DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di...
111
DIPARTIMENTO DI CHIMICA “G. CIAMICIAN” – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di massa Schema di uno spettrometro di massa Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Sistema di vuoto Rivelatore Segnale Computer Campione 10 -5 -10 -8 torr Campione Ioni Ioni
-
Upload
giada-bosco -
Category
Documents
-
view
219 -
download
2
Transcript of DIPARTIMENTO DI CHIMICA G. CIAMICIAN – CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE Schema di uno spettrometro di...
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Schema di uno spettrometro di massaSchema di uno spettrometro di massa
Sistema diintroduzione
Sorgentedi ioni
Analizzatoredi massa
Sistema di vuoto
Rivelatore
SegnaleComputer
Campione
10-5-10-8 torrCampione Ioni Ioni
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Schema di uno spettrometro di massaSchema di uno spettrometro di massa
Sistema diintroduzione
Sorgentedi ioni
Analizzatoredi massa
Sistema di vuoto
Rivelatore
SegnaleComputer
Campione
10-5-10-8 torrCampione Ioni Ioni
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgenti ionicheSorgenti ioniche
Stato del campione Sorgente
Gassoso Ionizzazione elettronica (EI)
Ionizzazione chimica (CI)
Liquido Elettrospray – nanospray
APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
APPI (atmospheric pressure photoionization)
Liquido/solido Sorgenti a deplezione/ionizzazione
(FAB, MALDI, SIMS)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Interfacciamento GC/MSInterfacciamento GC/MS
Queste sorgenti sono adatte all’interfacciamento con la gascromatografia, purché il flusso di fase mobile sia compatibile con la MS
GC con colonne impaccate: ~ 20 cm3 min-1
GC con colonne capillari: ~ 1 cm3 min-1 (accettabile per la MS)
Stato del campione Sorgente
Gassoso Ionizzazione elettronica (EI)
Ionizzazione chimica (CI)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Classificazione delle sorgenti ionicheClassificazione delle sorgenti ioniche
• Sorgenti “dure” (elevata frammentazione)– Ionizzazione elettronica
• Sorgenti “molli” (bassa frammentazione)– Ionizzazione chimica– Desorbimento (MALDI, elettrospray)– Fotoionizzazione
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgenti ionicheSorgenti ioniche
Stato del campione Sorgente
Liquido Elettrospray – nanospray
APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
APPI (atmospheric pressure photoionization)
LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1.
Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.)
Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1 0.1 cm3 min (c.n.)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sistemi di introduzione del campioneSistemi di introduzione del campione
• Sistemi a carica (off line)– Il campione viene volatilizzato termicamente ed inviato nella
zona di ionizzazione.
• Sistemi a sonda– Per solidi, liquidi non volatili e per campioni in piccole quantità
• Sistemi per iniezione diretta (o per FIA)– Per inviare campioni liquidi ad interfacce a flusso (es.
elettrospray)
• Sistemi separativi in fase liquida (LC, CE, FFF)– Interfaccia online con interfacce a flusso
Introduzione di campioni solidi o liquidiIntroduzione di campioni solidi o liquidi
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgenti ioniche a desorbimentoSorgenti ioniche a desorbimento
• Elettrospray – nanospray
• Bombardamento con atomi veloci (FAB)
• Desorbimento/ionizzazione per impatto ionico
• Desorbimento-ionizzazione laser assistiti da matrice (MALDI)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Meccanismo fisico dell’elettrosprayMeccanismo fisico dell’elettrospray
L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sistema di nebulizzazione elettrospraySistema di nebulizzazione elettrospray
Cono diTaylor
Punta dell’ago
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sistema di desolvatazione per elettrospraySistema di desolvatazione per elettrospray
Campione
Liquido ditrasporto
Gas ditrasporto
Cono di Taylor
Capillare riscaldato
Gas didesolvatazione
2-6 kV+ -
Gocce dicirca 1 µm
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Meccanismo di deplezione degli ioniMeccanismo di deplezione degli ioni
Soluzione del campione
4000 V
Pressione atmosferica
Calore o gassecco
Il calore e/o il gas secco causano lariduzione delle dimensioni delle gocce
Vapori del solvente
Spettrometro di massa Livelli successivi di vuoto(2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr)
Limite di Rayleigh:Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia.
