La PROTEOMICAPROTEOMICA studia tutti i complementi proteici, i proteomi, che derivano dai vari tessuti o tipi cellulari.

Al giorno d’oggi, la proteomica può essere divisa in proteomica classica (sistematica e differenziale) e proteomicaproteomica funzionalefunzionale.

La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei proteomi completi

mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine

Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto?Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto?

Come appare una particolare proteina?Come appare una particolare proteina?(struttura, (struttura, modificazionimodificazioni……))

Con quali altre proteine interagisce la mia Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse?proteina di interesse?(network, (network, interazioniinterazioni…….) .)

CaratterizzazioneCaratterizzazione dei dei complessicomplessi ::

Natura delle molecole presenti nei complessi

Stabilità, cinetica di formazione-dissociazione dei complessi,

Proprietà funzionali dei complessi

Interazioni proteiche dirette e indirette all’interno dei complessi

variazione della loro composizione

Lo studio dellLo studio dell’’INTERACTOMAINTERACTOMA

Conoscere i DETTAGLI delle interazioni all’interno di networknetwork e dellaloro DINAMICADINAMICA::

- Stabilire QUALI proteine interagiscono

- Stabilire COME varia la composizione dei complessi proteici in funzionedelle condizioni (Es. Risposta a specifici segnali cellulari)

- Confermare l’esistenza di proteine che non sono state predette e attribuire loro un “ruolo potenziale”.

- Stabilire i siti molecolari di interazione

- Determinare i parametri cinetici di interazione

TecnicheTecniche di di determinazionedeterminazione direttadiretta delle delle interazioniinterazioni::

- analisi in vitro : es. coes. co--purificazionepurificazione / / spettrometriaspettrometria di massadi massa(gel(gel--filtrazionefiltrazione, , ultracentrifugazioneultracentrifugazione, , coimmunprecipitazionecoimmunprecipitazione……))

- analisi in vivo : es. es. TwoTwo HybridHybrid System, FRETSystem, FRET……

TecnicheTecniche per la per la caratterizzazionecaratterizzazione delle delle interazioniinterazioni::

- protein-array- spettrofluorimetria- spettrofotometria- …….

ANALISI DELLE INTERAZIONI PROTEINAANALISI DELLE INTERAZIONI PROTEINA--PROTEINAPROTEINA

ANALISI ANALISI IN VITROIN VITRO DELLE INTERAZIONI DELLE INTERAZIONI PROTEINAPROTEINA--PROTEINAPROTEINA

CoCo--ImmunoprecipitazioneImmunoprecipitazione::L’anticorpo diretto verso la proteina di interesse viene aggiunto a lisati cellulari. Gli immunocomplessivengono isolati mediante aggiunta di proteina-A immobilizzata su resina. L’ANALISI DEGLI IMMUNOPRECIPITATI viene di solito effettuata mediante SDS-PAGE seguita da immunorivelazionispecifiche o mediante 2D-E seguita da colorazione delle proteine totali.

Maria Monti, Stefania Orru` , Daniela Pagnozzi, and Piero PucciInteraction Proteomics; Bioscience Reports, Vol. 25, Nos. 1/2, February/April 2005

PullPull--DownDown AssayAssay::la proteina di interesse viene usata come “esca” per catturare eventuali partner fisiologici. Di solito la “proteina esca” viene prodotta come proteina di fusione ricombinante. Essa viene fatta interagire in vitro con un lisato cellulare. Gli eventuali complessi formatisi vengono purificati per affinità.

Maria Monti, Stefania Orru` , Daniela Pagnozzi, and Piero PucciInteraction Proteomics; Bioscience Reports, Vol. 25, Nos. 1/2, February/April 2005

TapTap--TagTag AssayAssay

•Le cellule (procariotiche o eucariotiche) possono essere trasfettate sia transientemente che stabilmente.

•Non si dovrebbe mai avere OVERESPRESSIONE.

•Le interazioni si stabiliscono “in vivo”

•Il sistema TAP-tag è stato messo a punto per l’isolamento di complessi espressi a “livelli naturali”.

La proteina di interesse (esca) viene fatta esprimereviene fatta esprimere con una doppia specifica marcatura (tag): CBP (Calmodulin Binding Peptide) e Proteina A (IgG binding domains of Staphylococcus aureus-Protein A). Tra le regioni codificanti per i due “tag” è inserito un sito di idrolisi specifico per la Proteasi del Virus del Tabacco (TEV). I complessi proteici sono isolati mediante due processi cromatografici di affinità.

