Corso “Le micotossine nella

filiera agro-alimentare”ISS - 14-15 novembre 2007

Aspetti generali e pratici legati alla implementazione della normativa europea sul

campionamento e la preparazione del campione nell’analisi delle micotossine

Carlo Brera

CNQRA - Reparto OGM e Micotossine

Gruppo di lavoro MICOTOSSINE

• Dr.ssa Barbara De Santis

• Dr.ssa Francesca Debegnach

• Dr.ssa Elena Pannunzi

• Dr.ssa Silvia Faleo

• Dr.ssa Emanuela Gregori

• Dr.ssa Elisabetta Prantera

• Dr.ssa Eleonora Palmaccio

• Sig. Floriana Fasano

• Sig. Viviana Renzi

Women at work

Elementi della Gestione del rischio

• Legislazione e Normativa (Limiti massimi, campionamento)

• Attività di controllo/Studi di monitoraggio

• Principio di precauzione

• Piani di sorveglianza

• Costituzione di una banca dati

• Valutazione ed Interpretazione dei dati ottenuti

• Azioni intraprese

Normativa

L’efficacia dei provvedimenti legislativi è data dalla efficacia dei controlli in termini di:

• distribuzione sul territorio

• interpretazione corretta della normativa

• reazioni del mondo produttivo

• organizzazione tra gli Enti preposti al controllo

• Formazione

Necessità di strumenti diagnostici per gli operatori del settore e del

SSN per valutare la conformità dei prodotti alimentari soggetti a

contaminazione

MICOTOSSINARegolamenti che fissavano i limiti di tollerabilità

Aflatossine totali,

aflatossina M1,

ocratossina

Reg. 466/2001

Reg. 123/2005 del 26.1.2005

Reg. 2174/2003 (modifica i Reg. 466/2001 e 257/2002)

Reg. 683/2004

Reg. 2174/2003

Reg. 472/2002

Patulina Reg. 1425/2003 (modifica il Reg. 466/2001)

Fumonisina B1

e B2,

deossinivalenolo,

zearalenone

Reg. 856/2005 (limite in vigore dal 2007)

ESIGENZE:

•ARMONIZZAZIONE

•METODI RAPIDI, ECONOMICI

•AFFIDABILI

•STANDARDIZZATI, VALIDATI

Regolamento CE 1881/2006

del 19 dicembre 2006 che

definisce i tenori massimi di

alcuni contaminanti nei prodotti

alimentari

GUCE L364/2005 del 20.12.2006

QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)

sono necessari per visualizzare quest'immagine.

Regolamento CE/1126/2007 del 28/9/2007 GUCE L255/14

g/kg

The maximum level applies to cereals placed on the market for

first-stage processing.

“First-stage processing” shall mean any physical or thermal

treatment, other than drying, of or on the grain. Cleaning, sorting

and drying procedures are not considered to be “first stage

processing” insofar no physical action is exerted on the grain

kernel itself and the whole grain remains intact after cleaning and

sorting.

2000

400

1000

g/kg

* Il valore deve essere corretto per il recupero e per l’incertezza

quindi il valore immediatamente successivo a 4000 è

4000 ± 1000

I limiti indicati sono da verificare prima della trasformazione

della granella quindi dopo la pulitura o altro sorting fisico

I valori indicati NON si riferiscono alla percentuale

di ingrediente contenuta in un prodotto finito

Ragioniamo insieme

• 4000 (limite di legge) è un valore con 1 cifra significativa.

(4000,0 ne avrebbe invece cinque)

• Per un valore di incertezza pari al 25%

• X – X*0.25 = 4000

• X = 5333

• Quindi il valore soglia max è 5333 μg/kg

• Ma in realtà il valore soglia è 5499 in quanto tale numero

dovrebbe essere espresso come 5000 che è ancora

inferiore a 5333

4,0 mg/kg

Cifre significative

• Regole per gli zeri:

• a) gli zeri compresi tra cifre non nulle sono cifre significative. Es.: 1001

• b) gli zeri che precedono la prima cifra significativa (diversa da zero) non sono cifre significative. Es.: 0.01

• c) Gli zeri finali sono significativi solo se è presente la virgola (o punto decimale). Es.: 10.10; 1000.

