DETERMINAZIONE DELLA FOSFATASI ALCALINA NEL LATTE ... · Per il confronto, le analisi con lo...

RIASSUNTO - La determinazione della Fosfatasi Alcalina è il principale indicatore di correttapasteurizzazione del latte; il limite legale è fissato in 350mU/L (Reg. CE 1664/2006). Inquesto lavoro sono stati confrontati due diversi strumenti per la determinazione dell’attivitàfosfatasica presente nei campioni: lo strumento Fluorophos® Test System, in uso presso ilLaboratorio, che si basa su una reazione fluorimetrica, e lo strumento F-AP™ Fast Testwith novaLUM™, di più facile e rapido impiego, che sfrutta, invece, il principio dellachemiluminescenza. Sono stati analizzati complessivamente oltre 100 campioni di latte dispecie differenti e titolo in grasso diverso, crudi o sottoposti a trattamento termico. Al finedi permettere le valutazioni di confronto, il risultato ottenuto in fluorimetria è stato assuntocome valore di riferimento senza che ciò lo definisca come “valore reale”. Dal punto di vistaquantitativo è emersa una tendenza alla sovrastima dello strumento basato sulla chemilu-minescenza, che conferma osservazioni precedenti di altri autori (Albillos et al 2008).Risultati più concordanti si osservano, invece, se si considerano i dati del confronto dalpunto di vista qualitativo: le capacità di discriminazione tra prodotti correttamentepasteurizzati e prodotti trattati in modo insufficiente o crudi coincide nella quasi totalitàdei campioni analizzati.Parole chiave: latte, fosfatasi alcalina, Fluorophos®, F-AP™

SUMMARY - Determination of alkaline phosphatase activity in milk: comparison betweenmethods and instruments - The Alkaline Phosphatase is a heat susceptible enzyme and itsdetection is used as retrospective indicator for milk pasteurization. The legal limit thatguarantees a successful pasteurization is <350 mU/L (Reg. CE 1664/2006). In this studythe ALP activity was determined by using two different analytical methods: the first,commonly applied in our Laboratory, is based on a fluorescence reaction and employs theFluorophos®; the second is easier and quick to perform is based on chemiluminescenceprinciple and uses the F-AP™. About 100 different samples were analyzed including milksamples of different species with a variable quantity of fat, both raw and heat-treated. TheFluorophos® results were used as reference values for the comparison, even if they are not“true values”. Overall results show an overestimation trend of chemiluminescence vsfluorimetric technique that confirms previous observations of Albillos et al (2008). More

Buffoli et al (2013) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 64 (3-4), 0-0 0

DETERMINAZIONE DELLA FOSFATASI ALCALINA NEL LATTE:CONFRONTO TRA METODICHE E STRUMENTI

Elena BUFFOLI1, Francesca FUSI1, Giuseppe BOLZONI1*

* Corrispondenza ed estratti: [email protected] Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna - Centro di Referenza Nazionale

per la Qualità del Latte Bovino. Via Bianchi 9, Brescia

similar results in almost all samples analyzed were observed in term of qualitative outcomei.e. the ability to correctly identify the milk pasteurization and to discriminate betweenwell-pasteurized and raw or insufficient heat-treated products.Keywords: milk, Alkaline Phosphatase, Fluorophos®, F-AP™

0 Buffoli et al (2013) Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 64 (3-4), 0-0

INTRODUZIONE

La fosfatasi alcalina (ALP) è una metalloproteina presente nel latte, legata ai globulidi grasso, caratterizzata da resistenza alcalore leggermente superiore a quella diCoxiella burnetii (microrganismo patogenoconsiderato termine di riferimento per latermoresistenza dei patogeni).

Sin dagli anni 1930 la determinazionequantitativa della fosfatasi è stata riservataal controllo del latte alimentare pasteuriz-zato, durante la sua vita commerciale [1, 2];relativamente più recenti sono l’applicazionenel controllo di prodotti derivati dal latte odi altro tipo (succhi di frutta, prodotti farma-ceutici, gelati, yogurt, panna), le verifiche digenuinità di alcuni prodotti (formaggi a basedi latte crudo con divieto di termizzazione)e, soprattutto, i controlli di processo nellaproduzione dei formaggi a base di latte pa-steurizzato [3]. Anche a livello Normativol’attenzione verso questo parametro si èrecentemente riattivata; alcune dispute com-merciali internazionali hanno infatti eviden-ziato difficoltà di definizione ed uniformazio-ne dei limiti di sicurezza alimentare e quindidi giudizio di conformità nell’import-exportdei formaggi. Oltre alle particolari caratte-ristiche di alcune tipologie di formaggi, unodegli aspetti problematici è proprio l’esistenzadi differenti tecniche analitiche (chemilumi-nescenza e fluorimetria) applicate nei diversipaesi [4, 5].

