UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PAVIA

DIPARTIMENTO DI CHIMICA

Direttore Ch.ma Prof.ssa Antonella Profumo

Facolta di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di Laurea Triennale in Chimica – L27

CICLODESTRINE: COMPLESSI D’INCLUSIONE HOST–GUEST

E LORO APPLICAZIONI NEL TRASPORTO DI FARMACI

Relatore: Ch.ma Prof.ssa Doretta Capsoni

Correlatori: Dott. Francesco Monteforte

Ch.mo Prof. Maurizio Licchelli

Candidato:

Alessio Bianchi

Mat. 444639

Anno Accademico 2018 − 2019

Indice

1 Introduzione 1

2 Le Ciclodestrine 2

2.1 Generalita e interazioni host-guest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2.1.1 Aspetti Termodinamici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1.2 Match Sterico e Funzionalizzazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.3 Effetti dell’Interazione CD-Substrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2 Sintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2.1 Sintesi delle Ciclodestrine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2.2 Sintesi dei Complessi con Ciclodestrine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.3 Confronto tra le Principali Ciclodestrine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3 Le Ciclodestrine nel Drug Delivery 11

3.1 Variazioni delle Proprieta del Farmaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.1.1 Solubilita e Rilascio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.1.2 Biodisponibilita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.1.3 Tossicita ed Effetti Collaterali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.1.4 Stabilita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.2 Rilascio Controllato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.3 Applicazioni Farmaceutiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4 La Bumetanide 15

4.1 Descrizione Generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.2 Sintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.3 Struttura Cristallina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

5 Parte Sperimentale 17

5.1 Tecniche Utilizzate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5.2 Attivita Sperimentale e Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

6 Conclusioni 22

Bibliografia 23

i

1. Introduzione

Le ciclodestrine (CD) vengono scoperte da A. Villiers nel 1891[ 1], anno in cui il biologo francese

si accorge della presenza di prodotti cristallini nelle colture batteriche di Bacillus amylobacter

su cui sta lavorando. Ignaro di aver avuto contaminazioni da parte di un altro batterio in grado

di produrre destrine in forma cristallina partendo dall’amido, chiamo la sostanza “cellulosina”,

nome che permane fino ai primi studi specifici, nel 1903, da parte di F. Schrardinger[ 2]. Egli

isola le destrine da lui chiamate A e B (diventate poi α e β), entrambe scevre di potere ridu-

cente, caratteristica che ne fa intuire la ciclicita in quanto associata al fatto che tutti i carboni

anomerici siano impegnati in legami O-glicosidici. Nel 1904 Schrardinger riesce finalmente a

caratterizzare il Bacillus macerans, batterio fino ad allora sconosciuto nonche il contaminan-

te di Villiers ed effettore della sintesi delle CD. Tutto cio portera all’isolamento massiccio di

questi composti e alle prime reazioni di ciclizzazione controllata per via enzimatica nel 1935[ 3].

E proprio grazie alle CD che e stato possibile osservare per la prima volta il meccanismo di

inclusione host-guest tra molecole anche grazie all’avvento della diffrazione a raggi X che ha

permesso lo studio strutturale dei cristalli[ 4].

Nella chimica supramolecolare, la chimica dei sistemi host-guest prevede l’interazione di

una o piu molecole ospitanti (host) piu grandi con una o piu molecole o ioni ospitati (guest) di

dimensioni inferiori. Le interazioni tra host e guest, di tipo non covalente, sono tendenzialmente

molto specifiche e comprendono legami a idrogeno, legami ionici, forze di Van Der Waals e

interazioni idrofobiche[ 5]. Nei sistemi in cui il ruolo di host e ricoperto da una CD sono proprio

queste ultime le interazioni preponderanti.

Le CD sono, come afferma J. F. Stoddart nel Carbohydrate Research del 1989[ 6], “contenito-

ri molecolari multiuso” e vengono per questo attualmente sfruttate in svariati campi industriali.

In cosmetica si utilizzano per il sequestro, il rilascio o la stabilizzazione di determinate mole-

cole come fragranze nei deodoranti[ 7] e agenti attivi in dentifrici e creme per la pelle[ 3]; nel

campo alimentare, per il mascheramento o l’esaltazione di sapori e odori, la stabilizzazione di

coloranti e la conservazione in generale dei prodotti, ma anche in processi produttivi come la

rimozione del colesterolo dai prodotti animali[ 3,8]; in agricoltura servono da vettori per erbicidi,

insetticidi, fungicidi, repellenti, ferormoni e regolatori della crescita; nell’industria chimica so-

no ampiamente usate nella separazione di enantiomeri, come catalizzatori[ 9], in cromatografia

come fasi stazionarie e in altre applicazioni analitiche[ 3], ma anche nella rimozione di contami-

nanti da suolo e atmosfera[ 10]; infine, le CD trovano un importante impiego nel drug delivery

permettendo a farmaci di essere solubilizzati, trasportati e rilasciati efficacemente e in modo

controllato nelle membrane cellulari attenuando, inoltre, alcuni effetti collaterali[ 11].

E questo l’aspetto che verra principalmente approfondito nella trattazione che prevede una

sezione sperimentale in cui si indaghera qualitativamente, con tecniche strumentali, l’otteni-

mento di complessi tra il farmaco bumetanide – a cui e dedicato un capitolo di presentazione –

e due differenti CD.

1

2. Le Ciclodestrine

2.1 Generalita e interazioni host-guest

Con ciclodestrine s’intendono, come indica il termine, degli oligosaccaridi macrociclici ad anello

composti da un certo numero, piccolo, di monomeri di α-D-glucopiranosio legati linearmente

tra loro per legami α-1,4 glicosidici. Esistono, in quanto stabili, CD composte da un numero di

monomeri pari o superiore a 5, ma le tre piu comuni sono quelle con 6, 7 e 8 unita monomeriche

che si indicano rispettivamente con i nomi comuni di α- , β- e γ-ciclodestrina. Le CD da 9 a 12

unita (δ- , ε- , ζ- ed η-) sono state anch’esse prodotte ma non trovano largo impiego a livello

industriale[ 12].

Figura 2.1: Formula di struttura e schematizzazione di una ciclodestrina.