• Esempio: tutti i seguenti numeri hanno 4 cifre significative

• 1234; 123400; 123.4; 1001; 10.10; 0.001010; 100.0

Un chiarimento - Farina per polenta

Tipologia Granulometria, µ Uso Limite di

legge

BRAMATA 350 – 850

500 - 850

POLENTA 1400

FIORETTO 250 - 350 DOLCIARIO 2000

FUMETTO < 350 DOLCIARIO 1400

AFLATOSSINA B1 NEI MANGIMI mg/kg

DL 10 maggio 2004 N. 149 – GU n. 139 del 16.06.2004

Tutte le materie prime per mangimi 0.02

Mangimi completi per bovini, ovini e caprini 0.02

- Mangimi completi per animali da latte 0.005

- Mangimi completi per vitelli ed agnelli 0.01

Mangimi completi per suini e pollame non giovani 0.02

Altri mangimi completi 0.01

Mangimi complementari per bovini, ovini e caprini

(ad eccezione dei mangimi complementari per animali da

latte, vitelli ed agnelli)

0.02

Mangimi complementari per suini e pollame (salvo

animali giovani)

0.02

Altri mangimi complementari 0.005

Nota del Ministero della Salute N. 4217 – P – I 8dd/4

• Oggetto: Controllo delle materie prime per mangimi e mangimi da

esse derivanti contenenti Ocratossina A

Materie prime per mangimi Valori guida

Cereali e loro sottoprodotti 0.25 mg/kg (ppm)

Mangimi completi e

complementari

Valori guida

Suini 0.05 mg/kg (ppm)

Polli 0.1 mg/kg (ppm)

Raccomandazione della Commissione del 17 agosto

2006 (2006/583/CE)

sulla prevenzione e sulla riduzione delle Fusarium-

tossine in cereali e prodotti derivati

• Rotazione dei raccolti

• Tipologia di coltivazione (rimozione, distruzione ed interramento dei residui infestati dei raccolti facilita la riduzione dell’inoculo da Fusarium nel raccolto successivo)

• Uso accurato di fungicidi ed erbicidi

• Uso di varietà selezionate (ibridi) resistenti all’attacco degli insetti e delle muffe infestanti

• Utilizzo di appropriate procedure di irrigazione

• Raccolta delle granaglie ad appropriati livelli di umidità ≥22% (MAIS). Ritardare il raccolto può comportare un aumento di contaminazione. Raccogliere ad umidità <22°C costituisce un fattore di rischio di contaminazione da aflatossine.

• Correlazione tra i tempi del raccolto e della essiccazione, (fermentazione in mucchio)

• Procedure di essiccazione improprie che determinano una non omogenea disidratazione dei chicchi

• Limitare i danni meccanici alla granella

• Aw inferiori a 0.65 ed umidità di stoccaggio inferiori a 14% (grano)

http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/aflatoxin_guidance_it.pdf

Cosa cambia

• La necessità di ricorrere anche per i prodotti all’importazione alla revisione di

analisi

• Chiarimento relativo alla strategia da intraprendere nel controllo delle grandi

partite

• Introduce uno schema descrittivo della procedura di campionamento e

formazione delle aliquote

• Viene esteso il campo di applicazione a tutti i prodotti alimentari

Nota del Ministero della Salute

Prot. 19443 – P del 16/5/2006

• Oggetto: Modalità di campionamento dei

mangimi provenienti da paesi terzi.

• Per grosse partite (>1500t) – Adozione del

Regolamento 401/2006? SI

• Nel caso di impossibilità di separare

disicamente le partite – Adozione della

Nota dell’ISS n. 9967/CNRA/Al.22 del

21.3.2006? SI

Nota ISS n. 9967/CNRA/Al22. del

21.3.2006

• Le stive possono essere considerate come sottopartite

• Nel caso di partite non fisicamente separabili si adottano modalità di campionamento statico o dinamico fatta salva la condizione di individuare la sottopartita in fase di controllo

• Numero di CE = 100 + √ Peso della sottopartita in t

• La condizione è che in tutti i casi la sottopartita sia rintracciabile univocamente

Solo alcune telefonate….(ricevute e fatte)

• Sul Regolamento 401 non è indicato come fare le aliquote. Questa informazione era invece presente nel DM 23 dicembre 2000

• Nei verbali non c’è scritto le dimensioni del lotto, la normativa seguita, a volte sono illeggibili

