Elena Pannunzi

Istituto Superiore di Sanità

Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari

Reparto OGM e Xenobiotici di Origine Fungina

METODI DI ANALISI PER LA DETERMINAZIONE DELLE

AFLATOSSINENEGLI ALIMENTI

AFLATOSSINE NUCLEO BIS-FURANO CUMARINICO SERIE B: ANELLO PENTENONICO SERIE G: ANELLO LATTONICO A SEI TERMINI AFM1: METABOLITA OSSIDRILATO DELLA AFB1

SCALA DI TOSSICITÁ: AFB1 >AFM1≥ AFG1>AFB2 >AFG2

ALIMENTI SUSCETTIBILI DI CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE

ARACHIDI, PISTACCHI, FRUTTA SECCASPEZIECEREALI MANGIMIALIMENTI PER L’ INFANZIALATTE E FORMAGGI

Metodi ufficiali AOAC e CEN

Micotossina Matrice Riferimento Metodo

Aflatossine (AFB1 e AFtot)

Cereali, frutta a guscio e prodotti derivati

AOAC - 991.31 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione

fluorimetrica

CEN–EN 12955:1999

Aflatossine (AFB1, AFB2, AFG1,

AFG2)

Mais AOAC-993.16 ELISA

Aflatossina B1 Mangimi

AOAC–2003.02 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione

fluorimetrica

CEN–EN ISO 17375:2006

Aflatossina B1 Baby foods AOAC–2000.16

IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione

fluorimetrica

Micotossina Matrice Riferimento Metodo

Aflatossine (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2)

Burro di arachidi, pasta di pistacchio,

pasta di fichi, paprika

AOAC-999.07 IAC-HPLC con derivatizzazione post colonna e rivelazione

fluorimetrica

CEN–EN 14123:2003

AflatossineNocciole e prodotti

derivatiAOAC–2005.08

HPLC con derivatizzazione fotochimica post

colonna

AflatossineMandorle, arachidi, pistacchi, nocciole

brasilianeAOAC-994.08 Mycosep-HPLC

Aflatossine Burro di arachidi AOAC-991.45 ELISA

Aflatossine Arachidi e mais AOAC-993.17 TLC

Metodi ufficiali AOAC e CEN

Metodi ufficiali AOAC e CEN

Micotossina Matrice Riferimento Metodo

Aflatossina M1

Latte e latte in polvere

AOAC–2000.08 IAC-HPLC con

rivelazione fluorimetricaCEN–EN ISO

14501:1999

Aflatossina M1

Latte e latte in polvere

CEN–EN ISO 14675:2003

ELISA

Aflatossina M1

Latte e formaggio

AOAC-980.21 TLC

VANTAGGI SVANTAGGI

HPLC •Eccellenti performance•Bassi livelli di rivelabilità•Sicurezza per l’operatore

•Costoso•Richiede addestramento dell’operatore•Tempi di analisi

ELISA •Risultati rapidi•Alto numero di campioni•Non richiede attrezzature costose•Semplice da utilizzare dopo un breve training dell’operatore•Fase di automatizzazione

•Possibilità di falsi positivi•Reazioni collaterali•Interferenza della matrice•Precisione meno attendibile rispetto ai metodi di laboratorio jn HPLC

TLC •Permette determinazioni precise (per livelli superiori a 2ng/g)•Costi limitati

•Uso di solventi considerati pericolosi per l’ambiente

MS •Universale•Altamente sensibile e selettiva•Possibilità di determinare diverse micotossine contemporaneamente•Possibilità di ridurre ed eliminare la fase di clean-up

•Costi elevati•Richiede addestramento dell’operatore•Elevati costi di manutenzione