Le CD assumono tridimensionalmente una forma toroidale (Figura 2.1), nello specifico a

tronco di cono le cui due aperture hanno diversa dimensione. Quella piu grande espone al-

l’esterno della struttura i gruppi idrossilici primari mentre quella piu piccola quelli secondari;

gli ossigeni emiacetalici, insieme al resto dell’anello piranosico, costituiscono invece la super-

ficie del toroide. Tale arrangiamento spaziale permette a questi macrocicli di interfacciarsi

efficacemente con solventi polari, avendo una zona esterna idrofila, mantenendo pero una certa

idrofobia nella cavita interna[ 13]. Proprio per questa caratteristica, le CD sono in grado di

creare strutture supramolecolari ospitando molecole apolari (substrati) per formare complessi

definiti host-guest [ 12]. Essendo solubili in acqua e in altri solventi polari, le CD costituiscono

quindi un ottimo vettore chimico per molecole idrofobe (tipicamente quelle organiche) in am-

bienti acquosi aumentandone la loro solubilita[ 14], una volta ospitate nella loro struttura. E

da notare che nonostante le strutture supramolecolari che si ottengono vengano comunemente

chiamate “complessi”, l’interazione tra le due specie e puramente di tipo idrofobo e non com-

porta rotture o formazioni di legami covalenti[ 15]. I rapporti stechiometrici CD:Substrato sono

variabili, anche se e piu comune che una o piu molecole di CD si associno ad un solo substrato,

soprattutto se di dimensioni molto maggiori[ 16]; rari sono i casi di piu molecole di substrato

inclusi in una sola CD.

2

Le Ciclodestrine 2.1. Generalita e interazioni host-guest

2.1.1 Aspetti Termodinamici

Il processo di inclusione e favorito sia dal punto di vista entropico che entalpico. Se consideria-

mo una soluzione acquosa di CD ed essendo l’interno della sua struttura non completamente

idrofoba, essa conterra un certo numero di molecole d’acqua nella sua cavita. Nel momento in

cui un generico substrato idrofobo affine alla CD (X) viene aggiunto alla soluzione, si andra ad

instaurare un equilibrio tra le due specie separate e il complesso d’inclusione. Supponendo che

il complesso che si formi sia 1:1, il processo si puo schematizzare con la reazione di equilibrio:

[CD · nH2O] + XKf−−⇀↽−− [CD · X] + nH2O (2.1)

Kf = e−∆G◦/(RT ), ∆G◦ = ∆H◦ − T∆S◦

Il rilascio di un numero sicuramente superiore di molecole di solvente rispetto a quello di

substrato incluso e entropicamente favorevole, ma costituisce tuttavia il contributo minore nel

∆G◦ di formazione del complesso che risente molto di piu della diminuzione di entalpia sempre

legata all’espulsione delle molecole d’acqua ma in relazione alla loro alta energia[ 3]. Esse si

trovano inizialmente in una zona meno idrofila dell’esterno e non avendo interazioni favorevoli

con la CD stessa risultano avere energia maggiore di quanta ne avrebbero se venissero rilasciate

interagendo col resto del solvente. Inoltre, si viene a creare un’interazione idrofoba favorevole

tra substrato e cavita della CD che comporta un ulteriore ∆H◦ < 0 eventualmente accentuato

dalla formazione di legami a idrogeno tra residui del substrato e gruppi ossidrilici esterni della

CD. Riassumendo, gli aspetti che favoriscono la formazione del complesso sono[ 16]:

� L’espulsione delle molecole di solvente polare dalla cavita della CD;

� L’eventuale aumento di legami a idrogeno tra le molecole di solvente rilasciate all’esterno;

� La diminuzione delle interazioni repulsive tra il solvente polare e il substrato apolare;

� L’aumento dell’interazione idrofoba tra CD e substrato;

� L’eventuale instaurazione di legami a idrogeno tra i residui esterni del substrato e i gruppi

ossidrilici della CD.

L’approccio piu utilizzato nel ricavare Kf e quello definito metodo della solubilita descritto

da Higuchi e Connors[ 17] il quale esamina l’effetto di un solubilizzatore, nel nostro caso la CD,

ed un substrato da esso solubilizzato. Riportando in grafico la concentrazione del substrato

disciolto in funzione della concentrazione di CD, quantita determinabili con opportuni metodi

titrimetrici, si ottengono curve definite di tipo A o di tipo B (Figura 2.2): le prime indicano la

formazione di complessi d’inclusione solubili mentre le seconde poco solubili. A loro volta, le

curve di tipo A sono suddivise nelle sottospecie AL (aumento lineare della solubilita in funzione

di [CD]), AP (aumento con deviazione positiva) e AN (aumento con deviazione negativa). I

3

Le Ciclodestrine 2.1. Generalita e interazioni host-guest

[Sub

Disc

]

[CD]

S0

APAL

AN

A BBS

BI

Figura 2.2: Diagramma di solubilita teorico riportante vari casi di curve[ 17].

sistemi di tipo AP denotano rapporti CD:Sub maggiori di 1 mentre quelli di tipo AN sono

difficilmente interpretabili. Le curve di tipo B identificano complessi di solubilita limitata nel

caso di BS e insolubilita per BI . La β-CD in acqua mostra sovente una curva di tipo B a causa

della sua bassa solubilita, ragion per cui si prediligono alcuni suoi derivati funzionalizzati (vedasi

sezione 2.1.2) che danno invece curve di tipo A. Nel caso della formazione di un complesso 1:1,

tenendo conto della porzione lineare della curva e definendo con m il coefficiente angolare della

retta, e possibile ricavare Kf dalla formula:

Kf =m

S0 (1 −m)(2.2)

con S0 solubilita intrinseca del substrato nel solvente.

2.1.2 Match Sterico e Funzionalizzazioni

L’interazione tra CD e substrato e altresı dettata dal giusto match tra le dimensioni delle

due molecole[ 18]. Questo fattore, che possiamo definire di tipo sterico, e inoltre alla base di

interazioni piu o meno favorevoli tra il medesimo substrato e ciclodestrine di cavita differenti e

determina una certa selettivita verso una molecola da parte di una specifica CD anche in base

ad eventuali funzionalizzazioni. Le CD, come del resto gli altri composti del glucosio, hanno dei

gruppi ossidrilici primari e secondari come siti reattivi e subiscono quindi le reazioni tipiche degli

alcoli come amminazioni, esterificazioni o eterificazioni[ 3]. La modifica della molecola comporta

una variazione della solubilita (importante per esempio per la β-CD essendo la meno solubile

tra le tre principali) e della stabilita a luce, calore e ossidazione, ma anche dell’affinita con una

certa molecola guest. Essa infatti, nonostante la lipofilia, presenta sovente gruppi polari che

tendono a rimanere all’esterno della cavita della CD avendo quindi la possibilita di interfacciarsi

con altri gruppi altrettanto polari, o addirittura con cariche nette, legati all’esterno della CD

stessa.

4

Le Ciclodestrine 2.1. Generalita e interazioni host-guest

HP-β-CD, pH 4 SBE-β-CD, pH 4 HP-β-CD, pH 7.4 SBE-β-CD, pH 7.4

O

HO

MeO

MeO

Me

⊕HN

NN

⊕HN

HN

Cl

N

MeO

MeO

Me

⊕HN

NN

⊕HN

HN

Cl

N

⊖

3OSO

MeO

MeO

Me

N

NN

N

HN

Cl

N

O

HO

MeO

MeO

Me

N

NN

N

HN

Cl

N

⊖

3OSO

Figura 2.3: Modelli proposti per i complessi d’inclusione di DY-9760e con HP-β-CD e SBE-β-CD a pH 4 e 7.4 (rielaborazione Fig. 5 in Nagase et. al.[ 19]).