• Nei rapporti di prova non è indicato il metodo di riferimento utilizzato

• Sono state registrate differenze di interpretazione del 401/2006 relativamente alla frutta secca sgusciata. La frutta secca sgusciata e con guscio deve essere campionata secondo il punto D (30 kg) e non C (10 kg)

“La filiera analitica”

Diagnostica

CampionamentoPreparazione del campione Analisi

Prelievo MacinazioneEstrazione

e quantificazione

Premessa

Le micotossine sono distribuite in modo estremamente eterogeneo in

una derrata alimentare. Pertanto la necessità di prelevare un

campione da un lotto in modo rappresentativo richiede molta

attenzione in quanto errate procedure di campionamento hanno un

forte effetto sulla attendibilità in termini di accuratezza delle misure

relative alla valutazione della concentrazione della contaminazione

da micotossine nei prodotti alimentari. Questo aspetto ha dei risvolti

effettivi sia sulle transazioni commerciali con la creazione di barriere

e di dispute legali. Il campionamento è la fase che comporta il

maggior contributo alla varianza totale

UNA RIFLESSIONE…..

Piano di campionamento

(solo uno!!!!)

• TLC

• HPLC

• LC-MS

• GC-MS

• Biosensori

• NIR

• ELISA

• FAST test, Test Cards

• PCR

• e altri ancora….

Perché devo campionare in un certo modo

Dove devo effettuare il campionamento

Quando devo effettuare il campionamento

Come devo effettuare il campionamento

Il primo approccio metodologico per una corretta attuazione delle

procedure di campionamento deve necessariamente partire dalle

seguenti domande

Un campionamento inadeguato vanifica il lavoro e gli

sforzi degli analisti e rende dubbie le conclusioni del

risultato di analisi

CAMPIONAMENTO: PERCHE’

L’attuazione di opportuni piani di campionamento

deve risultare prioritario da parte di tutti gli

operatori del settore

popolazione

campione

Analisi del campione

Estensione del risultato a tutta la popolazione= INFERENZA

campionamento

CAMPIONAMENTO: PERCHE’

Il principale obiettivo di un buon campionamento è quello di

raccogliere dati che consentano di generalizzare all'intera

popolazione i risultati ottenuti dal campione. Questo processo

di generalizzazione è detto «inferenza»

(Estratto da: http://www2.unipr.it/~bottarel/epi/campion/met_cam.htm)

Scegliere un campione da una popolazione significa effettuare un

«campionamento»

Il campionamento introduce sempre un ERRORE

ERRORE DI CAMPIONAMENTO

Raramente in uno studio è possibile esaminare ogni singolo elemento

dell'intera popolazione

• risorse disponibili (economiche, di personale, di laboratori ecc.);

• l'intera popolazione da studiare non è fisicamente raggiungibile o

addirittura non è del tutto nota;

• il numero di individui che compongono la popolazione da studiare è

talmente elevato che lo studio di ognuno di essi è fattibile solo

teoricamente.

Campionamento

Teoria (2)

Il principio generale di un buon campionamento

prevede che ciascuna unità della popolazione abbia

la stessa probabilità di essere scelta. In tal caso il

campione viene detto «randomizzato» o «casuale».

Un campionamento randomizzato offre il vantaggio di

fornire un campione privo di errori sistematici (bias) e

consente di trasferire l'attendibilità dei risultati

forniti dal campione a tutta la popolazione.

Campionamento

Teoria (3)

Distribuzione omogenea delle proteine

12 11 14 12 11 10 13 11

13 11 10 12 13 12 13 11

12 13 10 10 13 12 12 14

14 11 14 12 11 11 13 12

14 12 11 13 13 10 11 11

12 14 12 14 12 10 14 13

13 13 11 11 13 11 14 13

12 11 12 13 12 12 12 12

Distribuzione eterogenea delle micotossine

0 0 0 0 0 0 100 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 80 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 2000 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

LOTTO CAMPIONE

CAMPIONE

Di

LABORATORIO

ANALISI

Errore di

campionamento

Errore di

sottocampionamento

Errore di

analisi

ERRORE TOTALE

Campionamento

Tipi di errore connessi con la filiera analitica

Il campionamento è necessario per le più disparate attività e deve

rispondere alle diverse necessità per cui questo deve essere

applicato

– Attuazione delle attività ufficiali di controllo

– Definizione dei piani di monitoraggio finalizzati

– Surveys

– Valutazione dell’esposizione

– Piani di autocontrollo

CAMPIONAMENTO: quando

• Stive di nave (materiale sfuso o in sacchi)

• Camion

• Container

• Vagoni ferroviari

• Autotreni

• Silos

• Cisterne

• Impianti di lavorazione

• Depositi, magazzini

• Aziende agricole/zootecniche

• Dettaglio (pacchetti)

CAMPIONAMENTO: dove

Campionamento: Come

Definizioni

Modalità di prelievo

Il presupposto è che ogni campione elementare deve avere la

stessa probabilità di essere scelto (campionamento casuale).

