono necessari per l’associazione

di SHOC2S2G ai lipid rafts 31

DISCUSSIONE 33

BIBLIOGRAFIA 36

4

ABBREVIAZIONI

ALL, acute lymphoblastic leukemia

AML, acute myeloid leukemia

BCA, bicinchoninic acid

BSA, bovine serum albumin

CLSM, confocal laser scanning microscopy

DAPI, 4’,6-diamidino-2-phenylindole

EGF, epidermal growth factor

FBS, fetal bovine serum

GH, growth hormone

GPI, glycosylphosphatidylinositol

GTP, guanosine -5’- triphosphate

HRP, horseradish peroxidase

IGF-1, insulin-like growth factor 1

JMML, juvenile myelomonocytic leukemia

LRR, leucine-rich repeat

MAPK, mitogen-activated protein kinase

NF1, neurofibromatosis type 1

NLS, nuclear localization signal

NMT, N-myristoyltransferase

PBS, phosphate buffered saline

PFA, paraformaldehyde

PP1C, protein phosphatase 1 catalytic subunit

RAS, rat sarcoma

SC, Costello syndrome

5

SCFC, cardiofaciocutaneous syndrome

SDS-PAGE, sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis

SHP-2, Src homology-2 domain-containing phosphatase-2

SL, LEOPARD syndrome

SN, Noonan syndrome

SN/LAH, Noonan-like syndrome with loose anagen hair

6

INTRODUZIONE

LA SINDROME DI NOONAN

La sindrome di Noonan (SN, OMIM 163950) è una malattia dello sviluppo descritta

nel 1963 dalla cardiologa pediatra Jacqueline Noonan che notò, in pazienti giunti

alla sua osservazione per una cardiopatia congenita, la presenza di caratteristiche

facciali simili e di bassa statura (Noonan e Ehmke, 1963). Venne subito riscontrata

una somiglianza con la sindrome di Turner, dalla quale però la SN si differenzia in

quanto colpisce entrambi i sessi, gli individui affetti hanno un assetto cromosomico

normale e in alcune famiglie si osserva una trasmissione autosomica dominante.

L’incidenza della sindrome è compresa tra 1:1000 e 1:2500, anche se fenotipi “mild”

possono presentare una frequenza molto più elevata (1:100) (Mendez e Opitz, 1985).

Caratteristiche cliniche

Le manifestazioni cliniche della SN comprendono bassa statura armonica, facies

dismorfica, difetti cardiaci congeniti, anomalie scheletriche e disabilità intellettive di

grado variabile (Noonan, 1994; Allanson, 2007; van der Burgt, 2007). I principali

dismorfismi facciali sono: fronte alta, ipertelorismo, rima degli occhi rivolta verso il

basso, ptosi palpebrale, epicanto, naso con radice depressa, base larga e punta

bulbosa, orecchie a basso impianto e angolate posteriormente, collo corto con

eccesso di cute sulla nuca e attaccatura bassa dei capelli. Con la crescita, il volto

assume sempre più la forma di un triangolo rovesciato (fronte ampia e mento

appuntito), il collo si allunga e la ridondanza di cute si distende a formare uno

pterigio (Fig. 1). In circa il 50-80% dei casi è presente una cardiopatia congenita, la

più frequente delle quali è la stenosi della valvola polmonare, seguita da un difetto

del setto atrioventricolare, mentre il 20-30% dei pazienti affetti da SN sviluppa una

cardiomiopatia ipertrofica (Burch et al., 1993; Marino et al., 1999). Le anomalie

dell’apparato scheletrico, prevalentemente a carico della colonna vertebrale e del

torace, includono la scoliosi, la fusione delle vertebre cervicali e il petto carenato. Gli

7

arti superiori possono presentare cubito valgo, sinostosi radio-ulnare e

brachidattilia. La coagulazione del sangue può risultare alterata a causa di

trombocitopenia, anomala funzionalità piastrinica e carenza singola o combinata dei

fattori VIII, XI e XII (Sharland et al., 1992; Massarano et al., 1996; Singer et al.,

1997). Alcuni tipi di leucemia, come la leucemia mielomonocitica giovanile (JMML)

e la leucemia linfoblastica acuta (ALL), possono manifestarsi in una piccola ma

ancora imprecisata frazione di pazienti con SN. La JMML può regredire

spontaneamente oppure evolvere in leucemia mieloide acuta (AML) (Bader-Meunier

et al., 1997; Fukuda et al., 1997; Choong et al., 1999; Roti et al., 2006). Altri difetti

ricorrenti sono lo strabismo e/o gli errori di rifrazione, la perdita dell’udito, il

criptorchidismo e alterazioni cutanee consistenti in cheratosi follicolare, macchie

caffè-latte e nevi.

Figura 1 - Giovane maschio con sindrome di Noonan, osservato all’età di 3 mesi (A), 2 anni

(B), 6 anni (C) e 17 anni (D) (foto J. Allanson).

8

Aspetti genetici

La SN può essere trasmessa come carattere autosomico dominante (forma familiare)

oppure può essere causata da mutazioni de novo (forma sporadica). Nel 50% dei casi,

la malattia è dovuta a mutazioni nel gene PTPN11 (Tartaglia et al., 2001), che

codifica per la proteina fosfotirosina fosfatasi SHP-2. In una piccola percentuale di

pazienti sono state identificate mutazioni nei geni SOS1 (Roberts et al., 2007;

Tartaglia et al., 2007), RAF1 (Pandit et al., 2007; Razzaque et al., 2007), KRAS (Carta

et al., 2006; Schubbert et al., 2006), BRAF (Sarkozy et al., 2009), NRAS (Cirstea et al.,

2010) e MEK1 (Nava et al., 2007). Recentemente si è scoperto che anche il gene

RIT1 è coinvolto nella SN (Aoki et al., 2013). Le mutazioni individuate nei diversi

geni-malattia sono in genere missenso e rendono conto del 75% circa dei casi clinici

(Fig. 2). Difetti molecolari nei geni SHOC2 e CBL causano patologie ricollegabili

alla SN, rispettivamente la sindrome di Noonan con “loose anagen hair” o sindrome di

Mazzanti (SN/LAH, OMIM 607721) (Mazzanti et al., 2003; Cordeddu et al., 2009) e

la sindrome “associata a mutazioni in CBL” (Martinelli et al., 2010; Niemeyer et al.,

2010; Perez et al., 2010).