Variazioni rispetto alla strategia originale: possibilità di introdurre i Tag sia all’N che al C-terminaledella proteina esca e nuovi tipi di Tag.

CROSSLINKINGCROSSLINKING

Il Il cross cross linkinglinking chimico chimico ““fissafissa”” complessi complessi multimolecolarimultimolecolari, creando legami , creando legami

covalenti covalenti ⇒⇒ purificazione, arricchimento specifico e analisi.purificazione, arricchimento specifico e analisi.

Può essere effettuato sia Può essere effettuato sia in vivoin vivo che che in vitroin vitro..

Non dNon dàà informazioni sulla forza delle interazioni.informazioni sulla forza delle interazioni.

Una volta identificati i Una volta identificati i ““partnerspartners molecolarimolecolari””, permette la , permette la ““mappaturamappatura”” dei dei

siti (amminoacidi) di interazione.siti (amminoacidi) di interazione.

Situazione Situazione ““idealeideale””::

COMPLESSI BIMOLECOLARI COMPLESSI BIMOLECOLARI

GRUPPI FUNZIONALI DELLE PROTEINEGRUPPI FUNZIONALI DELLE PROTEINE

• Ammine Primarie (–NH2): N-terminali e catena laterale delle lisine (Lys, K) (gruppo

epsilon-amminico). Gruppi carichi positivamente in condizioni fisiologiche; solitamente

esposti sulla superficie esterna della proteina.

• Carbossili (–COOH): C-terminali e catene laterali di aspartato (Asp, D) e glutammato

(Glu, E). Solitamente esposti sulla superficie esterna della proteina e quindi accessibili per

la coniugazione senza dover denaturare la proteina.

• Sulfidrili (–SH): catena laterale della cisteina (Cys, C). Spesso formano ponti disolfuro

(–S–S–). Necessario effettuare la riduzione prima del crosslinking.

• Carbonili (–CHO): gruppi aldeidici e chetonici; possono essere creati nelle

glicoproteine ossidando gli zuccheri con meta-periodate.

IsocyanateHydroxyl (non-aqueous)

Diazirine (Photo-reactive)Aryl Azide (Photo-reactive)Any Group (Nonselective)

HydrazideAldehyde (Carbonyls)i.e., oxidized carbohydrates

MaleimideHaloacetyl (Bromo- or Iodo-)PyridyldisulfideVinyl sulfone

Sulfhydryl

NHS esterImidoesterPFP esterHydroxymethyl phosphine

Amine

Carbodiimide (e.g., EDC)Carboxyl (directly to amine)

Reactive GroupFunctional Group Target

Protein Protein crosslinkercrosslinker reactive groupsreactive groups

CARBODIIMIDI (EDC E DCC)

Carbodiimidi usate come crosslinker sono:EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochlorideDCC: Dicyclohexylcarbodiimide

EDC è uno ““zerozero--lenghtlenghtcrosslinkercrosslinker”:attiva il gruppo carbossilico permettendone il legame con un gruppo amminico.

Usato in procedure di immobilizzazione (es. attacco di proteine/peptidi a superfici carbossilate) o nella preparazione di immunogeni(es. attacco di un piccolo peptide a una proteina carrierdi grosse dimensioni).

ESTERI N-IDROSSISUCCINIMMIDI (NHS-estere)

La reazione avviene in condizioni debolmente alcaline e genera legami ammidici.

IMMIDOESTERI

La reazione avviene in condizioni alcaline e genera legami ammidinici.Legame reversibile a pH elevato.

MALEIMMIDE

Il crosslinking che sfrutta la presenza dei gruppi sulfidrilici è una delle procedure

più usate.

Le cisteine non sono mai “troppo numerose”.

Processo selettivo e preciso.

I gruppi sulfidrilici possono essere generati (es. per riduzione; aggiunta di

cisteammina su gruppi fosfato o etanditiolo su doppi legami…).

Il tioetere che si forma è stabile ed irreversibile.

La combinazione di gruppi reattivi verso gli –SH e di gruppi reattivi verso gli –NH2

è tipica dei reattivi eterobifunzionali più usati.

IDRAZIDI

Le idrazidi reagiscono anche con le ammine, ma la reazione è più lenta.I gruppi carbonilici nelle proteine non esistono, ma possono essere creati (es. carboidrati)

ARIL AZIDI

I reattivi fotochimici sono inerti; vengono resi reattivi se esposti a luce visibile oultravioletto.Le arilazidi sonostati i primi gruppi foto-reattivi usati per il cross-linking delle proteine.Gli agenti riducenti impediscono la fotoattivazione.