•Campionamento statico prelievo in punti

diversi di una massa stoccata con l’ausilio di

opportune sonde

•Campionamento dinamico prelievo a tempi

diversi di una massa in movimento

Le operazioni di campionamento devono essere condotte in

condizioni idonee sia per la sicurezza degli operatori che per

la protezione del campione da contaminazioni esterne

Campionamento statico

• Sili

• Vagoni

• Sacchi

• Confezioni

–

Campionamento dinamico

Più semplice da realizzare

Prelievo di campioni elementari da

nastri trasportatori o da scarico di

camion

Utilizzo di campionatori automatici

Campionamento dinamico

• In base allo schema descritto dal Regolamento si dovranno prelevare campioni incrementali (CI) che saranno successivamente riuniti a formare un unico campione globale da destinare all’analisi.

• Il numero di campioni incrementali dipenderà dalle dimensioni del lotto da testare e saranno prelevati ad intervalli regolari di tempo secondo la formula

• Durata dello scarico (in minuti) /N. di CI

• Secondo la formula citata, per un lotto di 40 q, si dovranno prelevare (ad es. per i cereali) minimo 40 campioni incrementali di 100 grammi ciascuno secondo frequenze di tempo costanti.

• Se ad es. la velocità di scarico fosse di 50 q all’ora, la durata dello scarico di 40q sarebbe di 48 minuti e si dovrebbe prelevare ciascuno dei 40 CI ogni 1,2 minuti (72s).

• I campioni incrementali saranno riuniti a formare un campione globale di 4 kg. Il campione globale sarà omogeneizzato e macinato prima di effettuare l’analisi.

Sviluppo di un piano di campionamento:

• La conoscenza della distribuzione della concentrazionedell’analita (omogenea od eterogenea)

• La conoscenza delle strutture logistiche (campionamentodinamico o statico)

• La conoscenza della natura della matrice da campionare

• La scelta del punto di campionamento (ingrosso, dettaglio,azienda)

• La conoscenza della grandezza del lotto

Campionamento: Fonti di errore

• Basso numero di campioni incrementali

• Scarsa rappresentatività dei punti di

campionamento

• Errata grandezza del campione globale

Tipico schema di un piano di campionamento delle micotossine

• Identificazione della partita o sottopartita

• Valutazione della grandezza della partita o sottopartita

• Calcolo dei CI da prelevare

• Valutazione del tipo di procedura di campionamento da effettuare (statico o dinamico)

• Prelievo dei CI

• Formazione del campione globale (CG) per riunione di tutti i CI

• Omogeneizzazione del CG

• Macinazione del CG

• Formazione delle aliquote (a secco o tramite slurry)

Teoria del campionamento

Coefficiente di variazione associato alle fasi di campionamento,

sotto-campionamento ed analisi nel caso di contaminazione da

micotossine

(aflatossine in noccioline- Whitaker, 2004)

90

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

010 20 30 40 50 60 70 80

Sampling (kg 21,8)

Sub sampling (g 1100)

Analysis (2 aliquots)

Aflatoxin concentration in the lot (p.p.b.)

Co

effi

cien

to

f va

riat

ion

(%)

Varianza

• L’errore totale associato con un PdC, misurato con la varianza, è la somma delle varianze del campionamento, della preparazione del campione e della analisi.

• La varianza del campionamento rappresenta la fonte maggiore di errore poiché la distribuzione della concentrazione in un lotto è tipicamente non normale. Pertanto, più è piccola la grandezza del campione globale maggiore sarà la varianza del campionamento.

Truck containing 20ppb aflatoxin contaminated corn

Sample Size Kernels Variability(estimate) (ppb)

10.0 lbs 30,000 11.6 - 28.4

5.0 lbs 15,000 8.1 - 31.9

2.5 lbs 7,500 3.2 - 38.8

1.0 lbs 3,000 1 - 46.9

• Se la concentrazione delle micotossine, M, in un lotto supera il valore del limite di legge, Mc, allora il lotto dovrebbe essere rifiutato. Se la concentrazione delle micotossine, M, in un lotto è inferiore al valore del limite di legge, Mc, allora il lotto dovrebbe essere accettato.

