Ca'*

9/0 RECETTORI-CANALI4Na. PER L'ACETILCOLINA

tossine in questione sono simili. Un uni-co schema di avvolgimento della mole-cola, rappresentato in a nell'illustrazionea pagina 74, sembra sufficiente per ge-nerare tutta la diversità delle tossine de-gli scorpioni in grado di bloccare i canalidel sodio.

I canali del potassio costituiscono unobiettivo importante per altre tossine de-gli scorpioni. Questi canali contribuisco-no alla ripolarizzazione delle membranedopo il passaggio del potenziale d'azio-

ne e sono presenti nella maggior partedelle cellule. La selettività nei confrontidi questi canali varia molto da una tos-sina all'altra; così, a bassa concentrazio-ne, la noxiustossina di Centruroidesnoxius, isolata da Lourival Possani,blocca i canali a risposta ritardata del-l'assone gigante del calamaro; a più altaconcentrazione, essa inibisce anche ilfunzionamento di certi canali del potas-sio sensibili al calcio. La caribdotossinadel veleno di Leiurus quinquestriatus

ASSONE

TERMINAZIONE NERVOSA

Ls,"`‘

Q /Q

ACETILCOLIN-ESTERASI

CANALI IONICI MUSCOLARI

l

—1 i

FIBRA MUSCOLARE

FIBRAMUSCOLARE ASSONE

È qui illustrato il funzionamento di una giunzione fra un neu-rone e un muscolo. Quando il potenziale d'azione presinapticoche si è propagato lungo l'assone raggiunge la terminazionenervosa, apre i canali del calcio che permettono l'ingresso diquesto ione nella terminazione. Questo afflusso momentaneodi calcio induce la liberazione di circa 200 «pacchetti» di ace-tilcolina, la quale attraversa la fessura sinaptica e si lega inmaniera transitoria a proteine transmembrana postsinapti-che: i recettori-canali per l'acetilcolina, localizzati alla super-ficie della fibra muscolare. L'interazione dell'acetilcolina coni recettori-canali provoca un cambiamento di conformazionedi questi ultimi, che si aprono permettendo il passaggio simul-

taneo di sodio, potassio e calcio. Il cambiamento di condutti-vità elettrica che ne risulta induce una depolarizzazione loca-lizzata e transitoria; il potenziale di placca motrice, quandosupera la soglia di eccitabilità elettrica della fibra muscolare,provoca l'apertura di un'altra popolazione di canali ionici,controllati dal potenziale della membrana muscolare. Questoprocesso genera un potenziale d'azione che si propaga lungotutta la fibra muscolare e attiva il meccanismo di contrazionemuscolare. L'acetilcolina, dopo il legame con i recettori-cana-li, viene idrolizzata molto rapidamente dall'acetilcolinesterasiancorata sulla lamina basale situata nella fessura sinaptica.(L'illustrazione è stata ideata da Jordi Molgo e Alain Harvey.)

La struttura delle tossinedegli animali velenosi

Piccole variazioni di un limitato numero di strutture proteicherendono straordinariamente specifiche ed efficaci le sostanze velenoseprodotte dai serpenti, dagli scorpioni e da alcuni invertebrati marini

' idea che un veleno naturale conten-ga un gran numero di costituentinon è nuova. Già nel 1781 Félix

Fontana segnalava, in un notevole trat-tato, che «il veleno della vipera, cometanti altri corpi, è una sostanza formatada parecchi principi che non conosciamoancora. Per quante vie difficili e scono-sciute bisognerà passare per avere qual-che lume su questa materia così difficilee oscura?»

A partire da questa prima intuizione,fisiologi e biologi hanno esaminato glieffetti delle tossine e tentato di correlarele strutture chimiche di queste ultime al-la loro azione sull'organismo. Queste ri-cerche hanno dato risultati preziosi: laconoscenza di una tossina permette discoprirne il recettore e, a volte, di isolarele sostanze chimiche che immunizzanol'animale dal proprio veleno.

Le tossine secrete dagli animali vele-nosi immobilizzano e spesso uccidono leprede. Nel corso dell'evoluzione questesostanze si sono adattate alla diversitàecologica degli animali bersaglio; terre-stri o acquatici, gli animali velenosi sonouna moltitudine e vivono negli ambientipiù vari, e a volte anche più difficili.Vent'anni di ricerche dimostrano che iveleni contengono un mosaico di tossinedestinate a bloccare diversi meccanismiessenziali per la sopravvivenza dellapreda. Nella maggior parte dei casi,esse vanno a inibire il funzionamentodel sistema nervoso, dei muscoli o dellacircolazione del sangue; a questo scopoesercitano i propri effetti su un recet-tore, per esempio quello che agisce suun canale ionico - il quale a sua voltaregola la trasmissione del potenzialeelettrico lungo l'assone di un neurone -o ancora quello che influenza un enzimadal ruolo fisiologico preciso.