Figura 2 - Geni-malattia noti responsabili della sindrome di Noonan e relativa prevalenza.

PTPN11 50%

?

SOS1 10%

RAF1 5%

5%

KRAS BRAF NRAS MEK1

RIT1 5%

9

Studi di correlazione genotipo-fenotipo hanno dimostrato che:

- mutazioni in PTPN11 sono più frequenti nei pazienti con stenosi della valvola

polmonare (Tartaglia et al., 2002);

- specifiche mutazioni in PTPN11 predispongono allo sviluppo di JMML

(Tartaglia et al., 2003; Kratz et al., 2005);

- mutazioni in RAF1 sono correlate con la cardiomiopatia ipertrofica (Pandit et

al., 2007);

- pazienti con mutazioni in SOS1 presentano una statura media più elevata e

sintomi cutanei significativi (Tartaglia et al., 2007; Zenker et al., 2007);

- mutazioni in KRAS sono associate a craniosinostosi, ritardo mentale e quadro

clinico complessivo generalmente più grave (Kratz et al., 2009).

I geni coinvolti nella SN codificano per proteine che partecipano alla via di

trasduzione del segnale RAS-MAPK implicata in numerosi processi cellulari come la

proliferazione, il differenziamento e il controllo dell’espressione genica (Schubbert et

al., 2007; Shi et al., 2013). La disregolazione di questa via è alla base della patogenesi.

Diagnosi

La diagnosi di SN si basa principalmente sull’osservazione delle caratteristiche

fenotipiche del paziente (Tabella 1) e diversi sistemi di punteggio (Scoring Systems)

sono stati sviluppati per aiutare il medico nella valutazione clinica (Duncan et al.,

1981; van der Burgt et al., 1994). Il sospetto diagnostico di SN può essere

confermato dall’analisi molecolare. Lo studio mutazionale può essere condotto

mediante lo screening consecutivo dei diversi geni oppure attraverso l’utilizzo di un

pannello multigenico. La mancata identificazione di una mutazione non consente

però di escludere la diagnosi, in quanto la causa genetica della malattia rimane

ancora sconosciuta nel 25% circa dei pazienti. La SN va posta in diagnosi

differenziale con la sindrome di Turner (analisi del cariotipo) e con le altre patologie

appartenenti alla famiglia delle RASopatie: la sindrome LEOPARD (SL, OMIM

151100), la sindrome cardiofaciocutanea (SCFC, OMIM 115150), la sindrome di

Costello (SC, OMIM 218040), la neurofibromatosi di tipo I (NF1, OMIM 162200) e

10

la sindrome di Legius (OMIM 611431). Queste malattie dello sviluppo, pur

mostrando un quadro clinico parzialmente sovrapponibile a quello della SN, sono

ben distinte dal punto di vista molecolare. Durante il periodo prenatale, alcuni segni

ecografici come l’igroma cistico, l’idrope fetale e il polidramnios, possono orientare

verso la SN (Zarabi et al., 1983; Benacerraf et al., 1989; Achiron et al., 2000). Nel caso

in cui la mutazione responsabile della patologia sia stata già identificata in un

membro della famiglia, si possono eseguire test genetici su villi coriali o liquido

amniotico.

11

Terapia

Il trattamento della SN richiede un approccio multidisciplinare. La cardiopatia, a

seconda del tipo e della gravità, può essere trattata con terapia farmacologica o

chirurgica. L’ormone della crescita (GH) può essere somministrato a pazienti che ne

sono deficitari o che presentano un difetto dell’asse GH/IGF-1. Il criptorchidismo

non responsivo alla terapia medica e alcune forme gravi di anomalie scheletriche,

strabismo e ptosi palpebrale possono richiedere un intervento chirurgico. Il

trattamento delle patologie della coagulazione viene personalizzato in base allo

specifico difetto diagnosticato e alla sintomatologia. La terapia di stimolazione

cognitiva e la logoterapia sono indicate in caso di ritardo mentale e difficoltà di

linguaggio. La consulenza genetica è utile sia per i pazienti che per le loro famiglie.

12

LA SINDROME DI NOONAN CON “LOOSE ANAGEN HAIR” O

SINDROME DI MAZZANTI

I soggetti con SN/LAH o sindrome di Mazzanti mostrano un fenotipo clinico

distintivo all’interno dello spettro delle RASopatie (Fig. 3), caratterizzato da bassa

statura spesso associata a carenza di GH, deficit cognitivi, iperattività e capelli molto

sottili in fase anagen che tendono alla caduta. Nella maggior parte dei casi si osserva

una pigmentazione scura della pelle con eczema o ittiosi. Altre anomalie

ectodermiche includono sopracciglia rade e unghie distrofiche. La voce è tipicamente

ipernasale o rauca. Le cardiopatie più frequenti sono la displasia della valvola mitrale

e i difetti del setto interatriale o interventricolare.

Figura 3 – Caratteristiche fenotipiche di soggetti affetti da sindrome di Mazzanti (Cordeddu et

al., 2009).

La sindrome di Mazzanti sembra essere una patologia geneticamente omogenea.

Infatti, tutti i pazienti analizzati finora recano lo stesso cambiamento nucleotidico

c.4A>G nel gene SHOC2. Tale mutazione determina la sostituzione di una serina

con una glicina in posizione 2 (p.Ser2Gly).

13

LA PROTEINA SHOC2

SHOC2 è una proteina di 582 aa, costituita da una regione N-terminale ricca in

residui di lisina e acido glutammico (o aspartico) disposti in modo alternato a

formare i motivi KEKE e da 19 ripetizioni di sequenze aminoacidiche ricche in

leucina (dominio LRR), generalmente coinvolte nelle interazioni proteina-proteina

(Fig. 4).

Figura 4 – Struttura schematica della proteina SHOC2. I numeri indicano gli aminoacidi che

delimitano la regione dei motivi KEKE e quella del dominio LRR.