• A seguito della varianza totale fra I risultati dei campioni, due tipi di errori sono ricorrenti:

– Rischio del venditore: lotti da accettare (lotti con M≤Mc) sono invece rifiutati (Xavg > Mc) – FALSI POSITIVI

– Rischio del consumatore: lotti da rifiutare (lotti con M>Mc) sono invece accettati (Xavg ≤ Mc) – FALSI NEGATIVI

• La probabilità P(M) che un lotto sia accettato quando il

risultato medio del campione, XM è inferiore o uguale al livello

di legge Mc, è generalmente descritto dalla

curva delle caratteristiche operative.

Mc

XM

Critical factors to be defined

before the development of an

OCC:

• Type of commodity

• Lot guideline level, in μg/kg

• Sample size

• Sample preparation model

• Analytical method

Precauzioni da osservare

• Tutte le misure necessarie per assicurare la sicurezza del personale coinvolto, nelle operazioni di campionamento di grandi partite (guanti, maschera per polveri, camice, occhiali, casco)

• Ciascun campione deve essere posto in un contenitore pulito, inerte tale da garantire il mantenimento della integrità durante il trasporto.

Tipico schema di campionamento per le micotossine

• Identificazione della partita o della sottopartita

• Valutazione della grandezza della partita o sottopartita

• Calcolo dei campioni incrementali da prelevare

• Valutazione del tipo di campionamento da effettuare

(statico vs dinamico)

• Prelievo dei campioni incrementali

• Formazione del campione globale combinando tutti I campioni incrementali

• Omogeneizzazione del campione globale

• Macinazione del campione globale

• Formazione delle aliquote (a secco o tramite formazione dello slurry)

REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 DELLA

COMMISSIONE

del 23 febbraio 2006

relativo ai metodi di campionamento e di

analisi per il controllo ufficiale dei tenori di

micotossine nei prodotti alimentari

L 70/12 - Gazzetta ufficiale dell’Unione europea - 9.3.2006

Prodotti alimentari

• Cereali e prodotti derivati (AFs, OTA, FT)

• Frutta secca ed i prodotti derivati (AFs), uva passa e similari

(OTA)

• Fichi secchi, Arachidi, Frutta a guscio (AFs)

• Spezie (AFs)

• Latte e prodotti lattiero-caseari, alimenti per lattanti e di

proseguimento, compresi il latte (AFM1)

• Caffè tostato e prodotti a base di caffè (OTA)

• Succhi di frutta (PAT), compresi i succhi d’uva (OTA) e il sidro

(PAT)

• Vino (OTA), e mosti d’uva (OTA)

• Prodotti solidi a base di mela, succo di mela, prodotti solidi a

base di mela destinati ai lattanti ed alla prima infanzia (PAT)

• Alimenti per bambini, ed alimenti trasformati a base di cereali

destinati ai lattanti ed alla prima infanzia (AFs, OTA, FT, PAT)

REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006

Metodi di campionamento: campo di applicazione

• Anche per i cereali la grandezza del campione

elementare (CE) è di 100 grammi e quella del

campione globale di 10 kg

• Il controllo è diversificato a seconda della

micotossina da ricercare

• Viene introdotto il requisito relativo alla

espressione della incertezza e dei fattori di

recupero

• Viene rivoluzionato il concetto dell’accettabilità

di una partita

REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006

Cosa cambia

REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006

Metodo di campionamento per i cereali e prodotti derivati

LOTTI tra 50t e ≥ 1500t

LOTTI tra ≤0,05t e ≤ 50t

Attenzione!!!

La frutta secca non corrisponde alla

frutta con il guscio

Esempi di frutta secca (dried fruit)

sono le uve, le prugne e le

albicocche secche

Criteri di accettazione di un lotto

Accettazione di una partita o sottopartita

- Per le arachidi, i frutti a guscio, la frotta secca e il granoturco destinati alla selezione o ad altri trattamenti fisici nonché per le spezie:

- accettazione, se il campione globale o la media dei sottocampioni sono conformi al limite massimo, tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero,

- rifiuto, se il campione globale o la media dei sottocampioni superano il limite massimo al di là di un ragionevole dubbio tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero.