PhotoactivatablePhotoactivatable CrossCross--linkinglinking

Tris(2,2Tris(2,2’’--bipyridyl)bipyridyl)--ruthenium (II) + APSruthenium (II) + APSPersolfato dPersolfato d’’ammonioammonio

• Rapido (10 - 30 s)

• Alta efficienza

• Radiazione visibile (> 400 nm)

• Non introduce “gruppi chimici”(zero-lenhgt)• Coinvolge residui di Tirosina

Il cross linking può essere effettuato usando sostanze attivate dalla luce.

Processo più controllabile

Tempi di reazione più rapidi

ESEMPIO:ESEMPIO:

Meccanismo proposto per la reazione di Meccanismo proposto per la reazione di photocrossphotocross--linkinglinking con con Tris(2,2Tris(2,2’’--bipyridyl)bipyridyl)--ruthenium (II)ruthenium (II)

2 identici gruppi reattivi separati da un “braccio spaziatore”.

Di solito: reazioni one-step e random.

Esempio: aggiungendo un crosslinker ammina-vs-ammina ad un lisato

cellulare si otterrà la coniugazione di tutte le proteine o peptidi le cui

lisine si troveranno ad una distanza utile.

Questo metodo è utile per capire la possibilità di associazione fra più

molecole e non permette di selezionare le molecole da analizzare.

REATTIVI OMOBIFUNZIONALI

2 gruppi reattivi diversi alle loro estremità.

Le reazioni possono essere sia coniugazioni a singolo-step, che coniugazioni

sequenziali (two-step).

Processi di polimerizzazione e self-conjugation sono minimizzati.

Nelle procedure sequenziali:

1- reagisce il gruppo del crosslinker più labile;

2- si rimuove l’eccesso di crosslinker che non ha

reagito;

3- la soluzione con la proteina modificata viene

aggiunta ad una soluzione contenente la seconda proteina,

che reagisce con il secondo gruppo reattivo.

REATTIVI ETEROBIFUNZIONALI

SCELTA DEI CROSSLINKER

SPECIFICITÁ CHIMICA: con quale/i gruppo/i funzionalereagisce?

CARATTERISTICHE DEL “BRACCIO SPAZIATORE”: ilcrosslinker è sufficientemente lungo da connettere le due molecole? Il legame può essere reversibile? Il legame può essere rotto?

SOLUBILITÁ IN ACQUA E PERMEABILITÁ DELLE MEMBRANE CELLULARI: il reattivo può entrare nella cellula? Il reattivo può determinare crosslink delle proteine idrofobiche di membrana?

REATTIVITÁ SPONTANEA O FOTOINDOTTA: la reazioneavviene spontaneamente e rapidamente o deve essere attivata in un momento preciso?

FONDAMENTALE:

Preservare la struttura nativa delle proteine e dei complessi;

Non eccedere con il reattivo. Il rapporto molare, crosslinker-vs-proteina,

ottimale dovrebbe essere sempre determinato empiricamente;

Poter controllare il grado di coniugazione (es. basso se è necessario preservare

l’attvità biologica della proteina);

Considerare sempre i gruppi funzionali presenti sulla superficie della proteina.

Se questi sono molti, è necessario usare un basso rapporto crosslinker-vs-proteina,

viceversa se sono pochi.

Limitarsi all’analisi di complessi con pochi interagenti (situazione ideale: 2).

Michael A. Trakselis, Stephen C. Alley, and Faoud T. Ishmael; Identification and Mapping of Protein-Protein Interactions by a Combination of Cross-Linking, Cleavage, and Proteomics; Bioconjugate Chem.; 2005; 16(4): 741 - 750

TIPI DI CROSSTIPI DI CROSS--LINKER DISPONIBILI COMMERCIALMENTELINKER DISPONIBILI COMMERCIALMENTE

I più comuni cross-linker formano legami fra:Lisina/LisinaLisina/AspartatoLisina/GlutammatoLisina/CisteinaCisteina/Cisteina

Il Il crosscross--linkinglinking può essere effettuato può essere effettuato anche per inserire dei TAG di anche per inserire dei TAG di affinitaffinitàà, , cromoforicromofori o o fluoroforifluorofori……..