Secondo dati noti in letteratura, SHOC2 è un modulatore positivo della via di

trasduzione del segnale RAS-MAPK e funziona come proteina regolatoria della

subunità catalitica della proteina fosfatasi 1 (PP1C). In seguito all’attivazione di un

recettore transmembrana per fattori di crescita, la proteina SHOC2 lega MRAS-

GTP favorendo la traslocazione in membrana di PP1C. Questa fosfatasi agisce su

RAF1 defosforilando il residuo di serina in posizione 259. RAF1 lega RAS-GTP,

viene attivata e dà inizio alla cascata delle MAP chinasi (Fig. 5) (Rodriguez-Viciana

et al., 2006).

Analizzando in silico la sequenza aminoacidica N-terminale della proteina SHOC2, si

è osservato che la sostituzione Ser2Gly determina la creazione di un sito di

miristilazione. Questa è una forma irreversibile di modificazione proteica che

consiste nel legame dell’acido miristico a un residuo di glicina localizzato

all’estremità N-terminale di un nascente polipeptide. La N-miristilazione è una

modifica co-traduzionale che avviene ad opera dell’N-miristoiltransferasi (NMT) in

14

seguito alla rimozione della metionina iniziale da parte della metionina

aminopeptidasi (Boutin, 1997; Farazi et al., 2001; Resh, 2006).

Figura 5 – Rappresentazione schematica di SHOC2 e dei suoi interattori secondo il modello

proposto da Rodriguez-Viciana et al. (2006).

Esperimenti di incorporazione di acido miristico [3H] hanno confermato la

miristilazione della proteina mutata SHOC2S2G che presenta una localizzazione

cellulare differente da quella di SHOC2 wild type (SHOC2WT). La proteina SHOC2WT

è distribuita nel citoplasma e nel nucleo in cellule starvate ed è localizzata

prevalentemente nel nucleo in cellule starvate e poi stimolate con EGF (Fig. 6A).

Invece, la proteina miristilata SHOC2S2G è costitutivamente localizzata in membrana

plasmatica (Fig. 6B) e ciò comporta un’aumentata attivazione delle MAPK in un

contesto cellulare specifico (Cordeddu et al., 2009). Infatti, nelle cellule di

neuroblastoma (Neuro2A) che esprimono la proteina SHOC2S2G, è stato osservato

un aumento, EGF dipendente, della defosforilazione del residuo di serina in

posizione 259 di RAF1 e un conseguente aumento dell’attivazione di ERK (Fig. 6C).

15

Figura 6 – (A) Localizzazione cellulare della proteina SHOC2WT transientemente espressa in

cellule COS-1. In condizione di deprivazione di siero (a sinistra), SHOC2WT è distribuita nel

citoplasma e nel nucleo mentre, dopo stimolazione con EGF (a destra), la proteina è più

concentrata nel nucleo. (B) Localizzazione cellulare della proteina SHOC2S2G transientemente

espressa in cellule COS-1. SHOC2S2G è localizzata in membrana plasmatica sia in cellule

starvate (a sinistra) che in cellule starvate e poi stimolate con EGF (a destra). Scala: 20 m.

(C) Defosforilazione della Ser259 di RAF1 e attivazione di ERK in cellule Neuro2A co-

trasfettate con costrutti codificanti per RAF1, ERK1 e SHOC2WT o SHOC2S2G, coltivate in

terreno privo di siero per 16h e indotte con EGF per 5, 15 e 30 minuti. Cellule esprimenti

RAF1S259A, una forma mutata della proteina RAF1 con maggiore attività enzimatica (Michaud

et al., 1995), sono state utilizzate come controllo.

16

FINALITÀ DELLA RICERCA

La sostituzione aminoacidica Ser2Gly promuove la N-miristilazione di SHOC2. La

proteina miristilata, al contrario di quella wild type, non è più in grado di traslocare

nel nucleo in seguito a stimolazione con EGF (perdita di funzione) e risulta invece

localizzata costitutivamente in membrana plasmatica (guadagno di funzione).

È noto che l’energia di legame fornita dalla N-miristilazione è relativamente debole

e non sufficiente ad ancorare una proteina alla membrana (Peitzsch e McLaughlin,

1993). Affinché ciò avvenga è necessario che ci sia un secondo segnale costituito da

una sequenza di aminoacidi basici (come nel caso della proteina c-Src), da uno o due

siti di palmitolazione (come nel caso delle proteine Lyn e Fyn) oppure, in

alternativa, la proteina miristilata può essere stabilizzata in membrana da interazioni

con altre proteine. Il secondo segnale sembra essere necessario anche per il targeting

della proteina ad uno specifico tipo di membrana cellulare (Resh, 1999).

Il primo obiettivo di questa tesi è stato quello di comprendere quali fossero i

meccanismi alla base della traslocazione di SHOC2WT nel nucleo e di SHOC2S2G alla

membrana plasmatica. A tal fine ho creato diverse forme mutanti delle due proteine

(mutazioni puntiformi o delezioni) e ne ho analizzato la localizzazione cellulare

tramite microscopia a fluorescenza confocale.

In passato è stato dimostrato che molte proteine leganti catene aciliche sature sono

associate ai lipid rafts (Shenoy-Scaria et al., 1994). Questi sono microdomini

specializzati della membrana plasmatica ricchi di sfingomielina, colesterolo e

gangliosidi, insolubili nei detergenti e presenti in frazioni a bassa densità di un

gradiente di saccarosio. I lipid rafts sono risultati essere coinvolti in numerosi

processi cellulari come l’esocitosi, l’endocitosi e la trasduzione del segnale (Simons e

Toomre, 2000).

Il secondo obiettivo di questa tesi è stato quello di verificare la presenza di una

eventuale associazione di SHOC2S2G miristilata ai lipid rafts. Per tale analisi ho preso

in considerazione anche la proteina SHOC2WT e alcune forme mutanti di SHOC2S2G.

17

MATERIALI E METODI

Analisi in silico

La sequenza aminoacidica di SHOC2 è stata analizzata in silico ed è stato osservato

che la proteina possiede (Fig. 7):

- una regione N-terminale ricca in residui di lisina (evidenziata in giallo);

(http://www.expasv.ch/tools/scanprosite/)

- una predetta sequenza di localizzazione nucleare (NLS) (evidenziata in fucsia);

(http://psort.ims.u-tokio.ac.jp/form2.html)

- un predetto sito di palmitolazione (Cys144) (evidenziato in verde);

(http://csspalm.biocuckoo.org/online.php)

- 19 ripetizioni ricche in leucina (LRR) (18 LRR predette da Pfam, scritte in

blu; 1 LRR predetta da SMART ma non da Pfam, scritta in rosso; LRR

predette con elevata confidenza, evidenziate in celeste).