- Per le arachidi, i frutti a guscio, la frutta secca e i cereali destinati al consumo umano diretto e i cereali, ad eccezione del granoturco, destinati ad essere selezionati o subire altri trattamenti fisici:

- accettazione, SE NESSUNO DEI CAMPIONI DI LABORATORIO supera il limite massimo, tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero,

- rifiuto, se uno o più dei sottocampioni superano il limite massimo oltre un ragionevole dubbio tenendo conto dell'incertezza di misurazione e della correzione per il recupero,

Regolamento 401/2006/CE

Campioni

incrementali

N=10-100

A

L

I

Q

U

O

T

E

A

L

I

Q

U

O

T

E

A

L

I

Q

U

O

T

E

Campione globale = 30 kg

Campioni di laboratorio

10 kg

Campioni di laboratorio

omogeneizzati e macinati

- 10 kg

Luogo dove avviene il campionamento

Laboratorio

Campione globale = 10 kg

Fichi secchi- Arachidi- Pistachi

Noci del Brasile-frutta a guscio

• individua nel laboratorio il luogo dove formare

le aliquote ufficiali alla presenza dell’Autorità

preposta al prelievo e del delegato della Azienda

• prevede la stesura di due verbali, uno redatto

all’atto del prelievo dei campioni elementari ed

un secondo all’atto della formazione delle

aliquote

REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006

La procedura pertanto ….

• Deve essere compilato un verbale di campionamento scritto in maniera chiara e riportante il numero del lotto del campione, la procedura di campionamento seguita, il riferimento normativo seguito,

• Concordare con il laboratorio il giorno della preparazione del campione per formare le aliquote ( a cura del lab)

• Convocare la ditta

• Assistere alla formazione delle aliquote (omogeneizzazione, macinazione, quartazione)

• Compilare un SECONDO verbale di campionamento recante le informazioni sulle ALIQUOTE formate, il riferimento al primo verbale di campionamento del CG

• Se il peso dei CE è superiore a 100 g o 300 g, il peso

del CG sarà superiore a 10 kg o 30 kg.

• Se il peso di un CE è molto superiore ai 100g o 300g si

apre la confezione e si prelevano 100 g o 300 g.

• Nel caso di CE da 500 g o 1 kg si preleva un numero

inferiore di CE purché il peso del CG sia quello previsto

• Se il peso del CE è inferiore a 100 g o 300 g e la

differenza non è significativa una confezione può

essere considerata come un CE

• Se il peso del CE è di molto inferiore a 100 g o 300 g un

CE sarà formato da più confezioni aventi peso

complessivo di 100 g o 300 g

REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006

Prelevamento al dettaglio

Dettaglio - Modus operandi

a)

1 kg

b)

25 - 50 g

= 1 campione

elementare

CFZ

= 4 aliquote

= 1 CE

Come formare l’aliquota

1.

2.

3. Aliquote

Campioni

elementari (CI)

Aprire e

mescolare i CI

Art. 6, § 3. NORME GENERALI DA SEGUIRE PER IL PRELIEVO DEI CAMPIONI DA

ANALIZZARE

c) Nel caso di sostanze o prodotti non omogenei contenuti in un unico recipiente e

conservati alla rinfusa , se ne prelevano quantità parziali nella parte superiore centrale e

inferiore della massa, l’insieme delle quantità parziali rappresentative della partita

vengono riunite e mescolate per ricavare il campione per l’analisi.

d) Nel caso di sostanze o prodotti non omogenei contenuti in più recipienti, se ne prelevano

quantità parziali da diversi recipienti scelti a caso e rappresentativi della partita; le

quantità parziali prelevate vengono riunite e mescolate per ricavare il campione per

l’analisi.

e) Nel caso di sostanze o prodotti contenuti in confezioni originali chiuse e quando la natura

di tale sostanza o prodotto, e il tipo di controllo analitico da effettuare ne consentano

l’apertura si prelevano a caso, da un numero di confezioni rappresentative della partita,

di sostanza o prodotto dalle quali, riunite e mescolate, si ricava il

campione per l’analisi.

f) Nel caso di sostanze o prodotti contenuti in confezioni originali chiuse e quando la natura

delle sostanze o prodotti, e il tipo di controllo analitico da effettuare non ne consentano

l’apertura si preleva a caso, dalla partita, un numero rappresentativo di confezioni per

formare il campione per l’analisi.

aliquote

DPR 26 marzo 1980, n. 327

Campionamento Mangimi

DM 20 aprile 1978 – GU N. 165 del

15.6.1978

Modalità di prelevamento dei campioni

per il controllo ufficiale degli alimenti

per gli animali.