Il Il crosscross--linkinglinking può anche NON può anche NON INTRODURRE gruppi chimiciINTRODURRE gruppi chimici

Michael A. Trakselis, Stephen C. Alley, and Faoud T. Ishmael; Identification and Mapping of Protein-Protein Interactions by a Combination of Cross-Linking, Cleavage, and Proteomics; Bioconjugate Chem.; 2005; 16(4): 741 - 750

STRATEGIA GENERALESTRATEGIA GENERALE

Blue native electrophoresis for isolation of membrane Blue native electrophoresis for isolation of membrane

protein complexes in protein complexes in enzymaticallyenzymatically active form.active form.SchaggerSchagger H, von H, von JagowJagow G., G., AnalAnal BiochemBiochem.. 1991 1991 DecDec;199(2):223;199(2):223--31. 31.

LA LA BLUE NATIVE ELECTROPHORESISBLUE NATIVE ELECTROPHORESIS èè una tecnica una tecnica

sviluppata per lsviluppata per l’’analisi dei analisi dei complessi proteicicomplessi proteici che formano la che formano la

catena respiratoria di trasferimento elettronico di vari catena respiratoria di trasferimento elettronico di vari

organismi.organismi.

VANTAGGI RISPETTO AD ALTRE TECNICHE VANTAGGI RISPETTO AD ALTRE TECNICHE

SEPARATIVE DI COMPLESSI MULTIPROTEICI:SEPARATIVE DI COMPLESSI MULTIPROTEICI:

Non introduce TAG o ANTICORPI che potrebbero influenzare Non introduce TAG o ANTICORPI che potrebbero influenzare

le interazioni proteina/le interazioni proteina/proteinaproteina..

I complessi possono anche essere analizzati in un unico I complessi possono anche essere analizzati in un unico

immunoblotimmunoblot..

Fornisce informazioni rapide su: Fornisce informazioni rapide su: numeronumero, , ampiezzaampiezza, ,

composizionecomposizione e e abbondanza relativaabbondanza relativa delle singole delle singole subunitsubunitàà

presenti nei complessi.presenti nei complessi.

Circa il 20Circa il 20--30% delle proteine cellulari sono proteine integrali di membrana30% delle proteine cellulari sono proteine integrali di membrana, e , e molte proteine solubili sono associate ad esse.molte proteine solubili sono associate ad esse.

LL’’analisi biochimica di proteine integrali di membrana richiede dianalisi biochimica di proteine integrali di membrana richiede di solito solito ll’’estrazione con detergenti e denaturanti che estrazione con detergenti e denaturanti che solubilizzinosolubilizzino efficientemente le efficientemente le proteine proteine idrofobicheidrofobiche ““distruzionedistruzione”” delle interazioni proteinadelle interazioni proteina--proteina e possibile perdita dellproteina e possibile perdita dell’’attivitattivitàà enzimatica.enzimatica.

La La ““native native isoelectricisoelectric focusingfocusing”” non non èè adatta alladatta all’’analisi delle proteine analisi delle proteine idrofobicheidrofobiche, che tendono a diventare insolubili a , che tendono a diventare insolubili a pHpH vicini al loro vicini al loro pIpI e a e a precipitare al polo basico.precipitare al polo basico.

Il Il crosscross--linkinglinking chimico talvolta impedisce lchimico talvolta impedisce l’’identificazione corretta di tutte le identificazione corretta di tutte le proteine presenti in un complesso; complessi proteine presenti in un complesso; complessi multimulti--proteiciproteici (a molte componenti) (a molte componenti) possono generare segnali difficilmente possono generare segnali difficilmente interpretabiliinterpretabili……....

Tecnica ideata per lTecnica ideata per l’’analisi di analisi di ““complessi proteici di membranacomplessi proteici di membrana””

LL’’analisi analisi elettroforeticaelettroforetica BLUE NATIVE permette la separazione ad BLUE NATIVE permette la separazione ad alta risoluzione di complessi alta risoluzione di complessi multiproteicimultiproteici, in condizioni native:, in condizioni native:

richiede detergenti richiede detergenti non forti e non ionicinon forti e non ionici, come , come il il TritonTriton XX--100, 100, il il ββ--DD--dodecilmaltosidedodecilmaltoside (DDM), e la (DDM), e la digitoninadigitonina……

èè possibile solo in possibile solo in condizioni non denaturanticondizioni non denaturanti (in contrasto con le tecniche (in contrasto con le tecniche ““classicheclassiche””, quali SDS, quali SDS--PAGE e IEF). PAGE e IEF).

Applicabile solo a materiale purificato.Applicabile solo a materiale purificato.