Certe tossine danno prova di una se-lettività sorprendente, in quanto diffe-renziano l'animale che le produce dalla

di André Ménez

preda. In che modo gli animali velenosiriescono a elaborare le loro svariate pro-teine tossiche dalle funzioni estrema-mente raffinate?

Molte tossine di origine animale sonoproteine e le architetture proteiche sonoestremamente variabili. Che cosa si puòdire delle tossine? Quali sono le basistrutturali che garantiscono le loro mol-teplici funzioni? I numerosi lavori rivoltia chiarire la struttura tridimensionaledelle tossine, in particolare di quelle de-gli scorpioni e dei serpenti, danno rispo-sta a queste domande. Una migliore co-noscenza delle tossine, dei loro siti d'a-zione e delle molecole che le bloccanopermetterà di mettere a punto sostanzeattive nuove e utili. L'interesse di questistudi per la produzione di sieri specificiè quanto mai evidente.

Le tossine degli scorpioni

Esistono circa 1400 specie di scorpio-ni riunite in nove famiglie, ma solo unaventina di esse, appartenente alla fami-glia dei butidi, è pericolosa per l'uomo.Il primo bersaglio delle tossine degliscorpioni a essere identificato è stato ilcanale del sodio (che serve al trasportodello ione sodio verso l'interno o l'ester-no della cellula), la cui apertura e chiu-sura regolano la trasmissione dell'im-pulso nervoso (potenziale d'azione) lun-go una fibra nervosa. L'alterazione delfunzionamento di questo canale perturbala propagazione dei potenziali d'azione,e dunque anche il funzionamento dellaterminazione nervosa e del muscolo. Al-l'inizio degli anni settanta F. Miranda eH. Rochat, a Marsiglia, scoprirono nelveleno dei butidi africani tossine daglieffetti paralizzanti per i mammiferi, eFrancois Couraud dimostrò che questesostanze si fissano ai canali del sodiodelle cellule nervose e muscolari. E statopossibile distinguere due categorie di

tossine: le prime, di tipo a, spesso pre-senti nel veleno degli scorpioni africani,inducono un prolungamento del poten-ziale d'azione bloccando l'inattivazionedel canale del sodio, mentre le altre, det-te di tipo 13, si trovano nel veleno degliscorpioni americani e perturbano la ci-netica di attivazione del canale del so-dio. E. Zlotkin ha osservato che altrecomponenti del veleno non avevano ef-fetto sui mammiferi, ma, alterando ilfunzionamento del canale del sodio de-gli insetti, erano altamente tossiche perquesti ultimi.

Vi sono molti tipi di tossine di scor-pioni destinate ad agire sul canale delsodio degli insetti. Alcune, dette eccita-trici, provocano una paralisi spastica chederiva da un innalzamento del picco del-la corrente del sodio e da un rallenta-mento dell'inattivazione di questa cor-rente; altre, chiamate rilassanti, blocca-no invece la trasmissione neuromusco-lare e producono una paralisi flaccida.Certe tossine degli scorpioni, come latossina VII del veleno prodotto dallaspecie brasiliana Tityus serrulatus, sonoattive sia negli insetti sia nei mammiferi,mentre altre, come quelle dello scorpio-ne africano Androctonus australis, sem-brano agire preferenzialmente sui cro-stacei terrestri.

Tutte queste sostanze possiedono da60 a 70 amminoacidi e quattro pontidisolfuro. All'inizio degli anni ottan-ta Juan Fontecilla-Camps determinò lastruttura tridimensionale di una di questetossine, dimostrando che possiede unsegmento ad alfa elica collegato da treponti disolfuro a diversi «foglietti» pie-ghettati. Da allora sono state risolte, siaper diffrazione di raggi X sia per riso-nanza magnetica nucleare (NMR), lestrutture tridimensionali di parecchietossine che agiscono sui canali del sodiodi mammiferi o insetti; questi lavori di-mostrano che le architetture di tutte le

72 LE SCIENZE n. 305, gennaio 1994LE SCIENZE n. 305, gennaio 1994 73

quinquestriatus hebraeus agisce sui ca-nali del potassio sensibili al calcio,che hanno grande conduttanza nel mu-scolo del ratto e media conduttanza nelneurone di aplisia, un gasteropode mari-no chiamato comunemente lepre di ma-re: la tossina ha effetto anche su alcunicanali del potassio, per esempio quelliche si trovano nei linfociti di topo e nelcervello.