Esplosione Coulombiana
q2 = 8π2ε0γd3
q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Ionizzazione elettrosprayIonizzazione elettrospray
Processo di Processo di “evaporazione degli ioni”“evaporazione degli ioni”
• Nebulizzazione del campione (Cono di Taylor)
• Evaporazione del solvente (desolvatazione)
• Deplezione degli ioni(esplosione coulombiana)
• Modelli di deplezione:desorbimento o evaporazione
del solvente
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Nanospray con geometria “a Z”Nanospray con geometria “a Z”
Accoppiamento nanoHPLC-MSAccoppiamento nanoHPLC-MS
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
L’elettrospray genera spettri multicaricaL’elettrospray genera spettri multicarica
m/z
La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma:
(M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Calcolo della massa da uno spettro multicaricaCalcolo della massa da uno spettro multicarica
2
22
1
11
0079,1
0079,1
z
zMA
z
zMA
r
r
Siano A1 e A2 i valori di m/z per due picchi dello spettro multicarica. Se supponiamo che gli addotti siano formati da H+ (Mr = 1,0079) si ha:
Se z1 = z2 + 1(picchi consecutivi)
1
)1(0079,1
0079,1
1
12
1
11
z
zMA
z
zMA
r
r
12
21
0079,1
AA
Az
Risolvendo il sistema si ha:
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)
LC-APCI/MSLC-APCI/MS
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Ionizzazione chimica a pressione atmosfericaIonizzazione chimica a pressione atmosferica
• Sorgente ionica analoga alla CI, in cui la ionizzazione avviene per reazioni ione-molecola a pressione atmosferica
• Gli ioni primari vengono generati a pressione atmosferica mediante scariche a corona nel solvente nebulizzato o mediante emissione β-.
• Si applica a molecole ioniche o polari, di massa molare fino a circa 1500.
• Può funzionare sia in modalità positiva che negativa genera prevalentemente ioni monocarica.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
ESI vs APCI - SensibilitàESI vs APCI - Sensibilità
Sen
sib
ilità
rela
tiva
Flusso (µL/min)
La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgente ionica a fotoionizzazioneSorgente ionica a fotoionizzazione
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgente ionica a fotoionizzazioneSorgente ionica a fotoionizzazione
• Sorgente ionica a pressione atmosferica (APPI) di recente introduzione
• Una lampada UV a Kr emette fotoni di energia ~ 10 eV.
• L’energia dei fotoni è tale da ionizzare selettivamente un’ampia classe di molecole organiche, senza ionizzare il solvente.
• È adatta a molecole piccole e poco polari, che sono difficilmente ionizzabili con altri metodi.
• È una sorgente estremamente soft, e rappresenta un’alternativa alla APCI e alla ESI per la ionizzazione a pressione atmosferica.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Applicabilità delle sorgenti a pressione atmosfericaApplicabilità delle sorgenti a pressione atmosferica
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgenti ioniche a desorbimentoSorgenti ioniche a desorbimento
• L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita.
• Caratteristiche della matrice:– Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del
laser.– Massa molare abbastanza bassa da sublimare
facilmente.– Bassa reattività chimica.– Stabilità al vuoto.
• Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici
Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Matrici per ionizzazione MALDIMatrici per ionizzazione MALDI
Matrice ApplicazioniAcido α-ciano-4-idrossicinnamico
Acido 3,5-dimetossi-4-idrossicinnammico (sinapinico)
Acido 2,5-diidrossibenzoico (gentisico)
Acido 3-idrossipicolinico
Triidrossiacetofenone
Acido 5-clorosalicilico
Peptidi, proteine, composti organici
Biopolimeri ad elevata massa molare
Peptidi, proteine, carboidrati
Oligonucleotidi
Oligonucleotidi, peptidi
Polimeri non idrosolubiliCN
CO 2 HCH C
HO
Acido α-ciano-4-idrossicinnamico
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Portacampione per MALDIPortacampione per MALDI
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Il processo MALDIIl processo MALDI
Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Preparazione del campione per MALDIPreparazione del campione per MALDI
Il metodo più comune per la preparazione di un campione per MALDI è la dried-droplet.
Una certa quantità di soluzione satura della matrice
(5-10 µL) viene miscelata ad un volume minore di campione (1-2 µL)
Una goccia (0.5 – 2 µL) della miscela ottenuta si deposita sulla piastrina portacampione del MALDI e si fa asciugare a T ambiente, in modo che cristallizzi completamente prima di essere introdotta nello spettrometro di massa.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sorgenti laser per MALDISorgenti laser per MALDI
• Laser a N2 (337 nm), Nd-YAG (266 e 355 nm) o IR (Er-YAG, 2.94 µm).