Ne e un esempio lo studio del 2001 condotto da Nagase et. al.[ 19] nel quale e stata con-

frontata l’interazione del farmaco DY-9760e1 con due diverse β-CD funzionalizzate a diversi

pH, la 2-idrossipropil-β-CD (HP-β-CD) e la sulfobutiletere-β-CD (SBE-β-CD), tramite metodi

spettroscopici e studi di solubilita. I risultati confermano rapporti stechiometrici host:guest 1:1

e una maggior stabilita nel caso del complesso con SBE-β-CD per azione sinergica dell’intera-

zione idrofobica tra il residuo fenilico del farmaco e la cavita della CD (confermata dalle 1H- e13C-NMR) e l’interazione elettrostatica tra un residuo ammonio quaternario sulla molecola e il

gruppo solfonico carico posto sulla CD a pH acido (Figura 2.3).

2.1.3 Effetti dell’Interazione CD-Substrato

La formazione del complesso puo essere sfruttata sotto vari aspetti in quanto il sistema host-

guest presenta proprieta chimico fisiche differenti dalla molecola libera di substrato[ 14]. In

particolare:

� Il complesso ha solubilita maggiore del substrato in solventi polari, soprattutto in acqua

(principio sfruttato nel drug delivery);

� La CD ha un effetto protettivo per molecole labili contro agenti ossidanti o degradazione

da parte di luce e calore;

� La complessazione comporta una diminuzione di volatilita o tendenza a sublimare del

substrato;

� In generale, la complessazione attua un sequestro della molecola spegnendo la sua reat-

tivita o occultandone la detezione. Questo principio viene sfruttato nell’utilizzo delle

CD per il mascheramento di sapori e odori, ma anche per attuare effetti ipocromici su

coloranti;

13-2-[4-(3-cloro-2-metilfenil)-1-piperazinil]etil-1-(1H-imidazol-5-ilmetil)-5,6-dimetossi-1H-indazolo

5

Le Ciclodestrine 2.2. Sintesi

� L’uso di CD funzionalizzate, grazie alla reattivita dei gruppi ossidrilici, puo portare ad

un controllo del rilascio dalla struttura delle molecole complessate (sfruttato nel drug

delivery).

� L’interazione con la CD puo portare ad attivita catalitica di reazioni che coinvolgono il

guest.

2.2 Sintesi

2.2.1 Sintesi delle Ciclodestrine

Figura 2.4: Schema di sintesi enzimatica delle CD attuata direttamente su un’alfaelica diamilosio o previo trattamento con α-amilasi a dare destrine lineari.

La sintesi delle CD a partire dall’amido prevede una transglicosilazione intramolecolare ed

e messa in atto dall’enzima ciclodestrinaglucanotransferasi (CGTasi) a volte supportato dall’α-

amilasi che frammenta semplicemente le catene polimeriche dell’amido (Figura 2.4)[ 3]. Gli

studi sull’azione enzimatica[ 20] mostrano come un residuo Asp 229 della CGTasi vada a rompe-

re le catene lineari di amilosio formando un legame estereo su un carbonio anomerico a dare un

intermedio enzima-glicosilico (substrato attivato) e uno zucchero libero (Figura 2.5). Il residuo

di zucchero rimosso puo essere quindi sostituito da una nuova molecola, detta accettore, per

formazione di un nuovo legame α-1,4 . Il substrato attivato segue quindi diverse vie rispetto

all’accettore disponibile: nel caso fosse una molecola d’acqua, si va incontro a idrolisi; se viene

utilizzato il gruppo 4-idrossilico di un altro zucchero, avviene una transglicosilazione intermo-

lecolare a dare zuccheri lineari; se invece si sfrutta il gruppo 4-idrossilico di un monomero dello

stesso substrato attivato si ha ciclizzazione. Affinche la reazione segua questo iter, una zona

specializzata della CGTasi permette la circolarizzazione della struttura. In questo step sembra

essere cruciale l’intervento di un residuo amminoacidico specializzato Tyr 195[ 21–23]. Le CGTasi

producono in genere una miscela di CD i cui componenti principali sono le α-, β- e γ-CD, il

cui rapporto dipende dallo specifico enzima, insieme ad altri sottoprodotti lineari[ 3,25].

L’isolamento si basa sulla differente solubilita delle tre molecole:

� La β-CD e poco solubile in acqua (18.5 g/L a 25 ◦C) e puo quindi essere separata per

cristallizzazione;

6

Le Ciclodestrine 2.2. Sintesi

Asp 229

+

Circolarizzazione

Asp 229

Asp 229

Asp 229

Ciclizzazione

'

'

Asp 229

Transglicosilazione

Ciclodestrina

Zucchero Lineare

Figura 2.5: Meccanismo di reazione enzimatica portata avanti da una CGTasi a dare unaγ-CD e dei sottoprodotti lineari (rielaborazione Fig. 1 in Uitdehaag et. al.[ 24]).

� α-CD e γ-CD hanno invece una solubilita decisamente maggiore (rispettivamente 145 e

232 g/L a 25 ◦C) e necessitano quindi di piu dispendiose tecniche cromatografiche per

essere isolate.

Tendenzialmente, i complessi delle CD sono meno solubili di quelle libere, percio l’aggiunta

di un substrato co-precipitante (di solito un solvente organico come toluene, etanolo o acetone)

permette la precipitazione sequenziale delle diverse CD evitando separazioni in cromatografia.

Inoltre, la formazione di un prodotto insolubile sposta l’equilibrio di formazione della (2.1)

verso i prodotti.

2.2.2 Sintesi dei Complessi con Ciclodestrine

Per la sintesi dei complessi di inclusione con CD sono impiegate diverse tecniche[ 13,26]:

Co-precipitazione: E il metodo piu utilizzato a livello di laboratorio e consiste nello scio-

gliere una certa quantita di CD in un solvente, di solito acqua, tramite eventuale riscaldamento,

anche in base alla termolabilita del guest che viene aggiunto sotto agitazione. Dato che la so-

lubilita del complesso e tendenzialmente inferiore alla CD libera, si utilizzano concentrazioni di

CD abbastanza alte di modo che, man mano che la reazione va a compimento, precipiti diretta-

mente il complesso. Si puo anche raffreddare per favorire la precipitazione. Il precipitato viene

cosı raccolto per decantazione, centrifugazione o filtrazione e puo essere lavato con aliquote di

acqua fredda o altri solventi polari come metanolo, etanolo o acetone. Questo passaggio puo

risultare deleterio per i complessi piu solubili e va quindi testato prima della realizzazione su

scala industriale. Gli svantaggi di questo metodo sono proprio messi in risalto quando applicato

su vasta scala: infatti, la ridotta solubilita delle CD (vedasi Tabella 2.1) costringe all’utilizzo

di grandi quantita d’acqua, ma anche la capacita dei serbatoi, il tempo e l’energia impiegati

nel riscaldamento e nel raffreddamento possono diventare fattori economici importanti. An-

7

Le Ciclodestrine 2.2. Sintesi

che il trattamento delle acque madri comporta un costo aggiuntivo, attenuato in molti casi

operandone un riciclaggio[ 27,28].