(http://pfam.sanger.ac.uk/) (http://smart.embl-heidelberg.de/)

Figura 7 – Sequenza aminoacidica e domini funzionali della proteina SHOC2.

Preparazione dei costrutti

Il costrutto codificante la proteina SHOC2WT con tre sostituzioni aminoacidiche

(p.Pro79Ala, p.Arg82Gly, p.Lys83Gly) nella predetta NLS (PGTRKKS, residui 79-

85) (SHOC2NLS) e il costrutto codificante SHOC2S2G con il predetto sito di

palmitolazione mutato (p.Cys144Gly) (SHOC2S2G/C144G) sono stati creati mediante

mutagenesi sito-specifica (QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene).

MSSSLGKEKDSKEKDPKVPSAKEREKEAKASGGFGKESKEKEPKTKGKDAKDGKKDSSAAQP

GVAFSVDNTIKRPNPAPGTRKKSSNAEVIKELNKCREENSMRLDLSKRSIHILPSSIKELTQ

LTELYLYSNKLQSLPAEVGCLVNLMTLALSENSLTSLPDSLDNLKKLRMLDLRHNKLREIPS

VVYRLDSLTTLYLRFNRITTVEKDIKNLSKLSMLSIRENKIKQLPAEIGELCNLITLDVAHN

QLEHLPKEIGNCTQITNLDLQHNELLDLPDTIGNLSSLSRLGLRYNRLSAIPRSLAKCSALE

ELNLENNNISTLPESLLSSLVKLNSLTLARNCFQLYPVGGPSQFSTIYSLNMEHNRINKIPF

GIFSRAKVLSKLNMKDNQLTSLPLDFGTWTSMVELNLATNQLTKIPEDVSGLVSLEVLILSN

NLLKKLPHGLGNLRKLRELDLEENKLESLPNEIAYLKDLQKLVLTNNQLTTLPRGIGHLTNL

THLGLGENLLTHLPEEIGTLENLEELYLNDNPNLHSLPFELALCSKLSIMSIENCPLSHLPP

QIVAGGPSFIIQFLKMQGPYRAMV

18

Nel primo caso sono stati utilizzati il vettore di espressione pcDNA6/V5-SHOC2WT

come stampo e la coppia di primer:

5’-GCCAAACCCAGCAGCTGGGACTGGAGGAAAATCCAGCAATGC-3’ (Forward)

5’-GCATTGCTGGATTTTCCTCCAGTCCCAGCTGCTGGGTTTGGC-3’ (Reverse)

Nel secondo caso sono stati usati il vettore di espressione pcDNA6/V5-SHOC2S2G

come stampo e la coppia di primer:

5’-CCCAGCAGAGGTGGGAGGTTTAGTAAATCTC-3’ (Forward)

5’-GAGATTTACTAAACCTCCCACCTCTGCTGGG-3’ (Reverse)

I costrutti SHOC29-54 e SHOC2S2G/9-54, codificanti le proteine SHOC2WT e

SHOC2S2G prive dei motivi KEKE, sono stati ottenuti tramite PCR e clonaggio del

prodotto di amplificazione nel vettore di espressione eucariotico pcDNA6/V5-HisA

(Invitrogen). Le coppie di primer utilizzate sono riportate nella seguente tabella.

Costrutto Primer Sequenza 5’3’

SHOC29-54 SHOC29-54_NheI_Fw

GCTAGCACCATGAGTAGTAGTTTAGGAAAAGAAAAGGACTCCAGTGCTGCCCAAC

SHOC2_XhoI_Rv CTCGAGGACCATGGCACGATATGGACC

SHOC2S2G/9-54 SHOC2S2G/9-54_NheI_Fw GCTAGCACCATGGGTAGTAGTTTAGGA

AAAGAAAAGGACTCCAGTGCTGCCCAAC

SHOC2_XhoI_Rv CTCGAGGACCATGGCACGATATGGACC

I costrutti codificanti le proteine SHOC2WT con delezioni parziali del dominio LRR

sono stati ottenuti tramite “overlap extension PCR” (Fig. 8). Per ciascun costrutto,

due prodotti di PCR, rappresentanti le regioni che fiancheggiano la sequenza di

DNA da excidere, sono stati preparati utilizzando un primer non chimerico (in Fig.

8, a e d) e un primer chimerico (in Fig. 8, b e c). Quest’ultimo ha una sequenza

nucleotidica che deriva in parte dalla regione fiancheggiante a monte della delezione

e in parte dalla regione fiancheggiante a valle della delezione. Nel passaggio

successivo, i due prodotti di PCR sono stati usati come templato per una PCR di

ligazione che contiene la coppia di primer più esterna (in Fig. 8, a e d).

19

Figura 8 – Rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per la “overlap extension

PCR” (modificata da Lee et al., 2004).

L’amplificato è stato infine clonato nel vettore di espressione pcDNA6/V5-HisA. I

costrutti prodotti e i primers utilizzati sono riportati nella seguente tabella.

Costrutto Primer Sequenza 5’3’

SHOC2LRR1-4

SHOC2_NheI_Fw GCTAGCGAGTTCATGTAGTTTTTGTCCAG

SHOC2LRR1-4_Rv CTGAGTTTTGACAACTCTTTGATTG

SHOC2LRR1-4_Fw CAATCAAAGAGTTGTCAAAACTCAG

SHOC2_XhoI_Rv CTCGAGGACCATGGCACGATATGGACC

SHOC2LRR5-9

SHOC2_NheI_Fw GCTAGCGAGTTCATGTAGTTTTTGTCCAG

SHOC2LRR5-9_Rv CTATTCAGTTTCAAGTTTTTGATG

SHOC2LRR5-9_Fw CATCAAAAACTTGAAACTGAATAG

SHOC2_XhoI_Rv CTCGAGGACCATGGCACGATATGGACC

SHOC2LRR10-13

SHOC2_NheI_Fw GCTAGCGAGTTCATGTAGTTTTTGTCCAG

SHOC2LRR10-13_Rv CTCAAGAGAAACCACAAGACTTG

SHOC2LRR10-13_Fw CAAGTCTTGTGGTTTCTCTTGAGG

SHOC2_XhoI_Rv CTCGAGGACCATGGCACGATATGGACC

SHOC2LRR14-18

SHOC2_NheI_Fw GCTAGCGAGTTCATGTAGTTTTTGTCCAG

SHOC2LRR14-18_Rv GATTGAAAGCTTGAGACCAGAC

SHOC2LRR14-18_Fw GTCTGGTCTCAAGCTTTCAATC

SHOC2_XhoI_Rv CTCGAGGACCATGGCACGATATGGACC

20

I costrutti codificanti le proteine SHOC2S2G con le delezioni parziali del dominio