• Energia del laser: 106 – 1010 W cm-2
• Diametro dello spot laser: < 1 µm• Durata dell’impulso: ~10 - 100 ns• Misure ottenute sulla media di 50 –
100 colpi.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Il processo MALDIIl processo MALDI
La ionizzazione avviene per trasferimento di carica dagli ioni della matrice alle molecole del solvente, secondo un processo non del tutto noto che porta alla prevalente formazione di ioni monocarica non frammentati.
L’eventuale frammentazione può avvenire secondo tre meccanismi:
- frammentazione immediata: avviene durante il processo di desorbimento/ionizzazione
- frammentazione veloce: avviene dopo la ionizzazione ma prima dell’accelerazione degli ioni verso l’analizzatore di massa
-frammentazione per decadimento port-sorgente (PSD): avviene dopo l’accelerazione degli ioni (ad esempio nel tubo di volo). In questo caso i frammenti non possono essere risolti dallo ione molecolare.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS
Range di massa fino a 106 Analizzatore a tempo di volo.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Lo spettro di massaLo spettro di massa
Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS)Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS)
Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli
Inte
nsità
rel
ativ
a
m/z
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
MALDI: vantaggi e limitazioniMALDI: vantaggi e limitazioni
Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione.
Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare)
= Non è una sorgente a flusso
La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze.
L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Schema di uno spettrometro di massaSchema di uno spettrometro di massa
Sistema diintroduzione
Sorgentedi ioni
AnalizzatoreAnalizzatoredi massadi massa
Sistema di vuoto
Rivelatore
SegnaleComputer
Campione
10-5-10-8 torrCampione(gassoso) Ioni Ioni
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore di massaAnalizzatore di massa
• Fa sì che al rivelatore arrivino ioni in un ristretto intervallo di massa.
• Determina in gran parte il potere risolvente dello spettrometro di massa.
• Deve garantire una buona trasmissione e focalizzazione degli ioni.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
RisoluzioneRisoluzione
La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come:
R = m/Δm
dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%).
Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01).
Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
RisoluzioneRisoluzione
Picchi risolti al 10% della valle
Picchi risolti al 80% della valle
Inte
nsi
tà
Definizione alternativaDefinizione alternativa
La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza.Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Classi di analizzatori di massaClassi di analizzatori di massa
• A settore magnetico• A doppia focalizzazione• A quadrupolo lineare (Q)• Trappola ionica a quadrupolo (QIT)• A tempo di volo (TOF)• A risonanza ciclotronica e trasformata
di Fourier (FT-ICR)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore di massa a quadrupoloAnalizzatore di massa a quadrupolo
Potenziale nel quadrupoloPotenziale nel quadrupolo
2
coscos
2
12
0
22 tVU
r
yxtVU
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Quadrupolo ideale ad elettrodi iperboliciQuadrupolo ideale ad elettrodi iperbolici
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Campo “a sella” del quadrupoloCampo “a sella” del quadrupolo
Al centro del quadrupolo lo ione si trova in un potenziale elettrico a sella, che ruota alla frequenza del campo a RF.
L’energia dello ione viene continuamente convertita da cinetica a potenziale e viceversa.
Lo ione assume quindi un moto oscillatorio attorno alla posizione di equilibrio (sull’asse del quadrupolo), con una frequenza ed un ampiezza di oscillazione che dipendono dalla frequenza e ampiezza del campo, dalla massa e dalla carica dello ione.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Traiettorie dello ioneTraiettorie dello ione
piano xz
piano yz
piano xz
piano yz
Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y
Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Equazioni del moto dello ioneEquazioni del moto dello ione
yze
dt
ydmF
xze
dt
xdmF
y
x
2
2
2
2
Seconda legge di Newton
Introducendo l’espressione del campo Φ
2
coscos
2
12
0
22 tVU
r
yxtVU
ytVUry
xtVUrx
cos1
cos1
20
20
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Equazione di MathieuEquazione di Mathieu
20
220
2
2
2
2,
4,
2
,0)2cos2(
rm
zeVq
rm
zeUa
t
yxuuqad
ud
uu
uu
0)cos(
0)cos(
20
2
2
20
2
2
ytVUmr
ze
dt
yd
xtVUmr
ze
dt
xd
Dalle equazioni del moto
mediante un cambio di variabili (t, U, V) (ξ, a, q) si ha:
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Diagramma di stabilità del quadrupoloDiagramma di stabilità del quadrupolo
stabile lungo x stabile lungo
y
Aree di stabilità per uno ione lungo gli assi x e y.