Complessazione Slurry : Questo metodo prevede di sovrasaturare la soluzione di CD rag-

giungendo concentrazioni del 50-60% (m/V ) in acqua. L’aggiunta del guest (X) comporta la

precipitazione del complesso e la conseguente solubilizzazione della parte sospesa di CD libera

che viene dissolta gradualmente:

CD(s)H2O−−⇀↽−− CD(aq) (2.3)

CD(aq) + X(aq) [CD · X](s) (2.4)

La formazione del complesso [CD · X](s) sposta l’equilibrio (2.4) verso i prodotti e, di conse-

guenza, il (2.3) verso la forma acquosa della CD che va a reagire col resto del substrato.

Il complesso viene isolato con le stesse operazioni della co-precipitazione. Il tempo richiesto

per completare la complessazione e variabile e dipende principalmente dal guest. La complessa-

zione slurry e attuata principalmente a temperatura ambiente, il che rappresenta un vantaggio

rispetto alla co-precipitazione. Per molti guest e tuttavia necessario il riscaldamento che va

pero operato con attenzione dato che troppo calore puo destabilizzare il complesso dando luo-

go a reazioni non complete. A livello industriale risulta un metodo vantaggioso per un minor

dispendio d’acqua e reattori di grandezze inferiori.

Complessazione in Pasta o Kneading : E considerata una variazione della complessazione

slurry. Solo una piccola quantita di solvente viene aggiunta ad una miscela dei due componenti

che vengono mescolati con mortaio e pestello o, su vasta scala, in uno kneader. Esso viene poi

man mano fatto evaporare, anche portando a secco, e riaggiunto in piccole quantita per un

numero di volte che dipende dal guest. Il complesso risultante puo essere direttamente seccato

o lavato con piccole quantita di solvente e raccolto per filtrazione o centrifugazione. La quantita

di solvente e la natura del guest portano a casi di paste secche e compatte o di polveri fini.

Sono percio necessari mescolamento continuo e il giusto apporto di solvente. Questa tecnica ha

il vantaggio di permettere un intimo contatto tra i due componenti, soprattutto se entrambi

inizialmente in stato solido, operando una continua solubilizzazione e riprecipitazione. Per

l’abbattimento dei tempi risultano percio utili solventi volatili.

Miscelazione e Riscaldamento a Umido: Si utilizzano, in questo caso, quantita minime

o nulle di acqua che vanno dalle molecole di idratazione della CD al 20-25% rispetto al reagente

anidro. CD e substrato vengono miscelati e posti in un contenitore a tenuta poi riscaldato

a 100 ◦C. Il contenuto e infine rimosso e seccato. La quantita di acqua aggiunta, il grado di

miscelazione e il tempo di riscaldamento sono parametri da studiare e ottimizzare in base alla

natura di ogni guest.

8

Le Ciclodestrine 2.3. Confronto tra le Principali Ciclodestrine

Estrusione: E la variante in continuo del metodo precedente. I componenti possono essere

premiscelati prima di raggiungere l’estrusore e i parametri di quantita d’acqua, grado di misce-

lazione e quantita di calore nella camera possono essere controllati direttamente. Rispetto alla

quantita d’acqua, il prodotto asciughera nella fase di raffreddamento o subira un’asciugatura in

un forno apposito. A causa delle alte temperature normalmente raggiunte, risulta un metodo

non adatto a guest termolabili.

Miscelazione a Secco: E l’approccio piu semplice e consiste nella semplice miscelazione di

CD e guest. Questo metodo risulta efficace nel caso di substrati liquidi o oleosi. La miscelazione

avviene generalmente a temperatura ambiente e il tempo dipende, come sempre, dalle carat-

teristiche del guest. E considerata una variazione dello kneading. La mancanza di aggiunte di

acqua ne fa un metodo vantaggioso su vasta scala, anche se comporta il rischio di formazione

di agglomerati facendo risultare la miscelazione non sufficiente affinche la complessazione abbia

luogo.

2.3 Confronto tra le Principali Ciclodestrine

Proprieta α-CD β-CD γ-CDNumero unita di glucopiranosio 6 7 8

Massa molecolare (g/mol) 972 1135 1297Solubilita in acqua a 25 ◦C (g/L) 145 18.5 232

Diametro esterno (A) 14.6 15.4 17.5Diametro della cavita (A) 4.7-5.3 6.0-6.5 7.5-8.3

Altezza del toroide (A) 7.9 7.9 7.9Volume della cavita (A3) 174 262 427

Tabella 2.1: Alcune proprieta delle tre principali ciclodestrine[ 16].

Delle proprieta riportate in Tabella 2.1, stupisce di sicuro il gia accennato calo di solubi-

lita in acqua della β-CD. Essa, avendo un numero pari di monomeri, impiega tutti gli –OH

disponibili alla formazione di legami a idrogeno con altri ossidrili adiacenti in maniera efficace

precludendosi la possibilita di instaurarne con il solvente[ 29]. Tant’e che anche la δ-CD, seppur

non riportata, presenta una solubilita in acqua a 25 ◦C di 81.9 g/L, inferiore sia alla α- che alla

γ- . L’inconveniente viene risolto funzionalizzando le molecole come gia descritto nelle sezioni

2.1.1 e 2.1.2 . Nella α-CD, un’unita di glucopiranosio distorta non le permette di instaurare

tutti i possibili ponti a idrogeno con se stessa e nella γ-CD lo stesso risultato viene raggiunto

a causa della flessibilita e non complanarita della struttura: il risultato e una maggiore inte-

razione con l’acqua e una solubilita piu accentuata. E da considerare che nonostante i limiti

descritti, la β-CD rimane la piu accessibile delle tre a livello economico e anche la piu effica-

ce nel complessare un elevato numero di substrati[ 16] (vedasi sezione 2.1.2 e Tabella 2.3); cio

giustifica la considerevole varieta dei suoi derivati funzionalizzati prodotti industrialmente[ 11]

(Tabella 2.2).