La scillotossina. detta anche leiuro-tossina, isolata dal gruppo di MichelLazdunski a partire dal veleno di Leiu-rus quinquestriatus quinquestriatus, èspecifica per i canali del potassio sensi-bili al calcio di piccola conduttanza,mentre la kaliotossina - che è stata re-centemente isolata dal veleno di Androc-tonus mauritanicus a opera del gruppodi Hervé Rochat - è specifica per i ca-nali di grande conduttanza. Dunque gliscorpioni producono tutta una gamma ditossine differenti che agiscono sui cana-li del potassio. Qual è la base strutturaledi questa ulteriore diversità di azionitossiche?

La caribdotossina, scoperta nel 1985,è una piccola proteina di 37 amminoaci-di che comprende tre ponti disolfuro.Sulla base di queste conoscenze, le pre-visioni strutturali indicavano che nondovesse esistere alcuna somiglianza diarchitettura fra questa tossina e le tossi-ne più lunghe che vanno a fissarsi ai ca-

nali del sodio. Naturalmente questa ipo-tesi richiedeva una conferma. La que-stione è stata affrontata e risolta pressoil Département d'ingénierie et d'étudesdes protéines (DIEP) del Commissariatà l'énergie atomique, con il contributodella Société Latoxan. A questo scopoabbiamo purificato 10 milligrammi dicaribdotossina a partire da 50 grammi diveleno di Leiurus quinquestriatus. Ab-biamo poi risolto la struttura tridimen-sionale della caribdotossina con un'ana-lisi basata sulla tecnica di risonanza ma-gnetica nucleare e sulla costruzione dimodelli molecolari.

Questi lavori da noi condotti dimo-strano che la catena polipeptidica dellatossina si avvolge in una struttura for-mata da un'elica, da un foglietto pie-ghettato e da un frammento disteso, col-legati fra loro da tre ponti disolfuro. Unsemplice colpo d'occhio a b, nell'illu-strazione di questa pagina, sarà suffi-ciente per cogliere la somiglianza fra lastruttura della caribdotossina e quellagià osservata nelle tossine più lungheche si fissano ai canali del sodio; anzi,nonostante le differenze dimensionali, sipossono facilmente sovrapporre i due ti-pi di strutture. Di fatto, i molti lavorieseguiti in seguito dimostrano che tuttele tossine degli scorpioni che vanno adagire sui canali del potassio possiedonoil motivo strutturale che in c, nell'illu-

strazione di questa pagina, appare in blu.Che agiscano sui canali del sodio o su

quelli del potassio, le tossine degli scor-pioni sembrano dunque essere prodotteda una serie di variazioni su un temastrutturale unico. Le differenze che sipossono osservare tra una tossina e l'al-tra sono principalmente localizzate a li-vello delle regioni elicoidali e delle ter-minazioni amminiche e carbossilichedelle catene polipeptidiche.

Benché possiedano un motivo struttu-rale in comune, le tossine che agisconosui canali del sodio e su quelli del po-tassio presentano analogie abbastanzascarse dal punto di vista delle sequenzeamminoacidiche. Solo alcuni residui so-no invariabilmente conservati, e fra diessi si notano sei cisteine e una glicinala cui distribuzione lungo la sequenza diamminoacidi è tutt'altro che casuale. Peresempio, la seconda e terza cisteina sonosempre separate l'una dall'altra da treamminoacidi, e fra la glicina e l'ultimacisteina vi è un solo residuo (si veda l'il-lustrazione a pagina 78). Questa distri-buzione corrisponde a posizioni precisenell'elica, nel foglietto o nel frammentodisteso del motivo strutturale: l'arran-giamento di questi rari elementi comunitraduce «in maniera lineare» i vincoli ar-chitettonici del motivo.

In linea di principio, si dovrebbe dun-que poter prevedere la presenza del mo-

tivo in questione in una proteina ognivolta che la sequenza amminoacidica diquest'ultima comprende la distribuzionemostrata nell'illustrazione. Per esempio,è stata recentemente scoperta in un ve-leno di scorpione una nuova tossina cheagisce sui canali del sodio; non se ne co-nosce ancora la struttura tridimensiona-le, ma la sua catena polipeptidica di 35amminoacidi contiene gli elementi inva-rianti descritti prima, ed è quindi proba-bile che anch'essa adotti la conforma-zione generale del motivo delle tossinedi scorpione.

Gli scorpioni, e più in particolarequelli della famiglia dei butidi, realizza-no dunque un'economia architettonicache è insieme notevole e inattesa: tuttele loro differenti molecole tossiche adot-tano un unico motivo strutturale.

E i serpenti?