SAGGI ELISA IMMUNO-ENZIMATICI

Preparazione del campione

Saggio immunoenzimatico con kit

Lettura al colorimetro

INTEN

SIT

Á C

OLO

RAZIO

NE

CONCENTRAZIONE TOSSINA

INTEN

SIT

Á C

OLO

RAZIO

NE

CONCENTRAZIONE TOSSINA

SAGGIO DIRETTO

ANTICORPOTOSSINA

ANTICORPO-ENZIMA

SUBSTRATO

CROMOFORO

SUBSTRATO

CROMOFORO

SAGGIO COMPETITIVO

ANTICORPO

ENZIMA CONIUGATO

ALLA TOSSINATOSSINA

KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO

FORNITORE Test Kit Range di

quantificazioneLimite di

rivelabilità Tempo di

incubazione

Aflatossine Totali

1-20ppb 1ppb 20min

4-40ppb 3ppb 20min

Aflatossina M1

5-100ppt 5ppt 130min

Aflatossine Totali

1-20ppb 1ppb 15-20min

Aflatossina M1

5-100ppt 5ppt 120min

Aflatossine Totali

5-40,5ppb 5ppb 60min

1,7-45ppb 1,7ppb 15min

Aflatossina M1

5-80ppt5ppt (latte)

50ppt (form.)60min

250-2000ppt <3670ppt 15min

KIT ELISA QUANTITATIVI IN COMMERCIO

FORNITORE Test Kit Range di

quantificazioneLimite di

rivelabilità Tempo di

incubazione

Aflatossine Totali

2-80ppb (cereali) 2ppb 15min

3-100ppb (cereali) 3ppb 40min

1-16ppb (paprica) 1ppb 50min

-(qualitativo) 5ppb 3min

-(qualitativo

<20ppb o>20ppb

20min

Charm Toxi-Test Transia

Diagnostix Tepne Neogen

Diffchamb Strategic Diagnostics IncInternational Diagnostic

Systems

Elisa-Tek Vicam Idexx

API 4000 Q trap LC-MS/MS

M. Sulyok, F. Berthiller, R. Schuhmacher, R. Krska Rapid Commun. Mass Spectrom.

2006; 20: 2649–2659

DETERMINAZIONE SIMULTANEA LC-ESI-MS/MS DI 39 MICOTOSSINE IN CEREALI SENZA CLEAN-UP

IN GENERALE

GLI STEPS TIPICI PER L’ANALISI DELLE AFLATOSSINE

SONO:

ESTRAZIONE CLEAN-UP RIVELAZIONE

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB1 E TOTALI IN MAIS E MANGIMI

METODO INTERNO VALIDATO

ESTRAZIONE: Pesare 50.0g di campione in blender + 5.0g di NaCl

Estrarre con 250ml MeOH:H2O 80:20 (v:v)

Filtrare su filtro di carta

Prelevare 20ml di filtrato

Diluire con 20ml di PBS*

Filtrare su filtro a microfibra di vetro

Portare a pH 7.4 con HCl (0,1 mol/L) o con NaOH (0,1 mol/L). Portare ad un litro con acqua bibistillata.

*Phosphate Buffered Saline pH=7.4 0.20g di cloruro di potassio0.20g di di-idrogenofosfato di potassio1.16g di idrogeno fosfato disodico anidro8.00g di cloruro di sodio in 900 mL di acqua bidistillata

CLEAN-UP: Colonnine di immuno-affinità (IAC)

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

Condizionare la colonnina di immunoaffinità con 5.0ml di PBS

Passare in IAC 20ml di campione

Lavare la IAC con 10ml di H2O

Eluire con 1000 l + 1000 l di MeOH per HPLC

Portare a volume in matraccio da 5ml con H2O bidistillata

L’estratto viene fatto passare attraverso la

colonnina. La micotossina si lega al sito

specifico dell’anticorpo. Il materiale

estraneo viene eliminato tramite lavaggio

con acqua. Il legame aflatossina-anticorpo

è rimosso mediante eluizione con

opportuno solvente.