Campionamento mangimi

DM 20 aprile 1978 – GU N. 165 del 15.6.1978

Campioni elementari

(>4 kg)

Dimensioni del lotto in

t/Campioni globali

Mangimi alla

rinfusa

per lotti < 2,5 t

7

1/1

2-10/2

11-40/3

>40/4

Per lotti > 2,5 t

20 volte il numero di t

del lotto con max 40

Campionamento mangimiDM 20 aprile 1978 – GU N. 165 del 15.6.1978

Dimensioni del

lotto in numero di

confezioni

/Campioni

elementari

Dimensioni del

lotto in numero di

confezioni/

Campioni globali

Mangimi in

confezioni

1-4/Tutte le

confezioni

5-16/4

>16/ numero di

confezioni con

max 40

1-16/1

17-200/2

201-800/3

>800/4

Campioni finali

Da ogni campione globale si

ottengono campioni finali da

destinare all’analisi il cui peso

non deve essere inferiore a 500

grammi

Formazione dei campioni finali.

• Mescolare con cura il campione globale (6.3.A.) o i campioni globali (6.3.B.) per ottenere un campione omogeneo (Se necessario ridurre il campione globale a 2 chilogrammi o a 2 litri (campione ridotto), con l'aiuto eventualmente di un divisore meccanico o con Il metodo della suddivisione in quarti.

• Formare, quindi, quattro campioni finali di massa o di volume approssimativamente uguale e rispondenti ai requisiti quantitativi di cui sub 5.a.4 o 5.B.4. Introdurre ciascun campione in un recipiente idoneo.

Riassumendo con un esempio

• Grandezza del lotto : 80 t (rinfusa)

• Numero di CG : 4

• Numero di CE: 40 (10 per ciascun CG)

• Numero di campioni finali per ciascun CG : 5

• Numero di campioni finali rappresentativi dei 4 CG : 4

Schematicamente

A,A,A,A,A B,B,B,B,B

C,C,C,C,C D,D,D,D,D

A,B,C,D

A,B,C,D

A,B,C,D

A,B,C,D

A,B,C,D

4 kg

Preparazione del campione

L’obiettivo finale della preparazione del campione è quello di ottenere una porzione RAPPRESENTATIVA del campione globale che sarà oggetto di analisi. La

preparazione del campione consiste di tre fasi:

Macinazione o formazione di slurry del campione globale

Omogeneizzazione della porzione di campione macinata

Prelievo di una aliquota test dal campione omogeneizzato e macinato

Fonti di errore sistematico nella fase

della preparazione del campione (1)

Scarsa omogeneizzazione del campione

globale al momento della formazione delle

aliquote

Scarsa omogeneità della granulometria del

campione

Dimensioni delle parti granulari

Inquinamento del campione

50 grammi di mais corrispondono a circa 150 -200 chicchi

Posto che le aliquote provengono da un campionamento correttamente

effettuato

• Applicando una corretta procedura di omogeneizzazione e

macinazione del CG (campione globale), l’aliquota di campione di

50 grammi di chicchi, conterrà un eguale numero di frammenti

rappresentativi di tutti i chicchi del campione globale

• Viceversa in 50 grammi di campione, prelevato dal CG non

macinato (maniera non corretta), sarà contenuto un numero di

frammenti rappresentativi di non più di 150-200 chicchi dell’intero

CG che statisticamente non configura una condizione di

rappresentatività

Fonti di errore sistematico nella fase della preparazione del

campione(2):

•Scarsa omogeneità della granulometria

•Dimensioni delle parti granulari

• Aumentando la grandezza del campione

• Aumentando il grado di macinazione con un conseguente aumento del

numero di particelle per unità di massa

• Omogeneizzando (formazione dello slurry)

• Aumentando la grandezza della aliquota

• Aumentando il numero delle aliquote (VARIANZA ANALITICA)

Fonti di errore sistematico nella fase della preparazione del campione (3):Come ridurre la varianza

La varianza relativa alla PC è associata al numero di particelle per unità di massa

ottenuto dal processo di molitura. La granulometria del campione ridotto dipende

fortemente dal tipo di attrezzatura che si utilizza.