Fra le 2700 specie di serpenti, quasi400 sono velenose, e sono raggruppateprincipalmente in quattro famiglie: glielapidi (cobra, mamba, bungari, serpenticorallo eccetera), gli idrofidi (serpenti dimare), i viperidi (vipere e crotali) e gliatrattaspididi (atrattaspidi). Alcune spe-cie velenose si trovano anche nella fa-miglia dei colubridi (colubri). Solo letossine delle prime quattro famiglie,spesso molto potenti e dalle funzioni al-

tamente diversificate, sono note oggi.Vedremo che, come nel caso degli scor-pioni, questa diversità di funzioni è as-sociata a un piccolo numero di strutturetridimensionali. Tuttavia la situazione èun poco più complessa perché nei ser-penti si distinguono due categorie strut-turali principali.

Le tossine della prima categoria sonopresenti nel veleno della maggior partedelle specie appartenenti alle famigliedegli elapidi, degli idrofidi e dei viperi-di. Esse possiedono tutte un'unità pro-teica di base costituita da circa 120amminoacidi e 6-8 ponti disolfuro. Que-sta unità è dotata di un'attività enzima-tica il cui ruolo, nel corso dell'azionetossica, rimane tuttora misterioso. Lastruttura dell'unità è ricca di alfa eli-che, come si vede in a nell'illustrazionedi questa pagina.

Le tossine meglio conosciute di que-sta categoria agiscono al livello presi-naptico delle giunzioni neuromuscolari,inibendo la liberazione dei neurotra-smettitori e impedendo così la contrazio-ne muscolare. Più specificamente, que-ste tossine paralizzanti sono presenti nelveleno dei serpenti australiani, dei bun-gari asiatici, di alcuni crotali e di certevipere. Tuttavia, se l'effetto finale da es-se prodotto è simile, vale a dire un bloc-co della liberazione dei neurotrasmetti-tori, non è dimostrato che il loro bersa-

glio primario sia lo stesso; è possibile,per esempio, che riconoscano classi dif-ferenti di canali del potassio. Del resto,queste tossine presentano a volte note-voli differenze di organizzazione; cosìalcune di esse, come la notexina estrattadal veleno del serpente tigre australianoNotechis scutatus scutatus, sono sempli-ci monomeri che possiedono solo l'unitàdi base. Al contrario, altre tossine sonocomposte da parecchie subunità.

Certe tossine che possiedono una uni-tà fosfolipasica di base sono caratteriz-zate, almeno in vitro, da proprietà anti-coagulanti; certe altre inducono l'aggre-gazione delle piastrine, altre ancora vi-ceversa la inibiscono; infine vi sono po-tenti citotossine, chiamate miotossine,che agiscono selettivamente sulle cellulemuscolari.

Stranamente, le proprietà enzimatichedelle tossine dotate di unità fosfolipasicanon sono sempre indispensabili per l'e-splicarsi dell'attività tossica. Per esem-pio, la nigessina del veleno del cobradal collo nero (Naja nigricollis) rima-ne citotossica anche quando le sue pro-prietà enzimatiche sono soppresse. Inve-ce l'azione enzimatica sembra necessa-ria per la funzione paralizzante delle tos-sine che agiscono a livello presinaptico.Questa variabilità moltiplica le già nu-merose possibilità di cui dispongono letossine di tipo fosfolipasico per produrre

a a

Le catene polipeptidiche di varie tossine di scorpioni sono av-volte in modo molto simile. In a è mostrata la struttura tipicadi una tossina che agisce sui canali del sodio, mentre in b sivede quella di una tossina attiva sui canali del potassio; in csono evidenziate le analogie fra le differenti strutture. Il mo-tivo comune è indicato in blu: i ponti disolfuro sono in giallo.

Le tossine dei veleno dei serpenti hanno maggiore variabilitàstrutturale. In a è mostrato il modulo di base delle tossine adattività fosfolipasica di tipo A2; in b e c catene polipeptidichedelle tossine «a tre dita»: rispettivamente tossine corte, chepossono essere curarizzanti, cardiotossiche o anticoagulan-ti, e lunghe, che possono essere curarizzanti o neurotossiche.

74 LE SCIENZE n. 305, gennaio 1994 LE SCIENZE n. 305, gennaio 1994 75

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CANALI

Ca2. VDEP Na. Ca' ci—

(g)CARIBDOTOSSINA TOSSINE a, p CLOROTOSSINA

h Gù.) DENDROTOSSINA CALCICEPTINA

CONOTOSSINA e CONOTOSSINA

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AGATOSSINA e AGATOSSINA

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RAGNI

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RECETTORI COLINERGICI

PERIFERICO NEURONALE MUSCARINICO K VDEP

(9)qNOXIUSTOSSINA

Sono indicati i principali canali ionici bloccati dalle tossine a- illustrazione schematica. Il segno + indica che si conosce unanimali. Quando la struttura della tossina è nota, ne è data una tossina con la specificità considerata, ma non la sua struttura.

una ampia gamma di funzioni tossiche.Le tossine della seconda categoria

strutturale sono presenti solo nei velenidegli elapidi e degli idrofidi. Esse sonoprive di attività enzimatica e possiedono60-70 amminoacidi e quattro (a voltecinque) ponti disolfuro; la loro catenapolipeptidica è ripiegata in una confor-mazione del tipo «a tre dita», che vie-ne mostrata in b e c nell'illustrazione apagina 75.

