CITOLOGIA IN ONCOLOGIA: INNOVAZIONE ED AUTOMAZIONE

Giacomo GazzanoIstituto Auxologico Italiano

Milano

La riduzione del tasso dei carcinomi invasivi è legato alla competenza del citoscreener

L’impossibilità degli umani ad avere costantemente le stesse performances: falsi negativi

Difficoltà nel reperire tali figure

Breve durata del training

GEORGE N. PAPANICOLAOU

1883-1962

Cytoanalyzer: -microscopio a scansione-computer -analizzatore-registratore

Università del Tennessee a Memphis

Normali

Sospette

Null

taglia nucleare

densità nucleare ottica

Anal Quant Cytol. 1982 Dec;4(4):251-6.Analytical and quantitative cytology. A historical perspective. Koss LG.

Annual Meeting of the American Society of Cytology Denver 1983

Presidential Address on automation in cytology

-Il cancro della cervice è prevenibile tramite screening-Screening tramite l’occhio umano è «tedioso e stancante»-se tutte le donne candidate si sottoponessero allo screening ………-migliore allestimento del preparato-le cause di mancata diagnosi di carcinoma non è il paptest

«We need not fear that automation will replacecytopathologists and cytotechnologists; instead , new developments will require acquisition of additional skillsto keep up with modern systems»

………questi strumenti non saranno mai perfetti!

Regulations for Implementing the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988

1987

1988

Colorado 1991Thin Prep method (Cytyc Corporation):-cellule sospese in liquido preservante dal clinico e mandati direttamente in laboratorio-allestimento automatico (ThinPrep Processor)-rimozione substrato ematico e infiammatorio

Autocyte (Roche Corporation). Tecnica di strato sottile molto simile ma con sistema fissativo che rimuove le emazie

PAPNET (rete neurale)

Identificare cellule anomale nei Pap Test giudicati negativi dai citocreenersTecnica di intelligenza artificiale128 potenziali cellule anomale o clusters catturati in fotografia

Koss LG et Al. Am J Clin Pathol 1994Sherman ME et Al. Mod Pathol 1994.Valente PT et AL. Lab. Med. 2001

PAP NET

Sistema computerizzato di scansione:a) microscopio ad alta velocitàb) software in grado di immagazzinare, interpretare e classificare: no need for reviewto be reviewedprocess reviewc) Forniva una PapMap con le 15 aree identificate (FOV)Limite: trasferimento manuale dei punti di interesse sul preparato da analizzare al microscopio

1995 FDA per il C.Q.

1998 FDA screening primario

Negli stessi anni…………

Dall’integrazione

FocalPoint GS Imaging System :10 FOV di cui uno con le ghiandolariFDA approvazione 2008

12.732 pap test erano visti manualmente e tramite il sistema.Tutti i casi considerati anormali e il 10% dei negativi vennero rivisti da due esperti.Aumento di sensibilità nel gruppo LSIL (86.1% vs 76.4%) e HSIL (85.3% vs 65.7%)

Wilbur DC et Al. The Becton Dickinson FocalPoint GS Imaging System: clinical trials demonstrate significantly improved sensitivity for the detection of important cervical lesions. Am J Clin Pathol 2009

THIN PREP IMAGING SYSTEM (IMAGER)

• Sistema che usa la tecnica dello strato sottile • Si usano algoritmi che analizzano cellule singole o/e in gruppi usando aspetti cellulari

e la densità nucleare.• Identifica 22 FOV• Microscopio robotizzato che automaticamente muove il vetrino su ciascuno dei 22

campi a 100X

10359 pap test screnati sia manualmente che tramite il sistema.Tutti i positivi e i negativi vennero rivisti da un pannello di esperti .Imager mostro’ una sensibilità maggiore su ascus e asc-us +(82% vs 75.6%) e specificità sovrapponibile (97.8% vs 97.6%) No differenze per LSIL mentre per HSIL si noto’ una maggiore sensibilità (79.9% vs 74.1%)

Biscotti CV etAl. Assisted primary screening using the automated ThinPrepImaging System. Am J Clin Pathol 2005.

MAVARIC TRIAL

Studio comparativo tra lo screening manuale e i sistemi automatici Imager e FocalPointMateriali e metodi:73837 donne di cui 24.556 solo screening manuale e 48271 sia manuale che automatizzato. Il trattamento deciso sulla base dell’informazione peggiore ottenuta da entrambi le modalità. I casi borderline (ASCUS) e discariosi (LSIL) vennero testati per HPV.

Risultati:Screening manuale identifico’ 192 casi di ASCUS e LSIL in piu’ positivi per HPV rispetto ai sistemi automatizzati e 47 casi in piu’ di HSIL.Contestuale incremento della produttività del 60-80%

Trall MJ. Automated screenign of Papanicolau tests: A review of the literature. Diagnostic Cytopathology 2019.