Risoluzione superiore a quella di altre tecniche quali gelRisoluzione superiore a quella di altre tecniche quali gel--filtrazione o filtrazione o ultracentrifugazione su gradiente.ultracentrifugazione su gradiente.

DETERGENTI USATI PER LA PREPARAZIONE DI CAMPIONI DETERGENTI USATI PER LA PREPARAZIONE DI CAMPIONI DA SOTTOPORRE A BNDA SOTTOPORRE A BN--PAGEPAGE

Le cariche negative vengono attaccate ai complessi Le cariche negative vengono attaccate ai complessi

proteici proteici solubilizzatisolubilizzati, dal legame con il colorante, dal legame con il colorante

CoomassieCoomassie Blue G250Blue G250::

•• Il Il CoomassieCoomassie non agiscenon agisce come un detergente come un detergente e e preservapreserva la struttura dei complessi la struttura dei complessi multiproteicimultiproteici..

•• Il legame del Il legame del CoomassieCoomassie avviene piuttosto avviene piuttosto uniformemente nel caso di proteine di uniformemente nel caso di proteine di membrana (membrana (CoomassieCoomassie:proteina (W:W), 1:1).:proteina (W:W), 1:1).

•• I complessi proteici (e le singole proteine) I complessi proteici (e le singole proteine) migrano allmigrano all’’anodo per lanodo per l’’eccesso di carica eccesso di carica negativa e vengono separate in base alla massa negativa e vengono separate in base alla massa molecolare apparente.molecolare apparente.

La ragione per cui la BNLa ragione per cui la BN--PAGE PAGE èè stata pistata piùù comunemente usata per lcomunemente usata per l’’analisi di analisi di

complessi proteici respiratori e complessi proteici respiratori e fotosinteticifotosintetici èè la loro abbondanza nel la loro abbondanza nel proteomaproteoma

di mitocondri e cloroplasti. di mitocondri e cloroplasti.

LL’’utilizzo della tecnica BN per altri tipi di campioni può richiedutilizzo della tecnica BN per altri tipi di campioni può richiedere un ere un prepre--

trattamentotrattamento per lper l’’arricchimentoarricchimento del complesso proteico di interesse.del complesso proteico di interesse.

La BNLa BN--PAGE non PAGE non èè stata usata con successo per lstata usata con successo per l’’analisi di analisi di complessi proteici complessi proteici

solubilisolubili, nonostante essi siano in teoria meno problematici da analizzar, nonostante essi siano in teoria meno problematici da analizzare dei e dei

complessi proteici di membrana.complessi proteici di membrana.

Spesso si possono verificare problemi di allargamento e/o restriSpesso si possono verificare problemi di allargamento e/o restringimento ngimento

delldell’’ampiezza delle bande nel gel, dovuti in parte ad una inappropriaampiezza delle bande nel gel, dovuti in parte ad una inappropriata ta

concentrazione di sali.concentrazione di sali.

LA MOBILITALA MOBILITA’’ ELETTROFORETICA ELETTROFORETICA èè DETERMINATA DALLA CARICA DETERMINATA DALLA CARICA

NEGATIVA DATA DAL LEGAME CON IL NEGATIVA DATA DAL LEGAME CON IL COOMASSIE BLUE GCOOMASSIE BLUE G--250250 E E

DALLDALL’’AMPIEZZA E DALLA FORMA DEI COMPLESSI MULTIPROTEICI.AMPIEZZA E DALLA FORMA DEI COMPLESSI MULTIPROTEICI.

Per Per solubilizzaresolubilizzare complessi proteici intatti, evitando la complessi proteici intatti, evitando la denaturazionedenaturazione delle delle proteine proteine èè necessario usare:necessario usare:

detergenti blandi non ionici come DDM, detergenti blandi non ionici come DDM, digitoninadigitonina, , TritonTriton XX--100;100;

sali di bassa forza ionica, come acido sali di bassa forza ionica, come acido aminocaproicoaminocaproico o acetato di potassio.o acetato di potassio.