A-D: aree di stabilità sul piano x-y. In MS si sfrutta normalmente la zona A. La zona ombreggiata si riferisce a potenziale U positivo.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Filtro di massa a quadrupoloFiltro di massa a quadrupoloa
(fun
zion
e de
l pot
enzi
ale
a D
C, U
)
q (funzione dell’ampiezza del potenziale a RF, V)
linea
di s
cansi
one di m
assa
qV
Ua
2
La linea di scansione di massa è il luogo geometrico dei punti (a, q) per gli ioni a U, V, ω e r0 fissati. Siccome a/q non dipende da m/z, tutti i punti stanno su una retta di pendenza 2U/V.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Scansione di m/z in un quadrupoloScansione di m/z in un quadrupolo
linea di scansione di massa
Variando U e V, senza variare il rapporto U/V, si realizza la scansione di massa.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore di massa a quadrupoloAnalizzatore di massa a quadrupolo
• Massimo valore m/z ~ 4 000• Risoluzione ~ 3 000
– I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione– Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità
di massa.
• Leggero, di dimensioni contenute• Facile da accoppiare alla cromatografia• Efficiente trasmissione degli ioni• Necessaria una elevata precisione
nell’allineamento delle barre degli elettrodi
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Classi di analizzatori di massaClassi di analizzatori di massa
• A settore magnetico
• A doppia focalizzazione
• A quadrupolo lineare (Q)
• Trappola ionica a quadrupolo (QIT)Trappola ionica a quadrupolo (QIT)
• A tempo di volo (TOF)
• A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Trappola ionica a quadrupoloTrappola ionica a quadrupolo
Processoredi scansione
Generatoredi RF
Rivelatore
Generatoresupplementare
di RF
Elettrodo acalotta (end-cap)
Elettrodoad anello
Filamento
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Trappola ionica a quadrupoloTrappola ionica a quadrupolo
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupoloTraiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo
Moto degli ioni in direzione z
Moto degli ioni in direzione r
tempo
Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Zone di stabilità per la trappola ionicaZone di stabilità per la trappola ionica
stabile su z
stabile su r
stabile su z
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Selezione di m/z nella prima regione di stabilitàSelezione di m/z nella prima regione di stabilità
linea di scansione di massa
Scansione di massa
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Espulsione di uno ione instabileEspulsione di uno ione instabile
instabile
Se U=0, la trappola trattiene tutti gli ioni al di sopra di una certa massa.
Aumentando l’ampiezza del potenziale a RF (V), gli ioni più leggeri, che si trovano a destra sulla linea di scansione di massa, diventano instabili e vengono espulsi dalla trappola.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Espulsione di ioni per risonanza di RFEspulsione di ioni per risonanza di RF
Frequenze di espulsione
Applicando un secondo campo di AC a RF, è possibile fornire energia di risonanza agli ioni in base al loro valore di m/z.
In questo modo si possono espellere tutti gli ioni che hanno un determinato valore di m/z, oppure tutti quelli che hanno m/z al di fuori di un certo intervallo.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Trappola ionica lineareTrappola ionica lineare
Quadrupolo lineare (solo RF)
Elettrodi terminali(a DC)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Classi di analizzatori di massaClassi di analizzatori di massa
• A settore magnetico
• A doppia focalizzazione
• A quadrupolo lineare (Q)
• Trappola ionica a quadrupolo (QIT)
• A tempo di volo (TOF)A tempo di volo (TOF)
• A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore a tempo di volo (TOF)Analizzatore a tempo di volo (TOF)
Ioni positivi
Sorgente
L
d
Zona di accelerazione con campo elettrostatico E
V = 0
dE = V0 = 20 000 V V = V0
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Calcolo di Calcolo di mm//zz dal tempo di volo dal tempo di volo
Energia cinetica
zmeV
L
zeE
mdt
02
2
02
2
1zeVmvT
m
zeV
t
Lv 02
Velocità
zmeV
L
v
Lt
02Tempo di volo
Al tempo di volo nella zona di volo va aggiunto il tempo di accelerazione nella zona in cui viene applicato di potenziale E = V0/d
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Risoluzione in TOFMSRisoluzione in TOFMS
t
t
m
m
2
• aumentando la lunghezza del tubo di volo
• diminuendo la velocità degli ioni, cioè l’energia di ionizzazione
Siccome Δt è costante (dipende dalla dispersione dei tempi di ionizzazione e delle energie degli ioni generati), si può aumentare la risoluzione aumentando t, ossia:
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Reflectron TOFReflectron TOF
Sorgente
Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt
Reflectron TOF a stadio singoloReflectron TOF a stadio singolo
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Reflectron TOF a doppio stadioReflectron TOF a doppio stadio
Sorgente
Rivelatore
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Reflectron a campo quadraticoReflectron a campo quadratico
1) Potenziale iperbolico a simmetria assiale:
r, z sono coordinate cilindriche. k, a e C sono costanti.