Parecchie tossine che adottano unastruttura a tre dita riconoscono una pro-teina che si lega all'acetilcolina. Le piùnote fra le sostanze che hanno questomeccanismo d'azione sono le tossine«curarizzanti» presenti nel veleno deglielapidi e degli idrofidi, le quali bloccanoi recettori nicotinici per l'acetilcolina neimuscoli scheletrici e provocano paralisiflaccida. Si conoscono quasi 80 tossinecurarizzanti, che vengono suddivise indue categorie, a seconda delle loro di-mensioni. Quelle dette «corte» com-prendono 60-62 amminoacidi e quattroponti disolfuro, mentre quelle «lunghe»possiedono 66-74 amminoacidi e cinqueponti disolfuro. Altre tossine riconosco-no invece i recettori per l'acetilcolina si-tuati sui neuroni. Queste neurotossinesono state scoperte nel veleno dei bun-gari e hanno una struttura molto similea quella delle tossine curarizzanti lun-ghe; a differenza di queste, però, sembrache si organizzino in un dimero. Le fa-scicoline, presenti nel veleno dei mam-ba, inibiscono l'acetilcolinesterasi, unenzima che idrolizza l'acetilcolina in co-lina e acetato. Infine, sempre nel velenodei mamba (genere Dendroaspis), vi so-no tossine che agiscono da agonisti dei

recettori muscarinici per l'acetilcolina.Le fascicoline e le tossine muscarinichehanno una certa somiglianza con le tos-sine curarizzanti corte.

Anche altre tossine presentano unastruttura a tre dita. Le cardiotossine delveleno dei cobra sono state così chiama-te per la loro capacità di perturbare ilfunzionamento cardiaco; esse depolariz-zano le membrane di numerose celluleeccitabili e sono potenti citotossine.La calciseptina, recentemente scopertada M. Lazdunski a partire dal veleno delmamba nero (Dendroaspis polylepis),blocca specificamente i canali del calciodi tipo L. Infine la mambina, anch'essaestratta da un veleno di mamba, inibiscel'aggregazione delle piastrine fissandosial recettore per il fibrinogeno di questeultime. In totale, le tossine dotate distruttura a tre dita esercitano almeno set-te funzioni differenti.

Certe tossine dei veleni dei serpentinon appartengono ad alcuna delle duecategorie strutturali citate in precedenza.Le sarafotossine, scoperte nel veleno deiserpenti del genere Atractaspis sonopeptidi vasocostrittori di 21 amminoaci-di, con due ponti disolfuro. Le dendro-tossine, contenute solo nel veleno deimamba, comprendono 59-60 amminoa-cidi e tre ponti disolfuro; esse si fis-sano a certi canali del potassio e favori-scono la liberazione dei neurotrasmetti-tori. I peptidi miotossici trovati nel ve-leno dei crotali includono 43-45 ammi-noacidi e tre ponti disolfuro. Infine, ledisintegrine presenti nel veleno dellevipere e dei crotali hanno da 47 a 83 am-minoacidi e da quattro a sette ponti di-solfuro. Possiedono tutte la sequenza

conservata arginina-glicina-acido aspar-tico e inibiscono l'aggregazione dellepiastrine, di cui riconoscono una delleproteine di superficie, la glicoproteinaIlbIlla. Le disintegrine impediscono laformazione di coaguli sanguigni.

Queste ultime tossine paiono smentireil concetto secondo cui una struttura sa-rebbe associata a parecchie funzioni tos-siche. Ma dato che restano ancora moltetossine da identificare, è possibilissimoche ve ne siano altre, attualmente ancorasconosciute, appartenenti a una delle ul-time categorie citate.

Strutture diverse, funzioni simili

Un particolare bersaglio viene a voltericonosciuto da tossine con strutture tri-dimensionali diverse, sintetizzate da ani-mali velenosi differenti. Per esempio, iconidi, gasteropodi dei mari tropicalimolto apprezzati per la splendida con-chiglia, producono pericolose tossineche vengono «lanciate» dal sifone retrat-tile e che si fissano ai recettori nicotiniciper l'acetilcolina. La tossina GI estrattada Conus geographus possiede 13 am-minoacidi e due ponti disolfuro; la suastruttura tridimensionale non presentaalcuna somiglianza con quella a tre ditadelle tossine dei serpenti, e tuttavia que-sti due tipi di tossine possono inibirsi avicenda. Analogamente, la dendrotossi-na dei mamba e la noxiustossina degliscorpioni si fissano, inibendosi a vicen-da, ai canali del potassio e stimolano laliberazione di neurotrasmettitore.