In prospettiva, è probabile che il controllodell’attività fosfatasica nelle fasi del processodi caseificazione e sui prodotti finiti nel corsodella loro vita commerciale sia destinata adiventare un fattore di controllo più frequentee diffuso. In quest’ambito, quindi, la disponi-bilità di strumenti di rapido e semplice im-piego in grado di fornire informazioni diretteagli operatori del settore potrebbe rilevarsi

particolarmente utile nel prossimo futuro.In quest’ottica, è stata realizzata la pre-

sente prova di confronto tra la metodicafluorimetrica in uso presso il Laboratoriodell’IZSLER con lo strumento Fluorophos®Test System (Advanced Instruments, Inc.,Norwood, US), e la metodica chemilumine-scente con lo strumento F-AP™ Fast Testwith novaLUM™ (Charm Sciences Inc., US),in collaborazione con il distributore italianoAlitest Srl di Mantova.

MATERIALI E METODI

Il confronto tra le due strumentazioni èstato effettuato analizzando oltre 100 cam-pioni di latte bovino di varie tipologie: crudo,pasteurizzato (intero e parzialmente screma-to), UHT (intero, parzialmente scremato,scremato) reperiti in commercio o allestiti etrattati in laboratorio a partire da latte dimassa aziendale. Per le valutazioni di linea-rità strumentale del F-AP™ sono stati ana-lizzati anche campioni di latte caprino ebufalino, trattati termicamente e diluiti conquantità progressive e scalari di latte crudo,previamente testato, per ottenere valori“attesi” di ALP.

Per il confronto, le analisi con lo strumentoFluorophos® sono state eseguite in singolareplica assumendo come limiti di variabilitàquelli stimati in funzione della ripetibilitàstrumentale attesa ed assumendo quindicome esito finale il risultato dell’unica replicaeseguita; mentre le analisi con lo strumentoF-AP™ sono state condotte sempre in doppiareplica (F-AP™ min e F-AP™ max) così dadisporre sempre del valore di ripetibilità edassumendo come esito finale il valore medio(F-AP™ media). La ripetibilità teorica delFluorophos® in dotazione è stata comunqueverificata su 15 campioni di diversa tipologiarisultando conforme alle attese.

Figura 1 - Confronto tra le letture dei due strumenti per campioni di latte con valore di ALP superiorea 100.000 mU/LFigure 1 - Comparison between instruments: milk samples with ALP >100.000 mU/L


Tutti i campioni di latte crudo analizzaticon il Fluorophos® sono stati diluiti 1:100secondo quanto indicato dal Metodo di Provaal fine di ottenere valori compatibili con ilcampo di misura dello strumento, mentrecon il F-AP™ è stato possibile eseguire di-rettamente le determinazioni sul latte talquale (secondo le istruzioni fornite dai pro-duttori nei rispettivi “Manuale del-l’Operatore”).

Nel corso del lavoro sono stati condottianche ulteriori test con differenti finalità,così sintetizzabili (dati non pubblicati):

- Valutazione della ripetibilità strumen-tale F-AP™

- Valutazione dell’effetto della tempera-tura del campione sulla determinazione ana-litica

- Test di confronto tra lotti di produzionedei reagenti F-AP™

- Replica delle prove di confronto realiz-zate da Albillos et al. 2008 [6].

RISULTATI E DISCUSSIONE

1. Confronto tra strumenti - In figura 1sono rappresentati i campioni di latte crudoordinati secondo il valore di ALP ottenutocon la metodica fluorimetrica. E’ osservabileuna sottostima, limitata ma abbastanzadiffusa, rispetto ai risultati ottenuti con latecnica di chemiluminescenza del F-AP™.La differenza appare tendenzialmente menoaccentuata al crescere del livello di fosfatasi;18 casi su 33 (54,5%) forniscono risultatisovrapponibili se si considerano anche i limitidi variabilità delle misure. Da un punto divista qualitativo, tutti i campioni analizzatirisulterebbero comunque correttamente clas-sificabili come “latte crudo” da ambedue glistrumenti.