2) Potenziale iperbolico-logaritmico a simmetria assiale:
d > 0 e b > 0 sono costanti.
3) Potenziale iperbolico planare:
a, b e d sono costanti.
Crk
azk
zrU 22
42,
Cd
rbr
kaz
kzrU
ln
42, 22
Cdzbyk
axk
zyxU 22
22,,
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore di massa a tempo di voloAnalizzatore di massa a tempo di volo
• Massimo valore m/z > 200 000• Risoluzione fino a 105.• Il reflectron consente di:
– Ridurre le dimensioni– Aumentare la risoluzione
• Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate
• Efficiente trasmissione degli ioni• Per la doppia spettrometria di massa può
essere accoppiato con altri analizzatori (qTOF)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Classi di analizzatori di massaClassi di analizzatori di massa
• A settore magnetico
• A doppia focalizzazione
• A quadrupolo lineare (Q)
• Trappola ionica a quadrupolo (QIT)
• A tempo di volo (TOF)
• A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Principi della ICRFT MSPrincipi della ICRFT MS
Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica.Tale r.e.m. può essere rivelata da un’antenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo.
Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore a risonanza ciclotronicaAnalizzatore a risonanza ciclotronica
Piano di ricezione
Piano di emissione
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analisi di massa a trasformata di FourierAnalisi di massa a trasformata di Fourier
Segnale nel dominio del tempo Segnale trasformato nel dominiodelle frequenze m/z
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
ICR FTMS – estrema risoluzioneICR FTMS – estrema risoluzione
Esempio di spettro di massa ICR FT con risoluzione maggiore di 1 000 000,ottenuto con un magnete superconduttore da 4.7 Tesla.
Ione Cl positivoIone Cl negativo
differenza di massa:2 elettroni
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Analizzatore di massa a ICR FTAnalizzatore di massa a ICR FT
• Massimo valore m/z > 50 000• Risoluzione fino a 106.• Possibilità di confinare gli ioni per la
MS/MS.• Massima accuratezza nella
determinazione delle masse.• Semplicità nel passaggio da ioni positivi a
ioni negativi.• Prezzi ancora proibitivi per molte
applicazioni (500 –1 400 k€)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Doppia spettrometria di massa (MS/MS)Doppia spettrometria di massa (MS/MS)
Ionizzazione eframmentazione
analisidi massa
m/z
decomposizione
m1 analisidi massa
m/z
m1
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Applicazioni della MS/MSApplicazioni della MS/MS
• Maggior contenuto di informazioni• Studio della struttura
– Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione
• Rivelazione selettiva di uno ione– Drastica riduzione delle interferenze
• Studio delle reazioni ione-molecola
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
MS/MS nello spazio e nel tempoMS/MS nello spazio e nel tempo
MS/MS nello spazio
MS/MS nel tempo
Scansione delloione prodotto
Cella dicollisione
Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3
ScansioneSelezione m/z
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Combinazioni strumentali per MS/MSCombinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS nello spazioMS/MS nello spazioSettori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4).Triplo quadrupolo: QqQTempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF.
Analizzatori ibridi:Analizzatori ibridi: EBqQQqTOF
MS/MS nel tempo (MSMS/MS nel tempo (MSnn))Trappola ionica a quadrupolo (max MS8)Risonanza ciclotronica (ICR FTMS)
Combinati: Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto
ScansioneSelezione m/z
Scansione dello ione precursore
Scansione Selezione m/z
Scansione di perdita neutra
Monitoraggio di reazione selezionata
Scansionem/z = x
Scansionem/z = x-a
Selezione delprecursore
m/z = a
Selezione delframmento
m/z = b
Analizzatore di massa fissoSpettrometro di massa a scansioneScansione dello ione prodottoScansione dello ione precursoreScansione di perdita neutraMonitoraggio di reazione selezionata
Simbolismo alternativoSimbolismo alternativo
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
1. Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID).Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento.
2. Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
3. Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a.
4. Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Combinazioni strumentali per MS/MSCombinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS con risoluzione nello spazioMS/MS con risoluzione nello spazioSettori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4).Triplo quadrupolo: QqQTempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF.