LRR sono stati creati mediante mutagenesi sito-specifica utilizzando il vettore

pcDNA6/V5-SHOC2LRR1-4, pcDNA6/V5-SHOC2LRR5-9, pcDNA6/V5-

SHOC2LRR10-13 o pcDNA6/V5-SHOC2LRR14-18 come stampo e la coppia di primer:

5’-CCAGGCTTGAGTCACCATGGGTAGTAGTTTAGGAAAAG-3’ (Forward)

5’-CTTTTCCTAAACTACTACCCATGGTGACTCAAGCCTGG-3’ (Reverse)

L’introduzione delle mutazioni puntiformi e la creazione delle specifiche delezioni

sono state verificate tramite sequenziamento bidirezionale (ABI BigDye terminator

Sequencing Kit v.3.1 e sequenziatore ABI Prism 3500 Genetic Analyzer, Applied

Biosystems).

Colture cellulari e trasfezione

Per questa ricerca sono state utilizzate cellule COS-1 (American Type Culture

Collection, Manassas, VA, USA) coltivate in terreno DMEM (Dulbecco’s modified

Eagle’s medium, Euroclone, Wetherby, West York, U.K.) supplementato con siero

fetale bovino (FBS) al 10%, L-glutammina 2 mM, 100 unità/ml di penicillina e 100

g/ml di streptomicina (incubazione a 37°C, 5% di CO2, 95% di umidità).

Una volta giunte al 60-70% circa di confluenza, le cellule sono state trasfettate

transientemente con il reagente Fugene6 (Roche) seguendo il protocollo fornito dal

produttore.

Il terreno DMEM complementato solo con gli antibiotici e il fattore di crescita

dell’epidermide (EGF) (Invitrogen) alla concentrazione finale di 30 ng/ml sono stati

usati rispettivamente per starvare e stimolare le cellule.

Omogenati cellulari e dosaggio proteico

Le cellule, trasfettate con i diversi costrutti per 24h, sono state lavate per due volte

con il PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) e raccolte mediante l’uso di uno

scraper direttamente nel buffer di lisi RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, NaCl 150

mM, NP-40 1%, sodio deossicolato 0.5%, SDS 0.1%) addizionato di NaF 20 mM,

Na3VO4 1mM e antiproteasi (una pasticca di CompleteTM, Roche Diagnostic S.p.A.,

21

Applied Science, ogni 10 ml di buffer). I lisati sono stati tenuti in ghiaccio per 30

minuti e poi centrifugati a 16000 g per 20 minuti a 4°C. I supernatanti sono stati

prelevati e la loro concentrazione proteica è stata determinata con il metodo di

dosaggio dell’acido bicinconinico (BCA) (Smith et al., 1985) tramite una opportuna

curva di taratura, ottenuta utilizzando l’albumina di siero bovino (BSA) come

standard.

Preparazione di microdomini di membrana (lipid rafts)

I lipid rafts sono stati isolati secondo la procedura descritta da Parolini et al. (1996).

In breve, 1.5x106 cellule sono state seminate su piastre di 15 cm di diametro e

trasfettate con diversi costrutti per 24h. Poi sono state lavate con PBS e raccolte

mediante l’uso di uno scraper in 750 l di buffer di lisi MBS [2-(N-morpholino)

ethanesulfonic acid 25 mM, pH 6.5, NaCl 150 mM] addizionato di Triton X-100

1%, Na3VO4 1mM e inibitori delle proteasi. Ogni lisato cellulare è stato

omogeneizzato con un pestello di vetro “tight”, unito a una soluzione di saccarosio

all’80% (750 l) e trasferito sul fondo di un tubo da ultracentrifuga. Un gradiente di

saccarosio dal 30% al 5% è stato formato sull’omogenato e il campione è stato

centrifugato a 47000 rpm per circa 18h a 4°C in un rotore SW55Ti (Beckman

Instruments, Palo Alto, CA, USA). Conclusa l’ultracentrifugazione, 12 frazioni da

375 l sono state prelevate a partire dall’alto del gradiente e conservate a 80°C in

attesa di essere analizzate.

Elettroforesi e Western Blot

Un’aliquota (37 l) di ciascuna frazione del gradiente di saccarosio e 30 g di ogni

omogenato cellulare sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide

(7.5%) in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) e riducenti (-mercaptoetanolo nel

buffer di preparazione dei campioni). Questo sistema utilizza un tampone Tris base

[tris(idrossimetil)amminometano] 25 mM, glicina 200 mM, SDS 0.1%, pH 7.2. La

corsa elettroforetica è stata effettuata a 180 V per 45 minuti a temperatura ambiente

22

e al suo termine le proteine sono state trasferite su membrana di nitrocellulosa

usando lo strumento Trans-Blot® TurboTM della Bio-Rad (2.5 A per 10 minuti).

La membrana è stata saturata con una soluzione di T-PBS (Na2HPO4 80 mM,

NaH2PO4 25 mM, NaCl 100mM, Tween-20 0.1%) contenente il 5% di latte in

polvere (Bio-Rad), incubata con l’anticorpo primario per 1h a temperatura ambiente,

lavata per 4 volte con T-PBS (1 lavaggio da 15 minuti e 3 da 5 minuti) e infine

incubata con l’anticorpo secondario per 1h a temperatura ambiente. Dopo 4 lavaggi

con T-PBS, la membrana è stata colorata utilizzando un kit per chemiluminescenza

(Super Signal West Pico o Femto, Pierce, Biotechnology Inc., Rockford, USA) e

osservata al Fluorchem (Cell Biosciences, Santa Clara, CA, USA) per la

visualizzazione delle bande immunoreattive.

