Crioconservazione Crioconservazione di gameti ed embrionidi gameti ed embrioni

Rosanna Ciriminna Adina Massacesi Rosanna Ciriminna Adina Massacesi Centro Ambra- Palermo Centro Bios -RomaCentro Ambra- Palermo Centro Bios -Roma

La criobiologia ha molto a che fare con La criobiologia ha molto a che fare con l’acqua:l’acqua:

si può ricondurre infatti alla maniera di si può ricondurre infatti alla maniera di congelare l’acqua intracellulare senza congelare l’acqua intracellulare senza

uccidere le cellule.uccidere le cellule.

La crioconservazione è una branca La crioconservazione è una branca della criobiologia che consente il della criobiologia che consente il

mantenimento della vitalità cellulare mantenimento della vitalità cellulare per un tempo prolungato, tramite per un tempo prolungato, tramite congelamento a temperatura di –congelamento a temperatura di –

196°C in azoto liquido.196°C in azoto liquido.

Il principio fondamentale della Il principio fondamentale della crioconservazione è quello di crioconservazione è quello di

interrompereinterrompere i processi biochimici del metabolismo i processi biochimici del metabolismo

cellulare. cellulare. Ciò si ottiene convertendo in ghiaccio Ciò si ottiene convertendo in ghiaccio

(CONGELAMENTO), a temperature (CONGELAMENTO), a temperature sufficientemente basse, l’acqua sufficientemente basse, l’acqua

presente all’interno delle cellule. presente all’interno delle cellule.

La crioconservazione è valida se il La crioconservazione è valida se il sistema biologico torna a temperatura sistema biologico torna a temperatura

normale (SCONGELAMENTO) senza normale (SCONGELAMENTO) senza dover sopportare insulti strutturali o dover sopportare insulti strutturali o biochimici che possano causarne la biochimici che possano causarne la

morte cellulare.morte cellulare.

È POSSIBILE CRIOCONSERVAREÈ POSSIBILE CRIOCONSERVARE

SpermatozoiSpermatozoi Tessuto testicolareTessuto testicolare OvocitiOvociti Tessuto ovaricoTessuto ovarico ZigotiZigoti Preembrioni prima della Preembrioni prima della

compattazionecompattazione BlastocistiBlastocisti

SPERMATOZOISPERMATOZOIE E

TESSUTO TESTICOLARETESSUTO TESTICOLARE

BANCA DEL SEMEBANCA DEL SEME

Autoconservazione degli spermatozoi

•Soggetti ipofertili •Soggetti con azoospermia•Soggetti che si sottopongono a vasectomia •Soggetti che devono sottoporsi a chemio e/o radioterapia

Preservare la potenzialità riproduttiva

La crioconservazione è La crioconservazione è fondamentale nei casi in cui si fondamentale nei casi in cui si

assiste ad progressivo assiste ad progressivo abbattimento dei valori di abbattimento dei valori di concentrazione, motilità e concentrazione, motilità e morfologia nemaspermica.morfologia nemaspermica.

La possibilità di La possibilità di crioconservare il liquido crioconservare il liquido seminale è di notevole seminale è di notevole

vantaggio per la gestione dei vantaggio per la gestione dei protocolli terapeutici protocolli terapeutici

finalizzati alla procreazione finalizzati alla procreazione assistitaassistita

La crioconservazione risulta La crioconservazione risulta essere una procedura essere una procedura

prioritaria ed imprescindibileprioritaria ed imprescindibilenei casi di AZOOSPERMIAnei casi di AZOOSPERMIA

quindi perquindi per SPERMATOZOI TESTICOLARISPERMATOZOI TESTICOLARI

PESAMESA TESA TESE

ICSIICSI

Si procede allaCRIOCONSERVAZIONE

TFNA

Qualunque sia la tecnica di prelievo a livello testicolare

Vantaggi della crioconservazione Vantaggi della crioconservazione di spermatozoi testicolaridi spermatozoi testicolari

Possibilità di raccogliere e studiare campioni

testicolari di pazienti gravemente oligoastenospermici

o azoospermici in fase diagnostica, quindi prima che

la partner venga sottoposta a stimolazione della

crescita follicolare multipla per l’ esecuzione della

fecondazione in vitro mediante ICSI.