9

Le Ciclodestrine 2.3. Confronto tra le Principali Ciclodestrine

Derivato della β-CD AbbreviazioneIdrossietil-β-CD HE-β-CDIdrossipropil-β-CD HP-β-CDSulfobutiletere-β-CD SBE-β-CDMetil-β-CD M-β-CDDimetil-β-CD DM-β-CD (DIMEB)β-CD metilata casualmente RM-β-CDβ-CD dimetilata casualmente RDM-β-CD

Derivato della β-CD AbbreviazioneCarbossimetil-β-CD CM-β-CDCarbossietil-β-CD CME-β-CDDietil-β-CD DE-β-CDTri-O-metil-β-CD TM-β-CD (TRIMEB)Tri-O-etil-β-CD TE-β-CDTri-O-butirril-β-CD TB-β-CDTri-O-valeril-β-CD TV-β-CD

Tabella 2.2: Alcuni derivati della β-CD comunemente impiegati nel drug delivery con lecorrispettive abbreviazioni utilizzate in questo elaborato[ 11].

Nell’interazione con un guest, le dimensioni giocano un ruolo fondamentale[ 30–34]. Spesso

accade che ci sia infatti una selettivita pronunciata da parte di una sola delle diverse CD

nei confronti di un substrato. Una CD troppo piccola puo infatti non permettere l’inclusione

della molecola e una troppo grande puo non presentare interazioni abbastanza forti. Questo

match sterico richiama l’esempio piu didatticamente conosciuto degli eteri corona con i metalli

alcalini. Vi e una vastissima letteratura in merito alla selettivita di diverse CD nei confronti

di vari substrati: ne riportiamo alcuni esempi in cui il fattore principale e la grandezza della

cavita (Tabella 2.3).

Substrato CD studiate Risultati Riferimenti

Glicazide (GL) α- e β-CDLa cavita della β-CD risulta piu accessibileagli anelli di GL rispetto a quella della α- .

[ 30]

CompostiMacrociclici (MCC)

α-, β-, γ- e δ-CDSono stabili i complessi tra MCC piu piccoli

e α- e β-CD e tra MCC piu grandi e γ- e δ-CD.[ 32]

Ibuproxam α-, β- e γ-CDUn effettivo aumento della solubilita e stato

registrato solo per la β- e la γ-CD in quanto laα- risulta meno accessibile.

[ 33]

Tabella 2.3: Influenza della grandezza della cavita di diverse CD nell’interazione con unospecifico substrato.

L’attivita sperimentale mirata allo studio di formazione di un determinato complesso d’in-

clusione con CD prevede quindi tendenzialmente un confronto tra almeno due o piu CD diverse,

naturali o funzionalizzate, sullo stesso substrato tramite curve di solubilita, titolazioni spettro-

fotometriche (se possibile) o comunque metodi titrimetrici in generale per poter valutare la

stechiometria, ma anche analisi qualitative tramite XRD, FT-IR e analisi termiche operando

gli opportuni confronti tra dati. La scelta di un eventuale derivato di una CD va ponderata

basandosi anche sulla struttura molecolare del guest, valutandone polarita, dimensioni e gruppi

funzionali caratteristici.

10

3. Le Ciclodestrine nel Drug Delivery

3.1 Variazioni delle Proprieta del Farmaco

Grazie alle variazioni delle proprieta chimico fisiche che subisce un substrato incluso in una CD,

esse vengono ampiamente utilizzate nel trasporto di farmaci, anche grazie alla loro blanda o

nulla tossicita[ 35]. Operando un focus sull’aspetto del drug delivery, gli effetti generali derivanti

dalla complessazione riportati nella sezione 2.1.3 assumono ulteriore specificita, soprattutto per

quanto riguarda la contestualizzazione del sistema CD:Substrato in un ambiente fisiologico.

3.1.1 Solubilita e Rilascio

Il gia descritto aumento di solubilita in acqua va cosı a rivestire un ruolo fondamentale per

i farmaci idrofobi, soprattutto per formulazioni che richiedono alte dosi di principio attivo

permettendone l’assunzione in quantita minore[ 36]. In particolare, delle CD commercialmente

disponibili, quelle metilate con bassi gradi di sostituzione risultano le piu efficaci nella solubiliz-

zazione (es: DM-β-CD[ 37]). Le CD rivestono un ruolo importante anche nel rilascio dei farmaci:

ne e un esempio la β-CD in grado di aumentare il fattore di rilascio di naproxene o ketoprofene

da matrici di idrossipropil-metilcellulosa (HPMC) solubilizzandoli[ 38,39]. La capacita delle CD

di formare complessi anche in situ, direttamente nel solvente, non rende sempre necessaria la

preparazione del complesso allo stato solido per aumentare la dissoluzione del farmaco: CD e

substrato possono rimanere separati nel formulato andando a interagire solamente una volta

disciolti[ 40]. La scelta dell’uso di semplici miscele meccaniche viene messa in atto solamente nei

casi in cui la formazione del complesso in soluzione e ottimale, il che implica alte costanti di

formazione.

3.1.2 Biodisponibilita

L’inclusione di un farmaco in una CD e la conseguente solubilizzazione hanno spesso come

conseguenza l’aumento della sua biodisponibilita e quindi una miglior penetrazione delle barriere

biologiche. In particolare, le CD aumentano l’effetto penetrativo della sostanza d’interesse

attraverso le membrane cellulari con due differenti meccanismi, a seconda che il substrato

incluso sia completamente o solo parzialmente idrofobo.

Nel primo caso, la CD permette un aumento della permeabilita del farmaco alla membrana

(equilibrio a sx in Figura 3.1) rendendolo disponibile sulla sua superficie dove vi si ripartisce

senza disgregarne gli strati fosfolipidici. In questo contesto e necessario prevedere una quantita

di CD appena sufficiente a solubilizzare il substrato nell’ambiente acquoso in quanto un eccesso

comporterebbe una diminuzione della disponibilita della sostanza (l’equilibrio si sposta verso

la formazione del complesso)[ 17,41,42].

11

Le Ciclodestrine nel Drug Delivery 3.1. Variazioni delle Proprieta del Farmaco

XCD

Membrana Biologica

CD +

X X

XCD

Figura 3.1: Modalita di aumento della penetrazione di sostanze nelle membrane biologicheda parte di CD[ 41].