Combinati:Combinati: EBqQQqTOF
MS/MS con risoluzione nel tempo (MSMS/MS con risoluzione nel tempo (MSnn))Trappola ionica a quadrupolo (max MS8)Risonanza ciclotronica (ICR FTMS)
Combinati: Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
MS di molecole biologicheMS di molecole biologiche
Classi di biomolecoleClassi di biomolecoleProteine - Peptidi Acidi nucleiciPolisaccaridiLipidi
Tecniche MSTecniche MSSorgenti: (FAB), MALDI, ESIAnalizzatori: TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR, ibridi
Tecniche separativeTecniche separativeHPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
I progetti -OMICII progetti -OMICI
GenomaGenomaIdentificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologiche
TrascrittomaTrascrittomaIdentificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genica
ProteomaProteomaCaratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Scelta della tecnica MSScelta della tecnica MS
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Massa monoisotopica e massa chimicaMassa monoisotopica e massa chimica
Massa monoisotopica (picco 12C): 1085.55
Massa media (picco 12C): 1086.28
Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono-isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a:
R = 100/0.06 = 1667 (nell’esempio sopra, R = 5000)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Identificazione del picco Identificazione del picco 1212CC
Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un centro valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco.
Insulina Albumina bovina
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Risoluzione e sensibilitàRisoluzione e sensibilità
Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Ruolo della MS in proteomicaRuolo della MS in proteomica
Proteomica sistematicaProteomica sistematicaIdentificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in una cellula. (MS o MS/MS accoppiata a 2D PAGE o 2D LC per l’analisi strutturale di miscele di peptidi e proteine intere)
Proteomica differenzialeProteomica differenzialeStudio delle differenze rilevabili fra il proteoma di una cellula sana e quello di una cellula malata (2D PAGE + MS o MS/MS per la determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione)
Proteomica funzionaleProteomica funzionaleStudio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti + MS di proteine e complessi proteici allo stato nativo)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Strategie proteomiche basate sulla MSStrategie proteomiche basate sulla MS
Proteina (sconosciuta)
Miscela di peptidi
Massa dei peptidi medianteLC/LC/ESIMS
Ricerca dei pesi molecolari
in banca dati
Sequenziamento in MSn
MSn per ulterioriInformazioni sulla
sequenza
Massa di proteine intere mediante (LC)ESI/MS
Identificazione e caratterizzazione di proteine
nota
nota
sconosciuta
sconosciuta
2D SDS PAGETop-down
Ricerca dei pesi molecolari in banca dati
bottom-updigestione
shotgun
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Approccio proteomico top-downApproccio proteomico top-down
• Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti)• Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali)• Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza•Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso• Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600m/z0
100
%
D212021.55
F221967.09D22
1929.76C22
1925.72F231881.54D23
1845.88
C231842.05
A221888.27
C212017.34
B211982.61
F212060.65
E212056.50
D202122.62
C202118.21
A202077.15
F202163.65
E202159.32
F192277.42D19
2234.34
C192229.48
2168.61
F182403.89D18
2358.292353.22
2281.38B18
2312.61
E182399.04
2364.08
D172497.09
C172491.802409.55
2412.89
F172545.25
2497.97 2550.92
2601.99
Approccio proteomico top-downApproccio proteomico top-down
Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasiSpettro m/z in ESI/qTOF di perossidasidi rafano (HRP) allo stato nativodi rafano (HRP) allo stato nativo
Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Approccio proteomico top-downApproccio proteomico top-down
41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0
100
%
A41521.9
B41600.4
C42343.1
D42422.0
E43165.0
F43243.0
2Ca2+2Ca2+
2Ca2+
Glicosilazione Glicosilazione
Sullo spettro di massa ricostruito si possono identificare isoforme, complessi metallo-proteina e modificazioni post-traduzionali