La crioconservazione non modifica iLa crioconservazione non modifica i

risultati di fertilizzazione, risultati di fertilizzazione,

formazione di embrioni e possibilità formazione di embrioni e possibilità didi

gravidanza se la motilità degligravidanza se la motilità degli

spermatozoi è anchespermatozoi è anche

parzialmente conservataparzialmente conservata

OVOCITIOVOCITIED ED

EMBRIONIEMBRIONI

Ci sono così poche pubblicazioni sulla Ci sono così poche pubblicazioni sulla crioconservazione di ovociticrioconservazione di ovociti

La tecnica è considerata poco efficienteLa tecnica è considerata poco efficiente In alcuni paesi ci sono restrizioni legali In alcuni paesi ci sono restrizioni legali

(Francia)(Francia)

Le uniche indicazioni valide sono:• rifiuto della crioconservazione di embrioni • conservazione della fertilità• divieto di congelare zigoti o embrioni.

20042004Legge 40 Legge 40

Art. 14 – Limite all’applicazione delle Art. 14 – Limite all’applicazione delle tecniche.tecniche.

E’ vietata la crioconservazione degli E’ vietata la crioconservazione degli embrioni.embrioni.

““Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al

momento della fecondazione e' consentita la crioconservazione momento della fecondazione e' consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da

realizzare non appena possibile.”realizzare non appena possibile.”

TECNICHE DI TECNICHE DI CRIOCONSERVAZIONECRIOCONSERVAZIONE

Sloow cooling – congelamento lentoSloow cooling – congelamento lento

Vitrificazione – congelamento rapidoVitrificazione – congelamento rapido

Polak de Fried et al, FS 1998Polak de Fried et al, FS 1998 2 ovociti fecondati : nascita di un maschio sano2 ovociti fecondati : nascita di un maschio sano

Antinori et al, ESHRE 1998Antinori et al, ESHRE 1998 38 transfer : 2 gravidanze, 1 ongoing38 transfer : 2 gravidanze, 1 ongoing

Young et al, FS 1998Young et al, FS 1998 9 ovociti congelati; 8 sopravvissuti ; 5 embrioni 9 ovociti congelati; 8 sopravvissuti ; 5 embrioni

trasferiti: gravidanza trigemina (aborto a 10 ws)trasferiti: gravidanza trigemina (aborto a 10 ws) Trounson et al, ESHRE 2000Trounson et al, ESHRE 2000

3 bambini nati3 bambini nati

OVOCITI IN Metafase II: risultatiOVOCITI IN Metafase II: risultati

Molto incoraggianti ma solo l’ 1% di nati

Porcu et al., 2000 sopravvivenza 54% Fabbri et al., 2001 sopravvivenza 82% Fosas et al., 2003 sopravvivenza 89% Chen et al., Borini et al. 2005 sopravvivenza 75-80%

MODIFICHE AL PROTOCOLLOMODIFICHE AL PROTOCOLLOportano al miglioramento dei portano al miglioramento dei

risultati in termini di sopravvivenza risultati in termini di sopravvivenza ovocitariaovocitaria

Ancora non soddisfacente il numero di bambini nati

Efficienza

La crioconservazione degli ovociti è stata considerata una tecnica a bassa efficienza a causa della bassa sopravvivenza, fertilizzazione e capacità di divisione dell’embrione.

Il miglioramento dei protocolli di congelamento ha reso la tecnica più soddisfacente in termini di sopravvivenza degli ovociti allo scongelamento,

Con l’ introduzione dell’ ICSI sono migliorati i risultati anche in termini di fecondazione, di formazione degli embrioni e di impianto.