CLEAN-UP

VANTAGGI SVANTAGGI

COLONNINE DI IMMUNO AFFINITÀ

(IAC)

Alta selettività accuratezza e sensibilità (anticorpi

specifici)

Costi elevati

Monouso

ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE)

Rapido

Possibilità di analisi multimicotossina

Minore selettività

POST/COLONNA

PBPB Brominazione del doppio

legameDerivatizzatore elettrochimico

Iodurazione del doppio legame

Soluzione sovrasatura di iodio cristallino

Derivatizzazione fotochimica

UV

PRE/COLONNA Acido Trifluoro Acetico (TFA)

Idratazione del doppio legame furanico

RIVELAZIONE: HPLC/FLUORIMETRICA

Le aflatossine B1 e G1 non hanno gruppi che diano elevata fluorescenza naturale alla molecola. È necessaria la formazione di un derivato stabile

Corsa cromatografica senza agente derivatizzante

Corsa cromatografica

con agente derivatizzante

RIVELAZIONE: HPLC/FLUORIMETRICA

PBPBUna soluzione di PBPB 50mg/L èpompata a 0.4ml/min da una pompaesterna nella valvola a T

Una soluzione satura di I2 è pompata a 0,7ml/min in tubo di Teflon a 60°C

DERIVATIZZATOREELETTROCHIMICO

Si fa passare nel derivatizzatore la fase mobilecontenente bromuro di potassio (precursoredell’agente derivatizzante). Si genera bromoELETTROCHIMICAMENTE applicando unpotenziale costante agli elettrodi di lavoro

(pyridine hydrobromide

perbromide) :

I2:

UV: Si irradia il campione mediante lampada UV a 254nm

Formazione dell’emiacetale per addizione di acqua al doppio legame furanicoTFA:

:

POMPA DERIVATIZZANTE

PBPB/I2

T

VALVOLA

A T

UV/DERIV.ELETTROCH.

TFA

FASE MOBILE/

F.M. + KBr

VALVOLA DI

INIEZIONE

POMPA ANALITICA

COLONNA CROMATOGRAFICA

SISTEMI DI DERIVATIZZAZIONE

RIVELATORE

VANTAGGI SVANTAGGI

PBPB•Attendibilità e ripetibilità•T ambiente•Brevi tempi di analisi

•Richiede seconda pompa•Manutenzione e pulizia delle linee•Preparazione della soluzione

DERIVATIZZATORE

ELETTROCHIMICO

•Non è necessaria una seconda pompa•Assenza di agenti derivatizzanti

•Costo per uno strumento dedicato•Manutenzione

I2

•Attendibilità e ripetibilità•Automatizzazione

•Richiede seconda pompa e bagno termostatico•Manutenzione•Preparazione della soluzione di fresco

UV •Non necessita di preparazione di soluzioni•Non è necessaria una seconda pompa

•Aumento dei tempi di ritenzione•Leggera perdita in sensibilità

TFA •Richiede una sola pompa per HPLC

•Pericolosità dell’acido trifluoroacetico•Scarsa ripetibilità

Pesare 50.0g di campione in blender o in beuta da 500ml + 5.0g di NaCl

Estrarre con 200/300ml MeOH:H2O 80:20 (v:v) + 100ml n-esano in blender per 3 min o con agitatore a braccia per 30 min (paprika)

Filtrare su filtro di carta

Prelevare 15ml di filtrato

Diluire con 90ml di PBS (Phosphate Buffered Saline pH=7.4)

Filtrare su filtro a microfibra

Condizionare la colonnina di immunoaffinità (I.A.C.) con 5.0ml di PBS

Passare in IAC 70ml di campione

Lavare la IAC con 15ml di H2O

Eluire con 500 l + 750 l di MeOH per HPLC

Portare a volume in matraccio da 5ml con H2O bidistillata

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFB1, G1, B2, G2

IN BURRO DI ARACHIDI, PASTA DI PISTACCHIO, PASTA DI FICHI, PAPRIKA (CEN–EN 14123:2003)