Come mostra l'illustrazione in questapagina, si potrebbe continuare la listadegli esempi anche considerando solo i

canali ionici come obiettivo delle tossi-ne. Tutto ciò indica che strutture protei-che senza alcun rapporto fra loro possie-dono siti di riconoscimento per lo stessobersaglio. Anzi, dato che queste tossinesembrano in grado di riconoscere glistessi elementi nel bersaglio in questio-ne, è possibile che presentino a loro vol-ta alcune somiglianze topografiche. Mache aspetto può avere un sito «tossico»?

Probabilmente il sito di questo tipopiù conosciuto è quello delle tossine cu-rarizzanti «corte» del veleno dei serpen-ti. Grazie a una serie di esperimenti diclonazione di RNA messaggeri - o piùesattamente di DNA complementari -che codificano per una tossina, seguitada mutagenesi diretta, abbiamo recente-mente definito con una certa precisionei suoi caratteri.

L'organizzazione del sito identificatoè complessa, con almeno 12 catene late-rali ravvicinate nello spazio a causa del-le modalità di avvolgimento della catenapolipeptidica della tossina. Una tossinacurarizzante si fissa dunque al recettoreper l'acetilcolina per mezzo di moltepli-ci punti di ancoraggio. Il gran numero disiti di contatto spiega l'alta affinità diqueste tossine per il loro bersaglio e, diconseguenza, la grande efficacia dellaloro azione. Alcuni esperimenti prelimi-nari indicano che la stessa cosa vale an-che per altre tossine.

I motivi architettonici delle tossinerappresentano dunque «impronte» com-plesse di recettori, canali ionici o enzi-mi. Inoltre, ed è forse questa l'osserva-zione che più colpisce, uno specificomotivo può elaborare impronte differen-ti e, viceversa, una particolare improntasembra poter essere rappresentata damotivi differenti. Si coglie qui la straor-dinaria flessibilità del sistema. Fino ache punto, tuttavia, una impronta «tossi-ca» si adatta a un recettore?

La perfezione delle funzioni tossiche

Un esempio può servire da spiegazio-ne. Come è facile prevedere, le tossinecurarizzanti sono molto attive sugli uc-celli, sui piccoli roditori, sulle rane e sul-le lucertole, mentre sono del tutto inat-tive sul serpente che le produce. Nel1974 il gruppo di Nobuo Tamiya dell'U-niversità di Sendai purificò un grammodi tossina curarizzante a partire dal ve-leno del serpente di mare Laticauda se-mifasciata. La preparazione venne iniet-tata per via intraperitoneale a un serpen-te della stessa specie, di peso eguale acirca 500 grammi, che la sopportò senzadanno; eppure si sapeva che questa dosedi proteina avrebbe potuto uccidere circa344 000 topi di 20 grammi! A parità dipeso corporeo, la tossina è dunque alme-no 1400 volte più nociva per il topo cheper il serpente.

Come è possibile? La risposta è sem-plice. Le tossine curarizzanti riconosco-no i recettori per l'acetilcolina di tuttigli animali sensibili ai loro effetti, come

il topo, ma non quelli del serpente chele produce; e tuttavia i recettori di que-st'ultimo sono molto simili a quelli dellespecie suscettibili, sia per funzione siaper struttura generale. Delle cinque su-bunità che formano una molecola di re-cettore per l 'acetilcolina, due, denomi-nate alfa, hanno sequenze amminoacidi-che identiche e sono il principale bersa-glio sia dell'acetilcolina sia delle tossinecurarizzanti.

S. Fuchs ha identificato le sequenzeamminoacidiche delle subunità alfa delrecettore di serpente, osservando che es-se sono caratterizzate da alcune muta-zioni nella regione che viene riconosciu-ta dalle tossine. Basterebbero queste solemutazioni per impedire alle tossine difissarsi al recettore colinergico del ser-pente senza tuttavia intralciare la fissa-zione dell'acetilcolina che è essenzialeper la vita dell'animale. Sapendo chenelle specie suscettibili il ruolo delle tos-sine curarizzanti è quello di impedire illegame dell 'acetilcolina, si può bencomprendere l'importanza di un'accura-ta regolazione del meccanismo. Eviden-temente nel corso dell'evoluzione le tos-sine hanno elaborato impronte moleco-lari dotate di capacità di discriminazionemolto raffinate.