Per ragioni sconosciute NON EPer ragioni sconosciute NON E’’ POSSIBILE SEPARARE COMPLESSI DA POSSIBILE SEPARARE COMPLESSI DA

LISATI CELLULARI TOTALI, anche se:LISATI CELLULARI TOTALI, anche se:

PARZIALE PURIFICAZIONE E/O DIALISIPARZIALE PURIFICAZIONE E/O DIALISI

QUINDI:QUINDI:

Camacho-Carvajal, M. M. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: 176-182

2D BN/SDS-PAGE

from WCL:

PROTEIN COMPLEX

“FOOTPRINT”

Per lPer l’’analisi BN di complessi proteici analisi BN di complessi proteici citoplasmaticicitoplasmatici sembra essere sembra essere necessario rimuovere necessario rimuovere ““una sostanza di passo peso molecolareuna sostanza di passo peso molecolare”” mediante mediante

DIALISIDIALISI..

estremità catodica

estremità anodica

Di solito vengono usati Di solito vengono usati gel di gel di acrilamideacrilamide in in

gradiente:gradiente:55--14%/ 514%/ 5--17%17%

1% SDS1% β-mercaptoetanolo

Nel caso piNel caso piùù comune, alla BNcomune, alla BN--PAGE PAGE èè abbinata una SDSabbinata una SDS--PAGEPAGE

Per una BNPer una BN--SDS PAGE, la striscia del gel BN deve essere SDS PAGE, la striscia del gel BN deve essere incubata prima della seconda dimensione in un tampone incubata prima della seconda dimensione in un tampone

contenente contenente SDS e 2SDS e 2--mercaptoetanolo (o mercaptoetanolo (o DTTDTT……));;

questo passaggio assicura una questo passaggio assicura una completa completa denaturazionedenaturazionedei complessi proteici necessaria per una successiva dei complessi proteici necessaria per una successiva

separazione delle loro separazione delle loro subunitsubunitàà. .

In una BN/SDSIn una BN/SDS--PAGE le proteine PAGE le proteine monomerichemonomeriche migrano migrano allall’’interno di una parabola iperbolica, mentre i complessi interno di una parabola iperbolica, mentre i complessi multiproteicimultiproteici (MPC) ne (MPC) ne rimarannorimaranno al di sotto.al di sotto.Dopo la seconda dimensione le proteine appartenenti ad uno Dopo la seconda dimensione le proteine appartenenti ad uno stesso complesso stesso complesso multiproteicomultiproteico, si separeranno in colonne , si separeranno in colonne verticaliverticali

Visualization of MPCs on a 2D WCL BN/SDS gel and identification of MPC components by MS

Quando i campioni vengono Quando i campioni vengono prepre--trattatitrattati con SDS, si ha la scissione dei complessi con SDS, si ha la scissione dei complessi nelle singole unitnelle singole unitàà monomerichemonomeriche. L. L’’analisi bidimensionale BNanalisi bidimensionale BN--PAGE/SDSPAGE/SDS--PAGE (B) PAGE (B) mostrermostreràà una localizzazione a forma di una localizzazione a forma di ““diagonale iperbolicadiagonale iperbolica””..Senza Senza prepre--trattamentotrattamento avremo una visualizzazione degli spot in colonne verticali (A).avremo una visualizzazione degli spot in colonne verticali (A).

BN/SDS PAGE BN/BN PAGE

COMBINA O L’USO DI DETERGENTI DIVERSI O ALTRI TRATTAMENTI DEBOLMENTE DENATURANTI QUALI TEMPERATURE ELEVATE, VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE SALINA, RIDUCENTI…..

BN/IEF-SDS PAGE

L’identificazione delle singole proteine presenti nei complessi, può essere

effettuata o mediante MS o mediante IMMUNORIVELAZIONE SPECIFICA.

LE VARIE SUBUNITLE VARIE SUBUNITÀÀ PROTEICHE SEPARATE PROTEICHE SEPARATE

MEDIANTE BN/SDSMEDIANTE BN/SDS--PAGE, VENGONO PAGE, VENGONO

IDENTIFICATE UTILIZZANDO STRATEGIE IDENTIFICATE UTILIZZANDO STRATEGIE

““TRADIZIONALITRADIZIONALI””::

PeptidePeptide Mass Finger Mass Finger PrintPrint (MS).(MS).

SequenziamentoSequenziamento peptidicopeptidico (MS/(MS/MSMS).).

Western Western blottingblotting..

AltroAltro…………....

I risultati possono comunque essere convalidati mediante I risultati possono comunque essere convalidati mediante

riconoscimento riconoscimento immunospecificoimmunospecifico (Western (Western BlotBlot)!)!