Variabilità /PrecisioneMatrice Numero di

semi per

unità di

peso

Campione

globale

Campione

globale

Grano 30 semiper

grammo

30 kg

900.000

semi

Mais 3 semi

per

grammo

90.000

semi

Arachidi 1 seme

per

grammo

30.000

semi

Varia

bilità

–

Pre

cis

ione

–

Formazione dello “slurry”

• Si utilizza un omogeneizzatore industriale

• Lo “slurry” é formato aggiungendo acqua di

rubinetto al campione non macinato

generalmente con un rapporto che varia da

1:1 (farine, chicchi di mais, mangimi, frutta

secca senza guscio) to 1:2 (frutta secca con

guscio)

Materiale da saggioTempo di

sbucciatura

Rapporto

ponderale

Rapporto nello

slurry

Matrice/acqua

Tempo di

preparazione dello

slurry

Pistacchi

senza guscio60 min per 1 kg

Frutto/guscio

1:0.91:1.3 5 min

Arachidi

Con guscio30 min per 1 kg

Frutto/guscio

1:0.41:2.2 10 min

Arachidi senza

guscio- 1:1.2 5 min

Noci brasiliane 30 min per 1 kgFrutto/guscio

1:1.31:1 5 min

Noci con guscio 30 min per 1 kgFrutto/guscio

1:1.2

1:1.215 min

MAIS - 1:0.8 15 min

Mangimi - 1:1.5 10 min

Noci senza guscio -1:1.2

5 min

Farina di castagne - 1/1 5 min

Macinazione a secco

In alternativa alla formazione dello slurry, la aliquota test può essere macinata a granulometria fine (20 mesh size o 1 mm). Le principali caratteristiche della macinazione a secco devono

essere essenzialmente le seguenti:

• Apertura dei chicchi contaminati e distribuzione delle particelle in tutto il campione, aumentando pertanto la possibilità di rivelareparticelle contaminate

• Aumento della uniformità della contaminazione dell’aliquota permettendo il prelievo del campione da destinare all’analisi con maggiore precisione ed accuratezza

• Favoreggiamento dei processi chimici coinvolti nel processo di estrazione con solventi come conseguenza di una ridotta dimensione delle particelle

Confronto tra slurry e macinazione a secco

SD CV

Slurry Secco Slurry Secco

Mais 1.3 3.8 2.6 7.6

Semi di

cotone

3 9.6 4.5 14.8

Arachidi 2.5 8.5 5.2 20.8

Burro di

arachidi

1.5 2.8 2.8 5.4

Omogeneizzatori e Mulini da laboratorio

SLURRY

• Batch mixers Silverson EX (SILVERSON MACHINES LTD Waterside, Chesham Bucks, England HP5 1PQhttp://www.silverson.com/; sales@silverson.co.uk

• Distribuito dalla CRAMI

Dry grinding

• Romer Labs Inc., MO 63084-1156 - United States of America

• Romer Series II® Mill

• Romer Labs®– RAS® Mill

• Distribuito dalla TECNA

• Retsch ZM 200:

office@romerlabs.com

http:// www.romerlabs.com

Retsch GmbH, 42781 Haan - Germanyhttp://www.retsch.com; info@retsch.com

Distribuito dalla FKV

Espressione del risultato

Regolamento 401/2006 – Allegato II

Calcolo dei fattori di recupero

Calcolo della incertezza

Calcolo dei fattori di recupero

• Il risultato analitico deve essere

riportato corretto o non corretto

per il recupero.

• Il livello di recupero deve essere

riportato.

• Per la valutazione della conformità

sarà usato il risultato analitico

corretto per il recupero

REPORT ON THE RELATIONSHIP BETWEEN ANALYTICAL RESULTS, MEASUREMENT

UNCERTAINTY, RECOVERY FACTORS AND THE PROVISIONS OF EU FOOD AND FEED LEGISLATION,

WITH PARTICULAR REFERENCE TO COMMUNITY LEGISLATION CONCERNING

http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/report-sampling_analysis_2004_en.pdf

Carlo Brera

Istituto Superiore di Sanità

Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i

Rischi Alimentari

Tel. 06-49902367

Fax 06-49902377

E-mail: carlo.brera@iss.it