I motivi strutturali delle tossinesono ubiquitari

Qualcuno potrebbe pensare che i mo-tivi strutturali che abbiamo descritto sia-no prodotti solo nelle ghiandole veleni-fere. In realtà i peptidi antibatterici dimolti insetti, chiamati difensine, com-prendono sei cisteine e una glicina conla stessa organizzazione lineare inva-riante tipica delle tossine di scorpione,ricordata in precedenza e scoperta daFrarnois Bontems. La stessa disposizio-ne lineare invariante esiste anche nelley-tionine, molecole difensive delle pian-te. La catena polipeptidica di queste so-stanze si avvolge formando una strutturaidentica al motivo delle tossine degliscorpioni.

Altri lavori hanno permesso di dimo-strare che questi ultimi possiedono nellaloro emolinfa una piccola proteina cheassomiglia stranamente alle difensinedegli insetti: anch'essa è dotata di pro-prietà antibatteriche e la sua sequenzaamminoacidica è caratterizzata dalla di-sposizione invariante delle tossine discorpione. Sia le tossine sia le difen-sine degli scorpioni sarebbero dunqueelaborate utilizzando lo stesso motivotridimensionale!

Anche le tossine dei serpenti presen-tano somiglianze strutturali con protei-ne elaborate in tessuti differenti dalleghiandole velenifere. Così le tossine chepossiedono attività fosfolipasica assomi-gliano da vicino alle fosfolipasi A2 pan-creatiche dei mammiferi, enzimi che in-tervengono nel processo digestivo. Sipuò notare anche qualche analogia fral'avvolgimento della catena a tre dita

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76 LE SCIENZE n. 305, gennaio 1994 LE SCIENZE n. 305, gennaio 1994 77

ORGANIZZAZIONE LINEARE COMUNE ALLE TOSSINE DEGLI SCORPIONI

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Tutte le tossine degli scorpioni possiedono nella loro sequenza ra costante, secondo la struttura qui mostrata. Il numero e laamminoacidica sei cisteine e una glicina organizzate in manie- natura degli amminoacidi in ciascuna parentesi sono %. ariabil i.

delle tossine, da una parte, e un elemen-to di una procolipasi (cofattore di un en-zima che degrada i lipidi) e l'agglutininadel germe di grano, dall'altra. Così pure,la dendrotossina del veleno dei mambaadotta una struttura spaziale sovrapponi-bile a quella dell'inibitore della trip-sina, e, infine, le sarafotossine e le en-doteline (peptidi che agiscono nella re-golazione della pressione arteriosa) sonocaratterizzate da sequenze di amminoa-cidi e strutture spaziali complessivequasi identiche. Non si conoscono anco-ra proteine strutturalmente equivalentialle disintegrine del veleno delle viperené ai peptidi miotossici dei veleni deicrotali, ma nulla indica che non ne deb-bano esistere.

Perché si trovano queste somiglianzestrutturali fra le tossine e proteine deltutto diverse, non sintetizzate in unaghiandola velenifera? Si tratta forse solodi una coincidenza?

Una evoluzione delle tossinea partire da motivi preesistenti?

Viene da pensare che due proteine cheadottano strutture simili debbano avereun legame evolutivo. Ma in quale senso?Due considerazioni indicano che le di-fensine apparvero prima delle tossinedegli scorpioni. In primo luogo nellepiante sono presenti le tionine, molecolele cui strutture e proprietà sono simili aquelle delle difensine degli insetti e de-gli artropodi. Inoltre sembra logico chegli scorpioni abbiano come prima cosamesso a punto una strategia di difesacontro gli attacchi degli organismi piùprimitivi, i batteri. Per ragioni analoghe,le tossine dei serpenti sembrano essereapparse dopo il loro equivalente struttu-rale non tossico.

In altri termini la selezione di un genecodificante per un motivo proteico par-ticolare e portatore di una funzione nonnecessariamente molto tossica avrebbeprodotto un'evoluzione in direzione difunzioni tossiche nuove per una ghian-dola specializzata. Si potrà notare che imotivi in questione non sono stati sele-zionati a caso, perché sono invariabil-mente di piccole dimensioni e possiedo-no una forte densità di ponti disolfuro,comunque superiore a quella che è pos-sibile osservare nella maggior parte del-le proteine.

Quest'ultima proprietà conferisce alletossine una elevata resistenza a condi-zioni generalmente denaturanti per leproteine, come il calore, l'ambiente aci-do o basico e così via. Ciò costituisce

un vantaggio evidente per le tossine e,di conseguenza, per gli animali che leutilizzano.