American Society of Cytopathology 2013Automated screening workload recommendations from the ASC

1) …no more 7 hours of Pap Test screening in 24 hours

2) Future studies should use actual screenignhours rather than a lesser number of hours extrapolated to 8-h days

3)….not exceed 70 slides per day when calculated ..: each slide with only FOV review counts as½ slide and full manual review counts as one slide, with slides undergoing both counting as 1 ½ slides

4) The percentage of slides that undergo full manual review should be the greater of 15% or twice the epithelial cell abnormality rate (the percentage of cases interpreted as cytologicallyabnormal)

5) The epithelial cell abnormality rate-adjusted workload measure is a promising method for calculating and monitoring workload

6) Cytotechnologist productivity/workload is just one aspect of good laboratory qualityassurance that should be considered whwn assesing performace

THINPREP IMAGING SYSTEM (TIS) operativo su preparati THINPREP PAP TEST• BD FOCALPOINT SYSTEM (FPS) operativo su preparati SUREPATHEntrambi i sistemi si basano sulla lettura di campi ottici (F.O.V.): 22

campi il TIS e 15 il FPS.

OGGI

OGGI

DistributedGS Platforms

Database

Local GS Platform

SQL ServerFocalPoint Instrument

FocalPoint Workstation

PROSPETTIVE FUTURE

AUTOMAZIONE: introduzione di nuovi sistemi che riducono l’apporto dell’uomo

INNOVAZIONE: introduzione di nuovi processi che modificano radicalmente il modus operandi

“diagnostic molecular cytopathology”

' 'diagnosi molecolare rappresenta l’applicazione di tecniche di biologia molecolare e la conoscenza dei meccanismi molecolari delle malattie alla diagnosi, prognosi e trattamento' '

PARADIGMA PRE E POST 2004

CITOPATOLOGIA E’ PARTE INTEGRANTE DELL’INTERA RIVOLUZIONE

MOLECOLARE

THYROSEQ V3

Nikiforova et al, Cancer 2018

TEST MOLECOLARI SU PRELIEVI CITOLOGICI

Facilità del prelievoRapida e adeguata fissazioneFissativi diversi dalla formalina

LA RICHIESTA TI TESTS MOLECOLARI SU CAMPIONI CITOLOGICI

Huang M et Al. Acta Cytologica 2019

Specimen type/preparations Advantages Limitations

Cell block Resembles surgical pathologyslide/no need for validation

DNA fragmentation, crosslinking, and degradation. No intact nuclei. May be paucicellular

Direct smear (DQ, pap stained) Immediate adequacy assessment. Intact whole cells/high –qualityDNA/RNA

Needs removal of coverslip/scraping. Slide sacrificing(can be compensated by digitalscanning)

Liquid based slide Intact whole cells/high –qualityDNA/RNA

Needs removal of coverslip/scraping. Some fixativecontains formaldehyde

Cytospin Multiple slides . Intact wholecells/high –quality DNA/RNA

Needs removal of coverslip/scraping

FTA Card Easy to store and transport No direct adequacy evaluationLimited DNA/RNA quantity

Cell pellet from FNA/effusion fluid Intact whole cells/high –qualityDNA/RNA. Processing withoutscraping/achieving

Needs separate slide for adequacyevaluation DNA degradation afterlong-term storage. Some fixativecontains formaldehyde

Supernatant of cytology specimen Abundant DNAAdditional source

Adequacy evaluation cannot be done

Liquid biopsy/cell-free DNA Easy to acquire Minimal quantity, needs sensitive tests

1474 TEST MOLECOLARI SU MATERIALE DA 62 CAMPIONI Sakairi Yet Al. J Thorac Oncol 2014

TESTS ADVANTAGES LIMITATIONS CLINICAL APPLICATION

FISH Morphologicalcorrelation

Few targets per testInaccurate localization

FISH studies (UroVysion), CNVs, gene rearrangement

PCR (qPCR, RT-PCR,HRMA, ARMS)

Sensitive, specific and reliable

Few target per test High risk HPV, residualdisease evaluation

DNA Microarray Virtual karyotipeFFPE specimenacceptable

Need large amount of DNA

aCGH, chromosome/SNP array, CNVs

RNA/expressionmicroarray

Whole genomicexpression

Needs fresh/frozenspecimen

Thyroid expression panel (Afirma)

Sanger sequencing Long individual reads Few targets per test/lowthroughput.Low sensitivity/requireshigh tumor cellularity

Single gene mutation, for example, BRAF, KRAS, EGFR mutations

NGS (DNA and RNA sequencing)

Many targets per test/high throughputmoderate sensitivity/needsrelatively low tumorcellularity detectsmultiple genomicalterations: mutations, deletions fusions and CNVs

Shorter reads comparedto Sanger sequencing.Informatics high infrastructure cost

Hot-spot panel, targetable panel, RNA (fusion) sequencing, whole genomesequencing

“DO MORE WITH LESS”

«EMERGING TASKS»

• Accurata e tempestiva diagnosi• Raccolta adeguata (ROSE)• Processazione idonea• Corretta conservazione

CONCLUSIONI Lettori automatici hanno mostrato affidabilità

Risultati ripetibili e del tutto indipendenti dall’esperienza

Riduzione del numero dei pap test con aumento della responsabilità diagnostica

Impatto economico: numero casi/rete o consorzi

La diagnostica citopatologica molecolare ha determinato incremento dei “compiti morfologici”

Ampliare il training del citoscreener con la conoscenza delle tecniche di biologia molecolare

“Cominciate col fare ciò che è necessario, poi ciò che è

possibile. E all’improvviso vi sorprenderete a fare

l’impossibile.”(San Francesco)