In figura 2, il medesimo tipo di confronto,è focalizzato su campioni di latte con valoridi ALP inferiori, corrispondente in linea dimassima a latte trattato termicamente manon propriamente pasteurizzato. Anche in

Figura 2 - Confronto tra le letture dei due strumenti per campioni di latte con valore di ALP compresitra 350 e 2.500mU/LFigure 2 - Comparison between instruments: milk samples with ALP from 350 to 2500mU/L


questo range, si confermerebbe la tendenzaalla sovrastima degli esiti del F-AP™, conaree di sovrapposizione però in questo casosostanzialmente assenti. Va sottolineato chesi tratta di campioni con ridotta attivitàfosfatasica e, soprattutto, che ambedue glistrumenti in quest’ambito offrono prestazionidi ripetibilità decisamente migliori (e ciòriduce di conseguenza la variabilità attesa).Anche in figura 3, incentrata su campionicon minimi contenuti di ALP corrispondentiquindi a latte pasteurizzato, la tendenza allasovrastima appare ancora apprezzabile, an-che se meno costante con 19 casi su 41(46,3%) di sovrapposizione ed anche alcunicasi di sottostima dello strumento F-AP™.Questi campioni sono prossimi al limite dirilevabilità di entrambi gli strumenti, percui il confronto quantitativo perde gran parte

della sua significatività: qualitativamente35 campioni su 41 (85%) forniscono giudiziocoincidente (<350 mU/L).

In sintesi quindi dal confronto effettuatoemerge per lo strumento F-AP™, rispettoalla metodica fluorimetrica, una leggeratendenza alla sottostima per i valori moltobassi ed una sovrastima più consistente peri valori superiori che diventa infine trascu-rabile nel caso del latte crudo.

Una valutazione più diretta dei risultatiottenuti può essere dedotta dalla quantifica-zione percentuale delle differenze medie trai due strumenti visibile in tabella 1, con icampioni suddivisi in classi. Questa valuta-zione assembla tutti i campioni confrontati,indipendentemente dal tipo commerciale(titolo in grasso e trattamento termico), efornisce quindi un valore medio complessivo

Figura 3 - Confronto tra le letture dei due strumenti per campioni di latte con valore di ALP compresitra 0 e 350 mU/LFigure 3 - Comparison between instruments: milk samples with ALP from 0 to 350 mU/L

Tabella 1 - Confronto tra strumenti: differenza tra risultati quantitativi (riferimento Fluorophos®;tutti i campioni)Table 1 - Comparison between instruments: difference of quantitative results (Reference Fluorophos®;all samples)


della differenza osservata. Come già accen-nato, le differenze rilevate non riguardanola “correttezza” del risultato finale: il valoreottenuto con il Fluorophos® costituisce, in-fatti, il riferimento per il confronto, ma nonnecessariamente il valore più rispondenteal “valore vero”.

A conferma di ciò, è sufficiente osservarein tabella 2 come si modificherebbero ledifferenze percentuali medie ordinando idati in funzione dei livelli di ALP forniti,questa volta, dallo strumento F-AP™ e as-sunti come valori di riferimento.

Da un punto di vista pratico, l’aspetto più

Tabella 2 - Confronto tra strumenti: differenza tra risultati quantitativi (Riferimento FAPTM; tuttii campioni)Table 2 - Comparison between instruments: difference of quantitative results (Reference FAPTM ;all samples)

Tabella 3 - Confronto tra strumenti: risultati qualitativiTable 3 - Comparison between instruments: qualitative results


importante del confronto è quello che riguar-da il giudizio qualitativo dei prodotti sotto-posti ad analisi. A questo scopo si sono sele-zionati i risultati compresi tra 0 e 750 mU/L,suddividendoli poi per tipologia di campionee per coincidenza di valutazione tra i duestrumenti (Tab. 3).

La coincidenza è risultata completa peri campioni di latte pasteurizzato e UHT. Daconsiderare concordi anche le valutazionisui 3 campioni di latte “pasteurizzato” chehanno fornito, con entrambi gli strumenti,

valori superiori al limite normativo. Ugualeosservazione va riservata ai 12 campioni dilatte UHT nei quali si è rilevata una quantitàdi ALP assolutamente incoerente con il valoreatteso, con ambedue le tecniche analitiche.Tale fenomeno, tutt’altro che raro, può essereattribuito ad una riattivazione enzimaticaa seguito probabilmente di un’erronea con-servazione del prodotto a temperature ecces-sive. I casi di mancata concordanza riguar-dano invece 5 campioni su 25. Soltanto unodi questi (latte bovino scremato) ha dato un

Tabella 4 - Prova di linearità: scarti tra valore ottenuto e valore atteso (solo latte bovino crudo intero)Table 4 - Linearity Test: differences between expected and observed values (only whole, raw bovine milk)


esito significativamente più elevato con lostrumento F-AP™ (897 vs 337 mU/L), mentrenegli altri 4 casi (2 capra intero, 1 bovinoscremato, 1 bovino intero) la sovrastimaosservata, sufficiente a superare il limitelegale che definisce il punto di discrimina-zione tra pasteurizzato e non, era di entitàpiuttosto limitata.