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600
m/z0
100
%
0
100
%
2196.71
1952.90
1757.67
1959.69
1971.08 2189.54
2510.712204.62
2212.08 2519.24
1542.04
1696.15
1546.95
1551.66
1615.49
1884.521701.41
1706.88
1785.45
2119.911890.46
1995.272422.66
B11B10
B9
B8B7
A10
A9 A8
A7
B:16951.5±0.3 Da
A:17566.7±0.6 Da
Eme: Mw 615.35 Da
Studio conformazionale in ESI/qTOF MSStudio conformazionale in ESI/qTOF MS
Emoglobina
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
0 5 10 15 20 25 300
7000
14000
TIC
minuti
20-May-20040.00000000
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600m/z0
100
%
FAST2 304 (15.715) Cm (300:309) TOF MS ES+ 93
A: 34151.55±0.82A40
854.94A41
834.11
834.08
A43795.33
A44777.27777.24
743.48
743.44
A48712.54A49
698.06
698.00
684.08
A37924.16
A36949.81
A341005.61
A311102.83 A29
1178.89
A271266.05
A261314.72
A251367.26
1367.36 A221553.58 A21
1627.56
M.W. 34153.95±0.81 Da
Analisi RP HPLC ESI/TOF MS di proteineAnalisi RP HPLC ESI/TOF MS di proteine
Uricasi
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
MALDI/TOF MS di una proteina nativaMALDI/TOF MS di una proteina nativa
20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000
0
20
40
60
80
100
6825
7
1036
75
1371
90
3439
0
% in
ten
sity
m/z
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Modalità di scansione MS/MSModalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto
ScansioneSelezione m/z
Scansione dello ione precursore
Scansione Selezione m/z
Scansione di perdita neutra
Monitoraggio di reazione selezionata
Scansionem/z = x
Scansionem/z = x-a
Selezione delprecursore
m/z = a
Selezione delframmento
m/z = b
Analizzatore di massa fissoSpettrometro di massa a scansioneScansione dello ione prodottoScansione dello ione precursoreScansione di perdita neutraMonitoraggio di reazione selezionata
Simbolismo alternativoSimbolismo alternativo
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
LC-MS/MS per l’identificazione “de novo” della sequenza LC-MS/MS per l’identificazione “de novo” della sequenza peptidicapeptidica
30 40 50 Time [min]
MS trace
MS/MS trace
MS
m/z600200 1000
y2b3
y3y4
y5
b7
y7
b8
y6
b9
y9
y10
b11
b12
MS/MS
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Masse degli aminoacidiMasse degli aminoacidi
Aminoacido Codice (3 lettere)
Codice (1 lettera)
Massa monoisotopica
Massa chimica
Glicina Gly G 57.02147 57.052
Alanina Ala A 71.03712 71.079
Serina Ser S 87.03203 87.078
Prolina Pro P 97.05277 97.117
Valina Val V 99.06842 99.133
Treonina Thr T 101.04768 101.105
Cisteina Cys C 103.00919 103.144
Isoleucina Ile I 113.08407 113.160
Leucina Leu L 113.08407 113.160
Asparagina Asn N 114.04293 114.104
Aspartato Asp D 115.02695 115.089
Glutammina Gln Q 128.05858 128.131
Lisina Lys K 128.09497 128.174
Gluatammato Glu E 129.04260 129.116
Metionina Met M 131.04049 131.198
Istidina His H 137.05891 137.142
Fenilalanina Phe F 147.06842 147.177
Arginina Arg R 156.10112 156.188
Tirosina Tyr Y 163.06333 163.170
Triptofano Try W 186.07932 186.213
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Frammentazione dei peptidiFrammentazione dei peptidi
H2N-CH
R1
C NH CH
R3O
x2 y2 z2 x1 y1 z1
C NH CH-COH
R4O O
a2 b2 c2 a3 b3 c3
C NH CH
R2O
x3 y3 z3
a1 b1 c1
H2N-CH
R1
C
O
C NH CH
R2O +
b2
NH3 CH
R3
C NH CH-COH
R4O O+
y”2
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Sali immonio degli amminoacidiSali immonio degli amminoacidi
H2N=CH
R
+
Amminoacidi Masse caratteristiche
Prolina (P) 70
Valina (V) 72
Leucina (L) 86
Isoleucina (I) 86
Metionina (M) 104
Istidina (H) 110
Fenilalanina (F) 120
Tirosina (Y) 136
Triptofano (W) 159
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Interpretazione dello spettro di massa di peptidi Interpretazione dello spettro di massa di peptidi
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Modifiche post-traduzionaliModifiche post-traduzionali
Glicosilazione Variabile (153.21->3000 Da)
Fosforilazione +79.98 Da
Acetilazione +42.04 Da
Formilazione +28.26 Da
Ossidazione +16.01 Da
Riduz. ponti disolfurici +2.02 Da
Ancora glicolipidica Variabile
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Identificazione di siti modificatiIdentificazione di siti modificati
Peso Molecolare Proteina Intatta
Peptide/i modificato/i
Identificazione Sito/i modificato/i
No Sì
Proteina sbagliata Mutazione
Modifica post-traduz.
Coincide con valore atteso?