Crioconservazione di ovocitiCrioconservazione di ovociti

La sopravvivenza allo scongelamento è La sopravvivenza allo scongelamento è l’unico criterio per valutare la qualità l’unico criterio per valutare la qualità

degli ovociti crioconservatidegli ovociti crioconservati

La sopravvivenza e la competenza allo sviluppo La sopravvivenza e la competenza allo sviluppo non sono necessariamente correlate con criteri non sono necessariamente correlate con criteri clinici o morfologici.clinici o morfologici.

L’assenza di degenerazione dopo scongelamento L’assenza di degenerazione dopo scongelamento non è un indicatore attendibile della vitalità.non è un indicatore attendibile della vitalità.

La sopravvivenza deve coincidere con la La sopravvivenza deve coincidere con la conservazione dei fattori morfofunzionali conservazione dei fattori morfofunzionali essenziali verificabili oggettivamente.essenziali verificabili oggettivamente.

VITRIFICAZIONE

Si basa sul concetto fisico della Si basa sul concetto fisico della

solidificazione senza formazione di solidificazione senza formazione di

cristalli di ghiaccio così come cristalli di ghiaccio così come

avviene nel congelamento lento. avviene nel congelamento lento.

0

20

40

60

80

100

120

140

1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006

pubblicazioni: V IT R IF ICA ZIONE

L’interesse verso questa tecnica ha avuto un grosso incremento negli ultimi anni

Kuleshova et al., nel 1999 Kuleshova et al., nel 1999 riportarono la prima nascita riportarono la prima nascita

dopo vitrificazione e dopo vitrificazione e scongelamento di 17 ovociti scongelamento di 17 ovociti

CONFRONTO TRA SLOW FREEZING E CONFRONTO TRA SLOW FREEZING E VITRIFICAZIONEVITRIFICAZIONE

AUTOREAUTORE METODMETODOO

% SOPRAV% SOPRAV % FERT% FERT N° OVO/GRAVN° OVO/GRAV

Fabbri, 2001Fabbri, 2001 SFSF 5353 7979 9494

Chen, 2005Chen, 2005 SFSF 7575 6767 2323Boldt, Boldt, 20062006

SFSF 6060 6161 2626

Yoon, 2003Yoon, 2003 VFVF 68.668.6 71.771.7 7979KuwayamaKuwayama, 2005, 2005

VFVF 9191 9090 55

Cobo, 2007Cobo, 2007 VFVF 9797 76.376.3 1111Yoon, 2007Yoon, 2007 VFVF 85.185.1 77.477.4 2121

Risultati della vitrificazione di Risultati della vitrificazione di ovocitiovociti

AUTOREAUTORE N° CASIN° CASI N° OVON° OVO

SCONGSCONGSR %SR % N° CGN° CG NATINATI

Kuleshova, 1999Kuleshova, 1999 44 1717 6565 11 11

Wu, 2001Wu, 2001 3636 7979 5959 11 00

Yoon, 2003Yoon, 2003 3434 474474 6969 88 77

Kim, 2003Kim, 2003 1616 5151 8080 11 00

Chian, 2005Chian, 2005 1515 180180 9494 1111 00

Kuwayama, 2005Kuwayama, 2005 6767 107107 8080 1212 77

Katayama, 2003Katayama, 2003 66 4646 9494 22 22

Kyono, 2005Kyono, 2005 11 55 100100 11 11

Lucena, 2006Lucena, 2006 2323 159159 7575 1313 00

Selman, 2006Selman, 2006 66 2424 7575 33 00

Yoon, 2007Yoon, 2007 2828 364364 8585 1717 00

Antinori, 2007Antinori, 2007 120120 330330 9999 3939 33

I migliori risultati pubblicati nel 2007 riportano:- sopravvivenza ovocitaria 85%

- gravidanze 43,5 %

E’ IN CORSO UNO STUDIO MULTICENTRICO SULLA E’ IN CORSO UNO STUDIO MULTICENTRICO SULLA VITRIFICAZIONE DI OVOCITIVITRIFICAZIONE DI OVOCITI

proposto dallaproposto dalla

ScopoScopo

Verificare l’efficacia della vitrificazione di ovociti. Verificare l’efficacia della vitrificazione di ovociti.