TwoTwo--dimensionaldimensional Blue Native/SDS Gel Blue Native/SDS Gel ElectrophoresisElectrophoresis of of MultiMulti--ProteinProtein ComplexesComplexes fromfrom WholeWhole CellularCellular LysatesLysates: :

A PROTEOMICS APPROACHA PROTEOMICS APPROACH

Margarita M. Margarita M. CamachoCamacho--CarvajalCarvajal, , BerndBernd WollscheidWollscheid, , RuediRuediAebersoldAebersold, , ViktorViktor SteimleSteimle ,and ,and WolfgangWolfgang W.W. A. A. SchamelSchamel

MOLECULAR AND CELLULAR PROTEOMICS (2004), 3:176MOLECULAR AND CELLULAR PROTEOMICS (2004), 3:176--182182

ANALISI DEI COMPLESSI PROTEASOMICI IN SISTEMI ANALISI DEI COMPLESSI PROTEASOMICI IN SISTEMI EUCARIOTICI E LORO DINAMICAEUCARIOTICI E LORO DINAMICA

Copyright ©2004 American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Camacho-Carvajal, M. M. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: 176-182

Identification of MPCs by immunoblotting

LL’’analisi analisi èè stata estesa a molte proteine stata estesa a molte proteine cellulari note, per verificare la loro cellulari note, per verificare la loro appartenenza a MPC.appartenenza a MPC.

ImportinImportin--ββ e e ImportinImportin--αα: implicate nel : implicate nel trasporto verso il nucleo, non sempre trasporto verso il nucleo, non sempre appartengono a stessi MPC.appartengono a stessi MPC.

P53 appartiene almeno a tre distinti MPC P53 appartiene almeno a tre distinti MPC (quello di 200 (quello di 200 kDakDa èè presumibilmente un presumibilmente un omotetrameroomotetramero).).

………………..

Alcune delle proteine analizzate, migrano Alcune delle proteine analizzate, migrano come componenti come componenti monomerichemonomeriche allall’’interno interno

della della ““diagonale iperbolicadiagonale iperbolica””

LL’’identificazione di proteine identificazione di proteine ““incogniteincognite”” presenti in MPC presenti in MPC èèstata effettuata mediante PEPTIDE MASS FINGER PRINT stata effettuata mediante PEPTIDE MASS FINGER PRINT

e/o SEQUENZIAMENTO DIRETTO (LCe/o SEQUENZIAMENTO DIRETTO (LC--MS/MS)MS/MS)

Cosa succede se due Cosa succede se due MPCsMPCs ((multimulti--proteinprotein complexescomplexes) ) hanno la stessa mobilithanno la stessa mobilitàà elettroforeticaelettroforetica??

Dopo la BN i due Dopo la BN i due MPCsMPCs sono sono ““sovrappostisovrapposti””..

Dopo la successiva SDSDopo la successiva SDS--PAGE le singole componenti di entrambi PAGE le singole componenti di entrambi si si separanoseparano…… ma come si attribuiscono gli ma come si attribuiscono gli spotsspots??????

AntibodyAntibody--basedbased gel gel shiftshift assayassay

AntibodyAntibody--basedbased gel gel shiftshift assayassay

La posizione di due spot in una colonna verticale dopo BN/SDSLa posizione di due spot in una colonna verticale dopo BN/SDS--PAGE può indicare:PAGE può indicare:

Due proteine appartenenti ad uno stesso MPC.Due proteine appartenenti ad uno stesso MPC.Due proteine appartenenti a due MPC con uguale mobilitDue proteine appartenenti a due MPC con uguale mobilitàà elettroforeticaelettroforetica ..

Incubando il Incubando il lisatolisato cellulare totale con un anticorpo diretto verso una cellulare totale con un anticorpo diretto verso una delle proteine presenti in uno dei MPC, prima della BN/SDSdelle proteine presenti in uno dei MPC, prima della BN/SDS--PAGE, si PAGE, si generergenereràà un complesso addizionato della massa dellun complesso addizionato della massa dell’’anticorpo:anticorpo:

SHIFT SHIFT vsvs TOPTOP((HigherHigher molecularmolecular mass)mass)

SPOSTAMENTO SOLO DELLE PROTEINE APPARTENENTI AD UNO SPOSTAMENTO SOLO DELLE PROTEINE APPARTENENTI AD UNO STESSO COMPLESSOSTESSO COMPLESSO

Identification and analysis of distinct proteasomes by WCL 2D BN/SDS-PAGE

SubunitSubunitàà proteiche delproteiche del complesso 20S:complesso 20S:Mcp21 e Mcp21 e ββ22

SubunitSubunitàà proteiche delproteiche del complesso 19S complesso 19S capcap deldel proteasomaproteasoma 26S:26S:S4 S4 ATPaseATPase