Nel caso di molecole piu solubili in acqua, la CD opera un aumento della permeabilita del

farmaco per azione diretta sulla membrana[ 17,43] (equilibri a dx in Figura 3.1). In seguito alla

dissociazione del complesso in concomitanza di essa, la CD puo complessare i fosfolipidi di

membrana causando una perturbazione della sua integrita che sembra contribuire alla promo-

zione dell’assorbimento del farmaco. Inoltre, la capacita delle CD di rimuovere il colesterolo

determina un aumento della fluidita della membrana stessa inducendo una perdita di resistenza

alla deformazione causando cosı una lisi circoscritta della cellula. Questa rimozione dei fo-

sfolipidi, specialmente la fosfatidilcolina e la sfingomielina, dall’esterno della membrana puo

anche comportare uno sbilanciamento del doppio strato implicando l’eventuale formazione di

stomatociti. Tale effetto risulta pero essere blando e reversibile, soprattutto paragonando le CD

con altri promotori di assorbimento comunemente utilizzati nelle formulazioni. Per esempio, la

DM-β-CD permette un aumento di assorbimento di enoxaparin nelle mucose nasali solubiliz-

zando le membrane biologiche e aprendo piccole aperture sulla superficie, ma l’effetto risulta

essere reversibile dopo 6 ore[ 44].

La diminuzione delle irritazioni provocate dal farmaco, se stabilizzato in una CD, permette

inoltre un incremento dei tempi di contatto nei siti nasali, oculari, rettali e transdermali; cio

favorisce ulteriormente la biodisponibilita[ 17].

3.1.3 Tossicita ed Effetti Collaterali

Il fatto di permettere una somministrazione di quantitativi inferiori di principio attivo, grazie

alla solubilizzazione e alla maggior biodisponibilita, implica una considerevole attenuazione di

tossicita ed effetti collaterali dei farmaci inclusi in CD[ 45]. Ne e un esempio l’aumento dell’a-

zione antivirale del ganciclovir sul citomegalovirus insieme ad un’accentuata diminuzione della

sua tossicita sull’organismo umano se complessato con β-CD[ 46]. L’aumento di solubilita dei

farmaci permette inoltre di ridurre sensibilmente le problematiche associate alla loro cristalliz-

zazione nel caso di somministrazioni parenterali[ 47]. Anche gli effetti collaterali possono essere

attenuati grazie all’intrappolamento da parte di una CD che garantisce il contatto diretto con

12

Le Ciclodestrine nel Drug Delivery 3.2. Rilascio Controllato

le membrane biologiche bersaglio evitando tessuti di non interesse senza perdite drastiche degli

effetti terapeutici[ 48].

3.1.4 Stabilita

La protezione di un principio attivo incluso in una CD da alcuni processi indesiderati – quali

deidratazione, idrolisi, ossidazione e fotodecomposizione – permette una conservazione del far-

maco piu lunga e al contempo una maggior resistenza una volta immesso nell’organismo[ 13].

Tale effetto stabilizzante dipende sia dalla natura del residuo di molecola incluso nella CD che

da quella dell’intorno chimico in cui il complesso e inserito. Per esempio, la HP-β-CD e piu

efficace nel ridurre i danni da fotodegradazione della 2-etilesil-p-dimetilamminobenzoato sia

in soluzione che in emulsioni[ 49]. Cosı anche il pH contribuisce all’effetto stabilizzante, come

nel caso della fotostabilita della trimepazina aumentata per inclusione con CD, ma solo a pH

acidi[ 50].

L’effetto della complessazione sulla stabilita del farmaco e rappresentato nello schema[ 51]:

Prodotti di Degradazione

(3.1)

e formalizzabile, nell’ipotesi che i processi di degradazione seguano una cinetica di pseudo I

ordine, attraverso la seguente relazione:

1

k0 − kobs

=1

Kf (k0 − kc)[CD]+

1

k0 − kc(3.2)

con k0 la costante di velocita di degradazione del substrato libero, kobs la costante di velocita

di degradazione osservata in presenza di CD, kc la costante di velocita di degradazione del

complesso e Kf la sua costante termodinamica di formazione. kc e quindi legata, in maniera

complessa, sia alle altre costanti riportate che alla concentrazione di CD presente. Pertanto,

sotto determinate condizioni, la complessazione puo addirittura portare ad un eventuale au-

mento della degradazione del substrato, dovuta in alcuni casi anche a variazioni strutturali del

farmaco nella CD e alla sua inclusione totale o parziale in essa.

Ponendo in grafico 1/(k0 − kobs) vs 1/[CD], Kf e kc sono rispettivamente ricavabili dal

coefficiente angolare e dall’ordinata all’origine se l’andamento dei dati e lineare.

3.2 Rilascio Controllato

Oltre ad agire da carrier per le sostanze in esse incluse, le CD risultano delle ottime candidate

per un rilascio preciso e controllato della giusta quantita di principio attivo per un determinato

periodo di tempo[ 52]. Questi aspetti sono tutti ottimizzabili attraverso la funzionalizzazione

13

Le Ciclodestrine nel Drug Delivery 3.3. Applicazioni Farmaceutiche

delle CD naturali, in particolare della β-CD. I derivati di quest’ultima vengono principalmente

classificati come:

� Idrofili, i quali aumentano la solubilita in acqua di sostanze idrofobe permettendone poi il

rilascio immediato. Ne sono un esempio HP- e SBE-β-CD utilizzate in alcune formulazioni

il cui principio attivo e assorbito nel tratto gastrointestinale;

� Idrofobi, che invece ritardano la dissoluzione di sostanze non completamente idrofobe da

parte del solvente/veicolo determinandone un rilascio prolungato (es. β-CD alchilate e

acetilate).

Un controllo specifico puo essere attuato anche sul sito di rilascio del farmaco come accade nel

caso della CME-β-CD i cui complessi d’inclusione aumentano la loro solubilita all’aumentare

del pH[ 52,53]. Questo implica una ridotta solubilizzazione all’interno dello stomaco che permette

al complesso di raggiungere l’intestino prima di operare il rilascio del substrato. La Tabella 3.1

riassume gli aspetti descritti.

Tipo di rilascio Effetto CD utilizzate

Rilascio immediatoAumento della dissoluzione e dell’assorbimento di farmaci

poco solubili in acquaHP-β-, DM-β, SBE-β-CD

e β-CD ramificate

Rilascio ProlungatoAumento dei tempi di rilascio di molecole piu

solubili in acquaβ-CD etilate e acetilate

Rilascio modificatoBiodisponibilita orale piu bilanciata con effetti

terapeutici prolungatiUso simultaneo di differenti

CD e/o altri eccipienti

Rilascio ritardatodipendente dal pH

(Enterico) Protezione acida dei farmaci CME-β-CD

Tabella 3.1: Alcune modificazioni di sito e/o tempo di rilascio del farmaco rispetto allacomplessazione da parte di CD naturali e funzionalizzate[ 52].

Un optimum tra effetti terapeutici controllati e una biodisponibilita bilanciata puo essere

raggiunto tramite combinazioni di complessi di CD idrofile e idrofobe. Simili risultati sono stati

ottenuti nei complessi con nicardipina utilizzando miscele di HP-β-CD e triacetil-β-CD[ 54] e

nelle formulazioni in compresse di nifedipina con β- e HP-β-CD[ 55].