Lo sfruttamento delle tossine

Le funzioni molto duttili fanno delletossine uno strumento d'eccezione per ilfisiologo, in quanto permettono di ana-lizzare a scala molecolare eventi com-plessi come quelli coinvolti nella tra-smissione sinaptica. Uno degli esempipiù noti in questo contesto riguarda ilrecettore nicotinico per l'acetilcolina.Oggi si aprono però nuove prospettive.Così, le tossine che agiscono selettiva-mente sugli insetti costituiscono punti dipartenza potenzialmente interessanti perla messa a punto di nuovi pesticidi.poco probabile tuttavia che si possanoutilizzare queste sostanze nella loro for-ma naturale: le insettotossine sono carat-terizzate dall'ampio spettro d'azione, unvantaggio evidente per lo scorpione, manon per il chimico, dato che un pesticidadeve agire solo su alcune specie.

E ragionevole immaginare una inset-totossina dalla selettività più mirata?L'esempio delle tossine curarizzanti fapensare di sì: esse non hanno effetto sul-la specie di serpente che le produce, masono attive su altri rettili, come peresempio certe lucertole. Le tossine san-no distinguere due recettori simili sulpiano funzionale, ma leggermente diver-si per le sequenze amminoacidiche.dunque possibile una discriminazionenaturale molto fine. Gli strumenti dellachimica e dell'ingegneria genetica do-vrebbero permettere di conseguire unacapacità discriminatoria paragonabile.Nello stesso spirito, la scoperta delle di-sintegrine dei veleni delle vipere e deicrotali ha stimolato la ricerca di nuoviantagonisti del fibrinogeno capaci di ini-bire la formazione di trombi impedendol'aggregazione delle piastrine. Parecchieindustrie farmaceutiche lavorano in que-sto settore.

Si sta anche dischiudendo un'altra, epiù inattesa, direzione di ricerca. In ef-fetti, abbiamo visto che i motivi struttu-rali delle tossine sono stabili e capaci diesercitare le funzioni di riconoscimentopiù diverse e complesse. Un obiettivo dialcuni gruppi di ricerca consiste nell'in-trodurre in questi motivi mutazioni chepossano condurre alla comparsa di atti-vità biologiche nuove e non tossiche. Peresempio, si può ragionevolmente imma-ginare di trasformare una tossina in an-tagonista di un recettore ormonale. I me-todi di mutagenesi statistici o diretti

offrono, in questo contesto, prospettiveaffascinanti.

Gli animali velenosi celano dunqueun arsenale di tossine le cui azioni e-stremamente diversificate, ben adattateai bisogni di ogni specie che produce ve-leno, nascono dall'impiego di un nume-ro assai limitato di motivi architettonici,addirittura uno solo nel caso degli scor-pioni. Questo principio di economiastrutturale è probabilmente vero ancheper gli altri animali velenosi, come indi-cano i primi lavori di analisi delle se-quenze amminoacidiche o delle strutturetridimensionali delle tossine isolate, peresempio, da conidi, anemoni di mare oimenotteri. Inoltre gli stessi motivi strut-turali sono egualmente presenti in pro-teine diverse, ancestrali, a partire dallequali le tossine potrebbero essersi evo-lute, secondo un meccanismo che ci èancora sconosciuto, in quei luoghi privi-legiati che sono le ghiandole velenifere.

E verosimile che i numerosi «caccia-tori» di tossine allunghino, negli anni avenire, l'elenco già cospicuo delle so-stanze tossiche conosciute; probabil-mente si aggiungeranno le proteine dallefunzioni artificiali nuove che i biologicercano di creare. Le proteine tossicheanimali costituiscono materiali biologiciche non devono essere considerati sol-tanto con diffidenza e timore. Ben inte-so, bisogna sapersene proteggere: i nu-merosi progressi in campo immunologi-co ci rassicurano su questo punto; in par-ticolare, i sieri antiveleno sono numerosied efficaci. Di conseguenza, ben più diieri, le tossine appaiono come sostanzedi ricchezza tale da far dubitare se que-ste molecole siano davvero nemiche enon, piuttosto, alleate dell'uomo.

BIBLIOGRAFIA

Serpents, venins, envenimations, So-ciété Herpétologique de France, EditionFondation Marcel Mérieux, 1987.

STOCKER K. (a cura), Medical Use ofSnake Venom Proteins, CRC Press, BocaRaton, 1990.

Snake Toxins, International Encyclo-pedia of Pharmacology and Therapeu-tics, a cura di A. H. Harvey, PergamonPress, 1991.

MENEZ A. e altri, in «Proceedings ofthe Royal Society of Edinburgh», 99B,pp. 83-102, 1992.

BONTEMS F. e altri, in «Science»,n. 254, pp. 1521-1523.

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