SubunitSubunitàà proteica di PA28:proteica di PA28:PA28PA28αα

RICONOSCIMENTO RICONOSCIMENTO IMMUNOSPECIFICO IMMUNOSPECIFICO

(WB)(WB)

SubunitSubunitàà delldell’’ immunoimmuno--proteasomaproteasoma indotto dal indotto dal trattamento con IFNtrattamento con IFN--γγ::LMP2LMP2

IN D: IN D: AntibodyAntibody--basedbased gel gel shiftshift assayassay

InIn--gelgel activityactivity stainingstaining of of oxidizedoxidized nicotinamidenicotinamide adenineadeninedinucleotidedinucleotide kinasekinase byby blue native blue native polyacrylamidepolyacrylamide gel gel

electrophoresiselectrophoresisRyanRyan J.J. MaillouxMailloux, , RanjiRanji SinghSingh, , VasuVasu D.D. Appanna, Appanna, AnalyticalAnalytical BiochemistryBiochemistry 359 (2006) 210359 (2006) 210––215215

La NADK La NADK èè un importante enzima metabolico che permette agli organismi un importante enzima metabolico che permette agli organismi

viventi di modulare la concentrazione viventi di modulare la concentrazione intracellulareintracellulare di di NADNAD++ e e NADPNADP++..

Fondamentale per la generazione di un ambiente riducente in gradFondamentale per la generazione di un ambiente riducente in grado di o di

contrastare la generazione/esposizione di/ai ROS (contrastare la generazione/esposizione di/ai ROS (ReactiveReactive OxygenOxygen

SpeciesSpecies).).

Messa a punto di una tecnica Blue NativeMessa a punto di una tecnica Blue Native--PAGE per PAGE per valutare valutare ll’’attivitattivitàà e le l’’espressioneespressione della NADKdella NADK

NADNAD++ + ATP + ATP NADPNADP++ + ADP+ ADPNADK

REAZIONE CATALIZZATA DALLA NADK:REAZIONE CATALIZZATA DALLA NADK:

L’attività viene monitorata direttamente su gel, in presenza di un enzima NADP+-dipendente (Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, G6PDHG6PDH o isocitrato deidrogenasi, ICDHICDH). Il NADPHNADPH che si forma, interagisce con CLORURO DI IODONITROTETRAZOLIO (INTINT) generando un precipitato bruno, che si deposita nel sito dove è presente l’enzima NADK.

Lisi in 50 Lisi in 50 mMmM BisBis--Tris, 500 Tris, 500 mMmM sixsix--aminoamino hexanoichexanoic acid (acid (pHpH 7.0)7.0)Aggiunta di Aggiunta di CoomassieCoomassie GG--250 0.02% (presente anche nel tampone catodico)250 0.02% (presente anche nel tampone catodico)Elettroforesi in condizioni native (20Elettroforesi in condizioni native (20--80 80 µµg proteine)g proteine)EquilibrazioneEquilibrazione in 25 in 25 mMmM Tris, 5 Tris, 5 mMmM MgCl2 (MgCl2 (pHpH 7.4)7.4)Aggiunta di Aggiunta di NAD+NAD+ 0.5 0.5 mMmM, ATP 3 , ATP 3 mMmM, Glucosio, Glucosio--66--fosfato 5 fosfato 5 mMmM o isocitrato 5 o isocitrato 5 mMmM, ,

G6PDH o ICDH 5 unitG6PDH o ICDH 5 unitàà, INT 0.4 mg/ml, PMS 0.2 mg/ml, INT 0.4 mg/ml, PMS 0.2 mg/ml

Controlli negativi:Controlli negativi:incubazione senza substrato (ATP o NADH) o aggiunta di incubazione senza substrato (ATP o NADH) o aggiunta di iodoacetatoiodoacetato e CTPe CTP

PROCEDURA:PROCEDURA:

Una volta individuata la Una volta individuata la ““banda attivabanda attiva””, ,

essa viene:essa viene:

RitagliataRitagliata

Equilibrata in 24 Equilibrata in 24 mMmM Tris, 191 Tris, 191

mMmM GlicinaGlicina, 1% SDS (W/v), 1% , 1% SDS (W/v), 1%

mercaptoetanolomercaptoetanolo (v/v)(v/v)

SDSSDS--PAGEPAGE

22aa dimensionedimensione

Blue Native Blue Native ElectrophoresisElectrophoresis1a dimensione

ANALISI COMPLETA:ANALISI COMPLETA:

(BN ((BN (zimogrammazimogramma)/SDS)/SDS--PAGE)PAGE)