Lo studio è stato approvato dal comitato di bioeticaLo studio è stato approvato dal comitato di bioetica

dell’Università di Pisa è stato avviato a settembredell’Università di Pisa è stato avviato a settembre

2007 e sono già stati vitrificati circa 150 ovociti.2007 e sono già stati vitrificati circa 150 ovociti.

OVOCITI O EMBRIONI?OVOCITI O EMBRIONI?PROPRO

OvocitiOvociti Superamento problemi Superamento problemi

etico-legalietico-legali Preservazione della Preservazione della

fertilità in pazienti fertilità in pazienti

oncologiche o con oncologiche o con

problemi diversi. problemi diversi. Recupero degli ovociti Recupero degli ovociti

quando il seme non è quando il seme non è

disponibiledisponibile

EmbrioniEmbrioni Riproducibilità dei Riproducibilità dei

risultatirisultati Omogeneità degli Omogeneità degli

standard operativistandard operativi Verifica sui natiVerifica sui nati

OVOCITI O EMBRIONI?OVOCITI O EMBRIONI?CONTROCONTRO

OvocitiOvociti Problemi biologiciProblemi biologici Inevitabilità della ICSIInevitabilità della ICSI Tecnica sperimentaleTecnica sperimentale

EmbrioniEmbrioni Problemi etici e Problemi etici e

legalilegali Embrioni“abbandonEmbrioni“abbandon

ati”ati”

ZIGOTI ZIGOTI

ELEVATA SOPRAVVIVENZA ALLA ELEVATA SOPRAVVIVENZA ALLA CRIOCONSERVAZIONECRIOCONSERVAZIONE

VERIFICA DELLA VITALITA’VERIFICA DELLA VITALITA’ POTENZIALITA’ DI IMPIANTO SIMILE AGLI POTENZIALITA’ DI IMPIANTO SIMILE AGLI

EMBRIONI FRESCHI EMBRIONI FRESCHI

EMBRIONIEMBRIONI

BUONA SOPRAVVIVENZA SE LA MORFOLOGIA E’ OTTIMALE

LIMITATA POSSIBILITA’ DI OSSERVARE LA RIPRESA DELLE DIVISIONI DEI BLASTOMERI

POTENZIALITA’ DI IMPIANTO INFERIORE AGLI EMBRIONI FRESCHI

BLASTOCISTIBLASTOCISTI

SELEZIONE DEGLI EMBRIONI PIU’ VITALI MINOR NUMERO DI CONGELAMENTI MAGGIORE NUMERO DI CELLULE MINORI DIMENSIONI DELLE CELLULE

LE BLASTOCISTI OTTENUTE IN VITRO CON I TERRENI SEQUENZIALI RESISTONO MALE ALLA CRIOCONSERVAZIONE.

Inner cell Inner cell massmass

cavitàcavità

trofoblasttrofoblastoo

Rimangono ancora molti aspetti della Rimangono ancora molti aspetti della criobiologia, soprattutto degli ovociti, che criobiologia, soprattutto degli ovociti, che devono essere chiariti in modo da devono essere chiariti in modo da ottimizzare le tecniche.ottimizzare le tecniche.

La crioconservazione di ovociti non può La crioconservazione di ovociti non può prescindere da altre tecniche quali la ICSI, la prescindere da altre tecniche quali la ICSI, la maturazione in vitro. maturazione in vitro.

In conclusione In conclusione

In conclusione In conclusione

La cosa più importante è comunque porre La cosa più importante è comunque porre

la massima attenzione a che tutte le tappe la massima attenzione a che tutte le tappe

dei procedimenti di congelamento e dei procedimenti di congelamento e

scongelamento siano effettuati con scongelamento siano effettuati con

precisione e soprattutto alle giuste precisione e soprattutto alle giuste

temperature.temperature.