2. Prova di linearità - La prova è statarealizzata su tutto il campo di misura seb-bene l’utilizzo primario di questi strumentisia il controllo di valori prossimi al limite diconformità del trattamento termico del latte.La determinazione del valore “atteso” per lesingole diluizioni è stato calcolato, per cia-scuno strumento, a partire dal “valoreosservato” nel campione di latte crudo dipartenza. Gli scarti rispetto ai valori attesisono stati statisticamente elaborati per specie(bovino, caprino, bufalino) e tipologia di latte

(intero, scremato): a titolo di esempio intabella 4 vengono riportati i risultati relativial latte bovino intero.

Nella figura 4 è invece appresentato l’an-damento complessivo degli scarti osservatiper tutte le tipologie di latte esaminato. Puressendo presenti singoli casi di notevoliscostamenti dai valori attesi, la distribuzionedegli scarti appare complessivamente raccol-ta e, soprattutto, coincidente tra gli strumen-ti. Come previsto, oltre a sporadici casi dielevato scarto per contenuti di ALP moltolimitati, l’area di minor uniformità è rappre-sentata dai campioni di latte crudo t.q. Comegià accennato, la necessità di ricorrere perquesti ultimi campioni (quantomeno pervalori oltre 20.000 mU/L) alla diluizione1:100 per lo strumento Fluorophos®, rendesostanzialmente non confrontabili i risultatidei due strumenti.

Figura 4 - Prova di linearità: scarti tra valore ottenuto e valore atteso per tutte le tipologie di latteFigure 4 - Linearity Test: differences between expected and observed values (all samples)


Di conseguenza si ritiene più significativala rappresentazione offerta in figura 5 che,dopo trasformazione logaritmica dei dati edesclusione delle aliquote > 20.000 mU/L,mostra il tracciato delle rette di regressioneche permettono di apprezzare più diretta-mente il similare comportamento dei duestrumenti. A scopo informativo si riporta,comunque, la formula della regressione otte-nibile per lo strumento F-AP™ su tutti icampioni analizzati (compresi quindi quellidi latte crudo), che non differisce in modosignificativo da quella indicata nella figura 1:

y = 0,9669x + 0,0905 R2 = 0,9961

CONCLUSIONI

Tenuto conto delle specifiche condizioniin cui la prova di confronto è stata realizzata,è risultato complessivamente confermato uncerto livello di sovrastima degli strumenti

basati sulla chemiluminescenza rispetto aquello fluorimetrico in uso presso il labora-torio. I risultati ottenuti del resto confermanoquelli già segnalati da Albillos et al nel 2008,che ha confrontato il Fluorophos® con diffe-renti tipi di strumenti a chemiluminescenza.Per quanto riguarda le valutazioni qualita-tive, relative alla capacità di differenziareprodotti correttamente pasteurizzati da quellicrudi o trattati in modo parziale, si sonocomunque ottenuti esiti soddisfacenti, ancheconsiderando che, in alcuni casi, si sonoappositamente create condizioni “border-line” (con la miscelazione di latte crudo etrattato termicamente), in cui anche unaminima differenza analitica poteva determi-nare un giudizio differente.

Al di là delle valutazioni tecniche sulledifferenti metodiche, riteniamo importantesottolineare che lo strumento F-AP™ si

Figura 5 - Prova di linearità: rette di regressione dei due strumenti (esclusi campioni di latte crudo)Figure 5 - Linearity Test: Regression lines of two instrument (raw milk samples excluded)

BIBLIOGRAFIA

1) International Organization for Standardization (ISO) 11816-1 IDF 155-1; 1997 (E) 2) International Organization for Standardization (ISO) 22160 IDF 209 2007 (E) 3) International Organization for Standardization (ISO) 11816-2 IDF 155-2 2003 (E) 4) Alkaline Phosphatase testing for milk pasteurization. Cornell University, Dairy Foods

Science Notes, version 11-07 5) Salter R, Fitchen J (2006) Evaluation of a chemiluminescence method for measuring

Alkaline Phosphatase Activity in whole milk of multiple species and bovine dairy drinks:interlaboratory study. J AOAC Int 89(4) 1061-1070

6) Albillos SM, Reddy R, Salter R (2008) Comparison of phosphatase methods used formilk pasteurization verification. 122nd AOAC Annual Meeting and Exposition, Dallas


inserisce tra quelli di semplice e prontouso nelle condizioni di campo (quali i con-trolli di processo, in tempo reale, in lineadi produzione), in quanto non richiedecompetenze ed attrezzature tipiche deilaboratori specialistici ai quali sono invecedestinate le strumentazioni più complesse

e delicate come il Fluorophos®.

Ringraziamenti:Poster presentato al 3° Congresso Lattie-

ro-Caseario AITeL-Regione Lombardia, Mi-lano 28 settembre 2012 “Latte e derivati: laricerca e l’innovazione”.

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