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE

Fase mobile AcCN : MeOH : H2O 17 : 29 : 54

Flusso: 1 ml/min

Derivatizzazione post colonna con PBPB

Flusso pompa derivatizzante 0.4 ml/min

Vinj= 150 l

Colonna C18 250x4.6 mm 5

La colonna termostatata a 40°C 1°C

Spettrofluorimetro: ecc = 365nm em = 435nm

Cromatogramma maisAFB1≈ 20µg/Kg

Cromatogramma pistacchi AFB1≈ 2µg/Kg

PARAMETRI DEI METODI

Campo di applicazione 0,10 - 20 µg/Kg

Criteri di rendimento per le aflatossine

(REG. (CE) N. 401/2006)

Livello di contaminazione

g/KgRSD(r)% Recupero %

1 40 50-120

1-10 20 70-110

> 10 15 80-120

Calibrazione e linearità 0,10 - 6,60 µg/Kg MAIS0,10 - 4,80 µg/Kg PISTACCHI

0,03 µg/KgLimite di rivelabilità

Limite di quantificazione 0,10 µg/Kg

Recupero (n=10) PISTACCHIAFB1 88%AFB2 93%AFG1 92%AFG2 93%

MAISAFB1 87%AFB2 91%AFG1 90%AFG2 70%

Incertezza espansa0,76 µg/Kg

(AFB1 liv. 1,58 µg/Kg)

FATTORE DI RECUPERO

BIANCO SPIKE

PROCEDURA ANALITICA

Contaminazione

spike

Livello di contaminazione

X 100

Contaminazione

bianco

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1 IN LATTE E LATTE IN POLVERE

(CEN–EN ISO 14501:1999)

Latte in polvere: ricostituire 15g con 75 ml di acqua a 50°C

Latte: preriscaldare il campione a 37°C

Centrifugare per 15 min a 10000rpm

Eliminare lo strato superiore di grasso

Filtrare e raccogliere 50 ml

CLEAN-UP:

Passare in IAC 50 ml di filtrato

Lavare la IAC con 15 ml di H2O

Eluire con 1000 l + 1000 l di AcCN per HPLC

Portare a secco

Riprendere con 1 ml di AcCN:H2O 90:10 (v/v)

ESTRAZIONE:Pesare 10.0g di campione in blender + 5g di celite

Estrarre con 80ml di CH2Cl2 Lavare con 40ml di CH2Cl2 Filtrare su filtro di carta

Evaporare il filtrato al Rotavapor

Sciogliere con 1ml di MeOH, 30ml H2O, 50ml n-esano

Trasferire in imbuto separatore

Recuperare la fase acquosa sottostante

Lavare la fase organica 2 volte con 10ml H2O e riunire le fasi

acquose

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1

NEL FORMAGGIO

CLEAN-UP: Passare in IAC un volume noto di fase acquosa

Lavare la IAC con 15ml di H2O

Eluire con 500 l + 500 l + 500 l di AcCN per HPLC

Portare a secco

Riprendere con 500 l di AcCN:H2O 90:10 (v/v)

ESTRAZIONE:

Pesare 5.0g di campione in beuta

Estrarre con 50ml di soluzione di pepsina allo 0,2% in HCl

0,1N

Porre in stufa o bagno ad acqua a 42°C per tutta la notte

(16 ore) sotto continua agitazione

Centrifugare a 10000 rpm per 10 min

Eliminare il grasso

Filtrare su filtro di carta a pieghe

Neutralizzare con NaOH 5N

METODO ENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE DI AFM1 NEL FORMAGGIO*

CLEAN-UP:

Passare in IAC un volume noto di filtrato

Lavare la IAC con 5ml di H2O

Eluire con 1000 l + 1000 l di MeOH per HPLC

Portare a secco

Riprendere con 1000 l di AcCN:H2O 25:75 (v/v)