3.3 Applicazioni Farmaceutiche

Per i motivi descritti, le CD trovano impiego in campo farmaceutico in vari formulati[ 11] per

somministrazioni orali, parenterali, oculari, nasali, rettali, dermali e transdermali e nel trasporto

mirato di farmaci colon- o cerebro-specifici, di proteine e peptidi – quali gli ormoni glucagone e

insulina[ 56] –, anche a causa della loro instabilita e basso assorbimento, e di derivati nucleotidici

– in quello che viene definito gene delivery [ 57] – per il trattamento di varie patologie.

14

4. La Bumetanide

4.1 Descrizione Generale

S

O

H2N

HN

O O

HO

O Nome IUPAC: acido 3-butilammino-4-fenossi-5-sulfamoilbenzoicoFormula bruta: C17H20N2O5SCAS number: 28395-03-1Peso molecolare: 364.417 g/molPunto di fusione: 230.5 ◦C [ 58]

Punto di ebollizione: 571.2 ± 60.0 ◦C a 760 torr a

Densita: 1.347 ± 0.06 g/mL a 20 ◦C e 760 torr a

pKa: 3.18 ± 0.10 in condizioni acide e a 25 ◦C a

aDati calcolati utilizzando il software ACD/Labs, V11.02 .

Figura 4.1: Formula di struttura e informazioni principali della bumetanide.

La bumetanide e un medicinale diuretico e puo essere utilizzato per il trattamento degli stati di

sovraccarico di fluidi ed edema, per esempio nell’insufficienza cardiaca[ 59,60]. A causa della sua

funzione diuretica, puo pero essere anche impiegata nel mascheramento della presenza di altri

farmaci nell’organismo, compresi gli steroidi. Questo aspetto e stato illegalmente sfruttato da

alcuni sportivi, come nel caso del 2008 in cui quattro giocatori della National Football League,

negli USA, furono sospesi dalla ESPN1 per abuso di steroidi mascherati in seguito all’assunzione

del farmaco[ 61].

La molecola deriva da studi condotti sull’effetto dei sostituenti nella furosemide2 e risulta

essere fino a 40 volte piu attiva di quest’ultima nei pazienti con funzionalita renale compromessa.

L’intento era quello di sostituire l’atomo di cloro in posizione 4 della furosemide ritenuto fino

a quel momento indispensabile nell’attivita della molecola. Tramite questa e altre modifiche,

si arrivo all’ottenimento della bumetanide in cui l’efficace attivita diuretica e invece portata

avanti dal gruppo fenossi[ 59,60] (Figura 4.1). La sua azione deriva dall’eliminazione dell’eccesso

di liquido dalla circolazione sanguigna attraverso la riduzione di NaCl. Questo diminuisce

la pressione sistolica e la forza richiesta per l’allungamento delle fibre miocardiche. Viene

somministrata per via orale e il suo effetto diuretico ha una comparsa di azione gia nei primi

30 minuti raggiungendo il massimo dopo 1-2 ore. Raggiunge una biodisponibilita compresa tra

l’80 e il 95 % in seguito a rapido assorbimento nel tratto gastrointestinale, ma ha un tempo di

semivita abbastanza breve, compreso tra i 45 minuti e le 2 ore e 40 minuti.

La bumetanide viene utilizzata nei casi di edema associato a scompensi epatici, renali,

cardiaci e a sindromi neuropatiche. Studi recenti dell’Istituto Mediterraneo di Neurologia di

Marsiglia hanno dimostrato un’azione positiva del farmaco nella cura dell’autismo[ 62]. La so-

stanza sembra infatti essere in grado di ridurre la concentrazione di cloro a livello neuronale

1Emittente televisiva sportiva.2acido 4-cloro-2-(furan-2-ilmetilammino)-5-sulfamoilbenzoico.

15

La Bumetanide 4.2. Sintesi

inducendo un miglioramento della sintomatologia dei pazienti autistici. Viene infine sfruttata

nella cura di edemi polmonari acuti, ipercalcemia acuta, ipokaliema moderata e overdose di

anioni[ 59].

Gli effetti collaterali prevedono disturbi gastrointestinali, ipotensione, iponatriemia, cefalea,

gotta, vertigini, nausea, vomito, febbre, ipocalcemia, ipoglicemia, ipomagnesiemia, iperurice-

mia, affaticamento, pancreatite e rash dell’epidermide.

4.2 Sintesi

n-BuOH

Pt/C

CO2H

PhO

CO2H

NO2

PhO

PhONaNH3

CO2H

NO2NO2

CO2HCO2HHNO3HSO3Cl

H2SO4

H2

CO2H

Cl Cl

SO O

Cl Cl

Cl

SO O

H2N

Cl

SO O

H2NS

O O

H2NS

O O

H2N

HO

O

S

O

H2N

HN

O O

12

3

Figura 4.2: Sintesi della bumetanide a partire dall’acido p-clorobenzoico[ 63–65].

La sintesi totale multistep della bumetanide[ 63–65] (Figura 4.2) prevede inizialmente una sosti-

tuzione elettrofila aromatica con acido clorosolfonico sull’acido p-clorobenzoico. Il cloro o-, p-

orientante e il carbossile m- orientante costringono l’attacco in posizione 3. Seguono una nitra-

zione e un’amminazione. Il gruppo fenossi e poi aggiunto tramite sostituzione nucleofila all’a-

nello per trattamento con sodio fenossido attraverso un meccanismo di addizione-eliminazione.

Il gruppo nitro viene quindi ridotto con una idrogenazione catalitica e il residuo anilinico che

si ottiene viene infine butilato con una sostituzione nucleofila.

4.3 Struttura Cristallina

In letteratura sono riportate due diverse forme polimorfiche della bumetanide di cui e nota la

struttura:

� Struttura monoclina, Gruppo Spaziale P21/c, a = 5.3952 A, b = 18.206 A, c = 18.119 A,

β = 98.222◦, Z = 2 [ 66];

� Struttura triclina, Gruppo Spaziale P -1, a = 5.0017 A, b = 9.2265 A, c = 19.599 A,

α = 80.794◦, β = 82.840◦, γ = 86.813◦, Z = 1 [ 67] .

16

5. Parte Sperimentale

Scopo del lavoro sperimentale effettuato e stata la sintesi dei complessi β-CD : bumetanide e

γ-CD : bumetanide verificata con tecniche strumentali. La scelta dei reagenti e stata operata in

modo da poter verificare sperimentalmente la selettivita delle due diverse CD verso il farmaco

a causa della loro differente cavita (vedasi sezioni 2.1.2 e 2.3) e vista la scarsa letteratura in

merito ai complessi della bumetanide con le CD di cui abbiamo una sola referenza[ 68].