Gli anticorpi primari e secondari utilizzati e le relative diluizioni sono: anti-V5

monoclonale 1:5000 (Invitrogen), anti--Actina monoclonale 1:5000 (Sigma-

Aldrich), anti-Flotillina1 monoclonale 1:1000 (BD Transduction LaboratoriesTM) e

anti-mouse IgG coniugato alla perossidasi di rafano (HRP) 1:3000 (Sigma-Aldrich).

Microscopia confocale a scansione laser (CLSM)

Le cellule, seminate su vetrini coprioggetto (3x103/vetrino), sono state trasfettate

con i diversi costrutti per 24h, starvate per 16h e stimolate con EGF per 15 minuti.

Poi sono state lavate con PBS e fissate con paraformaldeide (PFA) al 3% per 30

minuti a 4°C. Dopo alcuni lavaggi con il PBS, le cellule sono state permeabilizzate

con Triton X-100 (0.5% in PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente.

Al fine di analizzare la localizzazione cellulare delle proteine SHOC2, le cellule sono

state incubate con l’anticorpo primario monoclonale anti-V5 (diluito 1:50 in PBS con

BSA 0.5% e saponina 0.1%) per 1h a temperatura ambiente, lavate due volte con PBS

e incubate con l’anticorpo secondario anti-mouse coniugato al fluoroforo Alexa 594

(Molecular Probes, diluito 1:50 in PBS con BSA 0.5% e saponina 0.1%, colore rosso)

per 1h a temperatura ambiente. Le stesse cellule, lavate con PBS, sono state incubate

con la falloidina coniugata al fluoroforo Alexa 488 (Molecular Probes, diluito 1:100

23

in PBS con BSA 0.5% e saponina 0.1%, colore verde) per 30 minuti a temperatura

ambiente.

I vetrini sono stati montati con il reagente Vectashield antifade contenente il

colorante DAPI per l’identificazione dei nuclei (Vector Laboratories, Burlingame,

CA, USA) e osservati al microscopio confocale a scansione laser Leica TCS SP2

AOBS, usando linee spettrali di eccitazione a 405, 488 e 495 nm, regolate con un

filtro “acousto-optical tunable”. L’acquisizione e l’elaborazione delle immagini sono

state eseguite utilizzando i programmi Leica Confocal Software 2.3 (Leika

Lasertechnik, Heidelberg, Germany) e Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems

Incorporated, San Jose, CA, USA). I segnali di emissione, provenienti dalle diverse

sonde fluorescenti, sono stati acquisiti in modalità sequenziale.

24

RISULTATI

Espressione delle proteine SHOC2 mutate

L’espressione ectopica di ciascuna forma mutata di SHOC2 è stata verificata tramite

analisi SDS-PAGE e Western Blot (Fig. 9). Tutte le proteine, ad eccezione di quelle

recanti la delezione delle LRR 5-9 e 14-18, sono risultate essere ben espresse.

Figura 9 – Espressione ectopica di SHOC2WT, SHOC2S2G e delle relative forme mutate

(mutanti SHOC2WT, a sinistra e mutanti SHOC2S2G, a destra). In ogni linea dei due gel è stata

caricata una identica quantità di lisato cellulare totale (30 g). Come controllo del contenuto

proteico è stata utilizzata la -Actina. I numeri 45, 50 e 80 kDa si riferiscono ai pesi

molecolare degli standard. La quantità relativa di ciascuna proteina SHOC2 è stata valutata

tramite analisi densitometrica delle bande ed è stata normalizzata come rapporto SHOC2/-

Actina.

25

La traslocazione nel nucleo di SHOC2WT non è mediata dalla NLS

Si è presa in considerazione la possibilità che la predetta NLS (PGTRKKS, residui

79-85) di SHOC2 potesse essere coinvolta nella traslocazione della proteina nel

nucleo. A tal fine, ho creato il mutante SHOC2NLS che possiede una sequenza

consenso modificata per la sostituzione di tre residui aminoacidici (P79A, R82G e

K83G) e ho osservato come questa proteina si distribuiva all’interno della cellula

(Fig. 10). La sua localizzazione cellulare è risultata identica a quella di SHOC2WT.

Infatti, in condizione di deprivazione di siero, SHOC2NLS è distribuita nel citoplasma

e nel nucleo mentre, dopo induzione con EGF, la proteina è più concentrata nel

nucleo. Ciò indica che la NLS non è una reale NLS o che la traslocazione di SHOC2

nel nucleo è mediata da altre specifiche regioni della proteina.

Figura 10 – Rappresentazione schematica della proteina SHOC2NLS e sua localizzazione

cellulare (in condizione di deprivazione di siero, a sinistra e dopo stimolazione con EGF, a

destra). I triangolini neri indicano le posizioni delle sostituzioni aminoacidiche. Scala: 10 m.

La stabilizzazione in membrana di SHOC2S2G non dipende dalla palmitolazione

Un sito putativo di palmitolazione, costituito dalla cisteina in posizione 144, è stato

individuato nella sequenza aminoacidica di SHOC2 tramite analisi in silico. Al fine di

verificare l’esistenza di una correlazione tra stabilizzazione in membrana di

SHOC2S2G e palmitolazione, ho sostituito il residuo di cisteina con uno di glicina e

26

ho analizzato la localizzazione cellulare della risultante proteina SHOC2S2G/C144G.

Come si evince dalle immagini di microscopia a fluorescenza confocale, il doppio

mutante è costitutivamente localizzato in membrana plasmatica (Fig. 11). Tale

risultato può essere spiegato dalla non effettiva palmitolazione del residuo di cisteina

144 o dall’assenza di un coinvolgimento di questa modificazione proteica nella

stabilizzazione in membrana di SHOC2S2G.

Figura 11 – Rappresentazione schematica della proteina SHOC2S2G/C144G e sua localizzazione

cellulare (in condizione di deprivazione di siero, a sinistra e dopo stimolazione con EGF, a

destra). Il triangolo nero indica la posizione della sostituzione aminoacidica e la linea a “zig-

zag” raffigura la N-miristilazione. Scala: 20 m.