*UNIVERSITÁ CATTOLICA DEL S. CUORE DI PIACENZAA. PIETRI, T. BERTUZZI, P. FORTUNATI, G. PIVA

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE

Fase mobile AcCN : H2O 25 : 85

Flusso: 1 ml/min

Vinj= 150 l

Colonna C18 150x4.6 mm 5

La colonna termostatata a 40°C 1°C

Spettrofluorimetro: ecc = 360nm em = 435nm

Cromatogramma di un campione di latte ≈ 50ng/L

Cromatogramma di un campione di formaggio ≈ 300ng/Kg

PARAMETRI DEI METODI

Campo di applicazione

Calibrazione e linearità

LATTE 7 - 200 ng/LFORMAGGIO 100 – 2000ng/Kg

LATTE 10 – 160 ng/LFORMAGGIO 70 – 1600 ng/Kg

LATTE 3 ng/LFORMAGGIO 30ng/Kg

Limite di rivelabilità

Limite di quantificazioneLATTE 7 ng/L

FORMAGGIO 100 ng/Kg

Recupero (n=10) AFM1

Criteri di rendimento per la Aflatossina M1

(REG. (CE) N. 401/2006)

Livello di contaminazione (ng/Kg)

Recupero %

10-50 60-120

> 50 70-110

LATTE: 89%

FORMAGGIO: 88%

PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI DI RIFERIMENTO

Il titolo esatto di tale soluzione è determinato mediante lettura allo spettrofotometro UV

..100

max CCd

MA

ρ= concentrazione delle aflatossine in μg/mlAmax= assorbanza alla lunghezza d’onda di massimo assorbimentoM= peso molecolare dell’aflatossinaε = coefficiente di estinzione molare dell’ aflatossinad= cammino ottico in centimetriC.C. = fattore di correzione

Le soluzioni di riferimento di lavoro si preparano portando a secco sotto flusso di azoto una quantità nota di soluzione di riferimento a

titolo noto e riprendendo con opportuno solvente

PER DILUIZIONE DI UNA SOLUZIONE DI RIFERIMENTOCERTIFICATA PORTANDO A VOLUME NOTO UNA QUANTITÁ NOTA DI POLVERE CON TOLUENE: ACETONITRILE 90:10 PER AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 E CON CLOROFORMIO PER AFM1

INIEZIONI DI 5 LIVELLI DI STD DI

AFLATOSSINA B1, B2, G1, G2

INIEZIONI DI 5 LIVELLI DI STD DI AFLATOSSINA M1

CURVA DI CALIBRAZIONE AFB1

Livello μg/Kg (MAIS)μg/Kg

(PISTACCHI)

1 0.10 0,10

2 1,10 0.80

3 2,10 1.60

4 5,50 4.00

5 6,60 4.80

Numero minimo di

punti dalle norme

ISO: 5

Coefficiente di correlazioner2 = 0,999

Coefficiente di correlazioner2 = 0,999

CURVA DI CALIBRAZIONE M1 LATTE - FORMAGGIO

Livello ng/L (LATTE) ng/Kg(FORMAGGIO)

1 7 70

2 20 170

3 30 340

4 90 900

5 160 1600

MASSIMO FATTORE DI CONVERSIONE

LATTE FORMAGGIO = 9

PROCEDURA DI DECONTAMINAZIONERif. JAOAC Vol.48, 681 (1965)

American Ind.Hyg.Assoc.J., 42, 398 (1981)

IARC Sci.Publ. N. 37 (1980)

La vetreria, il materiale monouso e qualsiasi utensile sia stato acontatto con matrici alimentari possibilmente contaminate o constandard, DEVE essere decontaminato con una soluzione di IPOCLORITOdi SODIO allo 1% PER TUTTA LA NOTTE.

Gocce accidentali sulle mani o parti del corpo devono essere trattatecon la stessa soluzione di ipoclorito di sodio 1% per 10’, successivamentetrattate con una soluzione acquosa di acetone al 5%, infine sciacquatecon abbondante acqua.

I quantitativi di matrici alimentari superiori ai 2 Kg (p.e. slurry),vengono decontaminati nella stessa maniera (2L almeno di soluzioneNaClO 1%);in più per facilitare il successivo smaltimento si aggiunge unaquantità di segatura sufficiente per assorbire il liquido.

CONFERMA DELL’IDENTITÀ DELL’AFLATOSSINA B1

Spettro di assorbimento

della AFB1

Spettro di emissione della AFB1