Peptide Mappin
g
MS/MS
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Proteomica bottom-upProteomica bottom-up
Elettroforesi bidimensionale
(2D PAGE)
taglio degli spot;digestione con
tripsina
1000 1500 2000 Mass (m/z)
estrazione dei peptidianalisi MALDI/TOFMS
identificazione della proteina
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Digestione enzimaticaDigestione enzimatica
legame peptidico
R-C-OH
O
H2OEnzima *
proteolitico
H
R-C N-R’
O
N-R’
H
H+
proteina
(frammenti proteolitici)
*alcuni enzimi proteolitici specifici sono:tripsina tagli specifici solo a Lys-X o Arg-XLys-C Lys-XArg-C Arg-XGlu-C (V-8) Glu-X and Asp-X
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Identificazione di peptidi in banca datiIdentificazione di peptidi in banca dati
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Int.
700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500
Mass/Charge
10 mV Profiles 1-50 Smooth Sv-Gl 2 -Baseline 20
Kratos PC Axima CFRplus V2.3.0: Mode reflectron, Power: 50, P.Ext. @ 1500 (bin 157)
14
28
.85
10
45
.68
87
4.5
3
17
55
.00
10
47
.68
17
55
.99
14
29
.22
87
6.5
1
16
76
.97
67
6.0
3
93
6.4
8
10
30
.65
15
36
.76
14
30
.22
11
53
.67
73
7.9
9
93
7.4
5
66
6.0
4
10
31
.70
12
69
.76
18
06
.06
21
63
.26
22
74
.28
18
62
.99
È la più comune procedura per l’identificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa
La lista dei pesi molecolari ottenuta dall’analisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per l’identificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
MALDI TOF/TOF MS/MSMALDI TOF/TOF MS/MS
Sorgente 1
Laser
Rivelatorereflectron
Fascio MS/MS
Fascio MS
Raggio laser
Reflectron
Rivelatorelineare
Sorgente 2
Cella dicollisione
Lenti diritardo
Selettoreionico
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Motore di ricerca per l’identificazione delle Motore di ricerca per l’identificazione delle proteineproteine
ProFound (http://prowl.rockefeller.edu)
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
Digestione automatizzata: MALDI prep
MALDI/TOF MS
elaborazione dei dati e ricerca in banca dati
Risultati
2D GELSpot Cutter
Procedura di identificazione automatizzataProcedura di identificazione automatizzata
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
L’elettroforesi bidimensionale è oggi la più
potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi:
• E’ ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 104 e 106 Da• Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità)• Bassa riproducibilità da gel a gel• Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa.
Vantaggi e limiti dell’elettroforesiVantaggi e limiti dell’elettroforesi
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
Cromatografia bidimensionaleCromatografia bidimensionale
In cromatografia multidimensionale due (o più) tecniche con proprietà “ortogonali” vengono combinate per migliorare la separazione
1000 1500 2000 Mass (m/z)
Analisi di massa
Raccolta difrazioni
(*)digestione proteolitica
(*)
Separazioni cromatografiche
Una alternativa alla 2D PAGE
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
LC/LC MSLC/LC MSnn per l’analisi di miscele di peptidi per l’analisi di miscele di peptidi
0 4 8 12 16 20
0
4000
8000
12000
16000
20000
0 4 8 12 16 20
0
1000
2000
3000
4000
5000
frazione 1
frazione 2
minuti
prima dimensione: cromatografiaa scambio ionico
diverse frazioni di peptidi vengono eluite effettuando un gradiente ditampone salino a valori crescentidi forza ionica.
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
LC/LC MSLC/LC MSnn per l’analisi di miscele di peptidi per l’analisi di miscele di peptidi
Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C4 – C18)
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00Time10
100
%
PEPB1_LCMS TOF MS ES+ TIC
2.61e4
17.42
17.11
4.34
11.99
8.94
16.13
13.60
12.67
17.68
18.77
12-Mar-20040.00000000
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100m/z0
100
%
PEPB1_LCMS 263 (13.596) Cm (259:266) TOF MS ES+ 275501.2563
459.2601
413.2296
725.8798
501.7476
501.7715
688.8470679.8622
502.2749550.7875
502.7427
551.3024
624.3422561.2829
689.3666
689.8583
725.9087
726.3988
726.8892
752.3196 1001.5468834.4458
753.3177825.4760 835.4352
904.4541
1002.5290
1003.4948
Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS
DIP
AR
TIM
EN
TO
DI
CH
IMIC
A “
G.
CIA
MIC
IAN
” –
CH
IMIC
A A
NA
LIT
ICA
ST
RU
ME
NT
AL
E
API – QqTOF MS/MSAPI – QqTOF MS/MS
Ottica ditrasferimento
Quadrupolo(ponte ionico)
Esapolo(ponte ionico)
Cono dicampionamento