Il targeting alla membrana di SHOC2S2G è mediato dalle LRR N-terminali

Per comprendere il meccanismo alla base del targeting alla membrana plasmatica di

SHOC2S2G, ho creato quattro mutanti della proteina miristilata con delezioni parziali

del dominio LRR e ne ho analizzato la localizzazione cellulare (Fig. 12). Le proteine

SHOC2S2G/LRR1-4 e SHOC2S2G/LRR5-9 hanno mostrato una distribuzione

citoplasmatica costitutiva, indicando che le LRR N-terminali sono necessarie per la

traslocazione in membrana di SHOC2S2G. Al contrario, le proteine SHOC2S2G/LRR10-

13 e SHOC2S2G/LRR14-18 hanno presentato una localizzazione costitutiva in membrana

27

plasmatica, dimostrando che le LRR C-terminali non sono essenziali per la

traslocazione in membrana di SHOC2S2G.

Figura 12 – Rappresentazione schematica delle proteine SHOC2S2G con delezioni parziali del

dominio LRR e loro localizzazione cellulare (le immagini mostrano la localizzazione delle

proteine mutate in cellule starvate; le stesse localizzazioni si osservano anche in cellule

stimolate con EGF). La linea punteggiata e quella a “zig-zag” raffigurano rispettivamente la

delezione e la N-miristilazione. Scala: 10 m (pannelli in alto) o 20 m (pannelli in basso).

28

La traslocazione nel nucleo di SHOC2WT dipende dalle LRR N-terminali

Anche per SHOC2WT ho costruito i quattro mutanti con le delezioni parziali del

dominio LRR al fine di capire quali regioni della proteina fossero importanti per la

sua traslocazione nel nucleo (Fig. 13). Le proteine SHOC2LRR1-4 e SHOC2LRR5-9

hanno presentato una localizzazione citoplasmatica costitutiva, mentre le proteine

SHOC2LRR10-13 e SHOC2LRR14-18 hanno mostrato una distribuzione intracellulare

identica a quella di SHOC2WT sia in cellule starvate che in cellule starvate e poi

stimolate con EGF. Questi risultati indicano che le LRR localizzate all’estremità N-

terminale del dominio sono essenziali per il trasporto di SHOC2WT dal citoplasma al

nucleo, al contrario quelle localizzate all’estremità C-terminale non sono necessarie.

Il ruolo dei motivi KEKE

Per studiare il ruolo dei motivi KEKE, ho costruito due mutanti con una loro

delezione, uno per SHOC2WT e uno per SHOC2S2G. La proteina SHOC29-54 ha

mostrato una localizzazione nucleare costitutiva (Fig. 14A), dimostrando che la

regione dei KEKE è importante per il trasporto di SHOC2WT dal nucleo al

citoplasma. Invece, la proteina SHOC2S2G/9-54 è risultata essere costitutivamente

distribuita in tutta la cellula (membrana plasmatica, citoplasma e nucleo) (Fig. 14B).

La presenza di questa proteina nel citoplasma indica che è poco stabilizzata in

membrana e che quindi i motivi KEKE contribuiscono all’ancoraggio di SHOC2S2G

alla membrana plasmatica. La proteina osservata nel nucleo, invece, potrebbe essere

una porzione di SHOC2S2G/9-54 non efficientemente miristilata che si comporta come

SHOC29-54 localizzandosi nel compartimento nucleare.

29

Figura 13 – Rappresentazione schematica delle proteine SHOC2WT con delezioni parziali del

dominio LRR e loro localizzazione cellulare (pannelli in alto, le immagini mostrano la

localizzazione delle proteine mutate in cellule starvate; le stesse localizzazioni si osservano

anche in cellule stimolate con EGF; pannelli in basso, localizzazione delle proteine mutate in

cellule starvate, 0’ EGF e in cellule stimolate, 15’ EGF,). La linea punteggiata raffigura la

delezione. Scala: 10 m.

30

Figura 14 – (A) Rappresentazione schematica della proteina SHOC29-54 e sua localizzazione

cellulare (l’immagine mostra la localizzazione della proteina mutata in cellule starvate; la

stessa localizzazione si osserva anche in cellule stimolate con EGF). La linea punteggiata

raffigura la delezione. (B) Rappresentazione schematica della proteina SHOC2S2G/9-54 e sua

localizzazione cellulare (l’immagine mostra la localizzazione della proteina mutata in cellule

starvate; la stessa localizzazione si osserva anche in cellule stimolate con EGF). La linea

punteggiata e quella a “zig-zag” raffigurano rispettivamente la delezione e la N-miristilazione.

Scala: 20m.

31

I motivi KEKE sono necessari per l’associazione di SHOC2S2G ai lipid rafts

L’ultracentrifugazione in gradiente di saccarosio è uno dei metodi che viene

maggiormente utilizzato per lo studio dei lipid rafts, microdomini di membrana

insolubili nei detergenti che flottano nelle frazioni a bassa densità del gradiente.

Dopo averle separate, le frazioni possono essere analizzate tramite Western Blot per

verificare la presenza o meno di una specifica proteina di interesse. Il marcatore

proteico dei lipid rafts è la flotillina.

Esperimenti di questo tipo sono stati condotti per verificare l’esistenza di una

associazione tra SHOC2S2G e i lipid rafts. Come mostrato in Fig. 15, SHOC2S2G è

presente sia nelle frazioni insolubili 5-6 contenenti i lipid rafts che nelle frazioni

solubili 8-12 contenenti le proteine solubilizzate dal detergente e tutte le altre

proteine cellulari. SHOC2WT e il mutante SHOC2S2G/LRR1-4, non localizzati in

membrana, sono presenti solo nelle frazioni solubili del gradiente (10-12) mentre, il

mutante SHOC2S2G/LRR10-13, localizzato in membrana plasmatica come SHOC2S2G, è

presente sia nelle frazioni insolubili (5-6) che in quelle solubili (8-12).

Inaspettatamente, la proteina SHOC2S2G/9-54 priva dei motivi KEKE non si trova

nelle frazioni dei lipid rafts. Ciò può dipendere dalla sua ridotta stabilizzazione in

membrana o da uno specifico ruolo della regione dei KEKE nell’interazione con

proteine localizzate nei lipid rafts. Questa seconda ipotesi è stata confermata

dall’analisi del gradiente di una forma tronca della proteina SHOC2S2G,

SHOC2S2G/171-582 (non caratterizzata in questo studio), che pur essendo poco

stabilizzata in membrana è associata ai rafts.

32

Figura 15 – I lipid rafts, preparati utilizzando cellule COS-1 transientemente trasfettate con i

costrutti mostrati, sono stati separati su un gradiente di densità di saccarosio. Le 12 frazioni

ottenute da ciascun gradiente sono state sottoposte ad analisi immunoblot con gli anticorpi V5

(SHOC2) e Flotillina. Le frazioni 5 e 6 corrispondono alle frazioni insolubili nei detergenti (i

lipid rafts) mentre le frazioni 8-12 corrispondono a quelle solubili.

33

DISCUSSIONE

SHOC2 è una proteina ubiquitaria composta quasi interamente da ripetizioni ricche

in leucina (dominio LRR), con una sequenza N-terminale ricca in lisina (motivi

KEKE) (Fig. 4). Questa proteina agisce da modulatore positivo della via di

trasduzione del segnale RAS-MAPK favorendo l’interazione di RAF1 con RAS

(Rodriguez-Viciana et al., 2006).

La mutazione missenso c.4A>G (p.Ser2Gly) nel gene SHOC2 è responsabile di una

malattia dello sviluppo nota come SN/LAH o sindrome di Mazzanti. Esperimenti in

vitro hanno dimostrato che la sostituzione aminoacidica Ser2Gly promuove la N-

miristilazione della proteina e causa l’aberrante targeting di SHOC2 alla membrana

plasmatica (Fig. 6B) (Cordeddu et al., 2009).

La N-miristilazione non è sufficiente ad ancorare una proteina alla membrana.

Affinché ciò avvenga è necessario che ci sia un secondo segnale costituito da una

sequenza di aminoacidi basici oppure da uno o due siti di palmitolazione (Resh,

1999). La proteina SHOC2 non possiede una sequenza aminoacidica polibasica né

cisteine all’estremità N-terminale che consentano il legame dell’acido palmitico.

Nonostante la Cys144 fosse stata predetta essere un sito di palmitolazione, il suo

coinvolgimento nella stabilizzazione in membrana di SHOC2S2G è stato escluso dal

momento che il doppio mutante SHOC2S2G/C144G ha mostrato una localizzazione

costitutiva in membrana plasmatica (Fig. 11).

Alla luce di questi risultati, si è presa in considerazione la possibilità che la

traslocazione in membrana di SHOC2S2G potesse dipendere da interazioni proteina-

proteina. L’analisi della localizzazione cellulare dei mutanti SHOC2S2G con delezioni

parziali del dominio LRR ha dimostrato che le LRR N-terminali sono coinvolte nel

targeting di SHOC2S2G alla membrana plasmatica (Fig. 12). La delezione dei motivi

KEKE, invece, comporta una minore stabilizzazione in membrana della proteina

SHOC2S2G/9-54 indicando che la regione dei KEKE contribuisce all’ancoraggio in

membrana di SHOC2S2G (Fig. 14B).

34

In condizione di deprivazione di siero, la proteina SHOC2WT mostra una

distribuzione citoplasmatica e nucleare mentre, dopo stimolazione con EGF,

SHOC2WT è localizzata per lo più nel nucleo. Tale osservazione suggerisce un ruolo

inatteso per questa proteina nella trasduzione del segnale (controllo dell’espressione

genica) (Fig. 6A).

L’ipotesi che la traslocazione nel nucleo di SHOC2WT potesse dipendere dalla

predetta NLS è stata esclusa in quanto la proteina mutata SHOC2NLS presenta una

distribuzione identica a quella di SHOC2WT, sia in cellule starvate che in cellule

stimolate con EGF (Fig. 10).

Dall’analisi della localizzazione cellulare dei mutanti SHOC2WT con delezioni

parziali del dominio LRR si è dedotto che le LRR N-terminali sono implicate nella

traslocazione di SHOC2WT nel compartimento nucleare (Fig. 13). Invece, i motivi

KEKE sono risultati necessari per il trasporto di SHOC2WT dal nucleo al citoplasma

(Fig. 14A).

È ormai noto da diversi anni che nella membrana plasmatica esistono microdomini,

definiti lipid rafts, con una particolare composizione lipidica e proteica. Essi

contengono elevate concentrazioni di sfingomielina, colesterolo e gangliosidi. Le

proteine che generalmente sono associate ai rafts hanno lunghi domini

transmembrana, una o due catene aciliche sature oppure un’ancora di

glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Si ritiene che i rafts organizzino tali proteine per il

loro trasporto in piccole vescicole o per favorirne l’attivazione in maniera integrata,

come nel caso della trasduzione del segnale. La proteina HRAS, per esempio, utilizza

il ricircolo dei lipid rafts per ottenere l’amplificazione del segnale proliferativo (Roy

et al., 1999).

Esperimenti di ultracentrifugazione in gradiente di saccarosio hanno indicato che la

proteina SHOC2S2G miristilata è associata ai rafts e che tale localizzazione è mediata

dalla regione dei KEKE (Fig. 15). Resta da comprendere quale sia l’effetto di stimoli

extracellulari sull’associazione di SHOC2S2G ai lipid rafts e quale sia il ruolo di questi

microdomini nella modulazione dell’attivazione del pathway RAS–MAPK mediata da

SHOC2S2G.

35

In conclusione, i risultati della presente ricerca dimostrano che:

la localizzazione cellulare della proteina SHOC2 è mediata da interazioni

proteina-proteina;

le ripetizioni ricche in leucina N-terminali sono necessarie per il targeting di

SHOC2S2G alla membrana plasmatica e per la traslocazione nel nucleo di

SHOC2WT;

i motivi KEKE contribuiscono all’ancoraggio in membrana di SHOC2S2G,

mediano l’associazione di SHOC2S2G con i lipid rafts e sono necessari per il

trasporto di SHOC2WT dal nucleo al citoplasma.

Ulteriori studi saranno necessari per identificare gli interattori delle proteine

SHOC2WT e SHOC2S2G (esperimenti di co-immunoprecipitazione, spettrometria di

massa e sistema del doppio ibrido in lievito) e per analizzare come la diversa

localizzazione cellulare dei mutanti per delezione di SHOC2 influisce sulla via di

trasduzione del segnale RAS-MAPK (saggi di luciferasi).

36

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