5.1 Tecniche Utilizzate

La conferma della formazione di un complesso Farmaco:CD puo essere effettuata attraverso

tecniche strumentali qualitative come riportato in alcuni recenti lavori[ 69–73]. Nel caso di un

farmaco solido, la prassi prevede la registrazione dei diffrattogrammi XRD dei due reagenti, di

una loro miscela fisica e infine della miscela dei prodotti di reazione. Restituendo un profilo

caratteristico rispetto alla struttura cristallina delle polveri o del cristallo singolo analizzati, il

confronto tra i diffrattogrammi puo essere chiarificante per poter confermare o meno l’inclu-

sione. Dato che, in generale, il diffrattogramma della miscela fisica risulta essere la semplice

sovrapposizione dei diffrattogrammi dei singoli componenti, si andranno a confrontare i picchi

di quest’ultima con quelli dei prodotti di reazione: lo spostamento, la scomparsa o la comparsa

di alcuni di essi risultano essere collegati ad un cambiamento della struttura cristallina e quin-

di sintomatici di una possibile formazione del complesso host-guest. Inoltre, la presenza nel

diffrattogramma di bande estese puo indicare che il complesso formato e amorfo.

L’ipotesi d’inclusione puo essere ulteriormente approfondita tramite analisi di spettroscopia

FT-IR e di calorimetria a scansione differenziale (DSC) degli stessi campioni analizzati in XRD.

Per la prima tecnica si opera un confronto del tutto simile a quello visto nel caso della diffrazione

e anche in questo caso lo spettro della miscela fisica risulta essere la sovrapposizione degli spettri

dei due reagenti. La variazione dei picchi rispetto ai due reagenti originali (o alla miscela fisica),

specialmente la scomparsa, la riduzione d’intensita o lo spostamento a diversi numeri d’onda di

alcuni di quelli del farmaco, non solo danno un’ulteriore conferma dell’avvenuta inclusione ma

permettono di indicare selettivamente quale residuo di molecola puo essere stato incluso nella

cavita della CD e se si possono essere instaurati legami a idrogeno tra le due specie. Anche per

la DSC si procede in modo analogo valutando variazioni delle temperature o dei ∆H collegati

ai passaggi di stato o ad altri processi endo-esotermici. In questo ultimo caso, anche solo la

miscela fisica puo presentare un profilo differente dalla sovrapposizione di quelli dei due reagenti

in quanto il riscaldamento dei due componenti puo dar luogo a loro interazioni.

17

Parte Sperimentale 5.2. Attivita Sperimentale e Risultati

5.2 Attivita Sperimentale e Risultati

Sono state eseguite due diverse sintesi per ciascuna coppia CD-farmaco, tramite coprecipitazione

e tramite kneading (vedasi sezione 2.2.2), sempre con rapporti stechiometrici 1:1. Essendosi

rivelato il metodo dello kneading il piu efficace, riportiamo solo la descrizione e i risultati

associati ad esso. Le miscele fisiche (MIX) sono state preparate utilizzando 1/6 mmol di ogni

reagente mentre per lo kneading (KND) sono state impiegate 0.5 mmol per ognuno. Sono

stati inoltre effettuati due tentativi di sintesi con due diversi solventi: EtOH 98%, risultato

piu indicato, e una miscela 1:1 EtOH : H2O. I dati degli kneading riportati sono percio relativi

all’utilizzo del solo EtOH.

I diffrattogrammi sono stati raccolti nell’intervallo angolare 3-35◦/2θ, step 0.03◦ e tempo di

conteggio 6 sec/step. Per le misure spettroscopiche e stato utilizzato uno spettroscopio FT-IR

per l’analisi diretta di polveri e sono quindi assenti i picchi relativi al nujol. Le misure DSC

sono state condotte alla velocita di scansione di 5 ◦C/min da 25 a 250◦C su una quantita di

campione compresa tra i 3 e i 5 mg in crogioli di alluminio chiusi con coperchio forato e in

flusso di azoto secco.

Figura 5.1: Diffrattogrammi ottenuti sperimentalmente per lo studio del sistemaβ-CD : bumetanide.

In Figura 5.1 sono mostrati i diffrattogrammi relativi allo studio del sistema β-CD : bume-

tanide. La bumetanide utilizzata per la sintesi risulta essere il polimorfo di struttura triclina.

Infatti, il diffrattogramma calcolato sulla base del modello strutturale triclino ben si sovrappo-

ne a quello sperimentale (Figura 5.2) [dati ottenuti dall’affinamento strutturale e di profilo del

diffrattogramma applicando il metodo di Rietveld[ 74] tramite il software TOPAS V3.01]. La

1Bruker AXS (2005). TOPAS V3.0: General profile and structural analysis software for powder diffractiondata. User Manual Bruker AXS, Karlsruhe, Germany.

18

Parte Sperimentale 5.2. Attivita Sperimentale e Risultati

Figura 5.2: Bumetanide: diffrattogramma sperimentale (blu), calcolato sulla base del modellostrutturale triclino (rosso), curva differenza [sperimentale − calcolato] (grigio) e posizione attesadei picchi di diffrazione per la cella cristallina triclina (barre nere).

miscela fisica (MIX in Figura 5.1) mostra i picchi tipici di entrambi i composti puri. Il diffrat-

togramma dello kneading (KND) e molto simile a quello osservato per la miscela fisica, ma sono

presenti alcuni picchi deboli aggiuntivi agli angoli 7.0, 8.0, 10.0, 11.0 e 11.5 ◦/2θ. Possiamo

pertanto concludere che la sintesi per kneading della miscela 1:1 porti alla formazione incom-

pleta del composto d’inclusione e che siano presenti ancora i reagenti in quantita elevata. Cio

e confermato anche dalle misure FT-IR in cui vi sono variazioni poco importanti dello spettro

tra MIX e KND e dalle DSC nelle quali KND e MIX mostrano gli eventi termici sia della β-CD

che della bumetanide. Non verranno pertanto riportate in quanto poco significative.

Figura 5.3: Diffrattogrammi ottenuti sperimentalmente per lo studio del sistemaγ-CD : bumetanide.

Per quanto riguarda i diffrattogrammi relativi al sistema γ-CD : bumetanide (Figura 5.3),

MIX presenta anche in questo caso i picchi tipici di entrambi i composti puri. KND mostra

invece un diffrattogramma decisamente differente da quello della miscela fisica: si osservano una

banda larga centrata a circa 20◦/2θ attribuita a componente amorfa e una serie di nuovi picchi

a 7.0, 9.9 e 11.0 ◦/2θ. Non si osservano i picchi della γ-CD e della bumetanide triclina. I nuovi

effetti di diffrazione osservati nel campione KND si spiegano invece con la struttura cristallina

19

Parte Sperimentale 5.2. Attivita Sperimentale e Risultati

del polimorfo monoclino della bumetanide. Il diffrattogramma calcolato sulla base del modello

strutturale monoclino e infatti ben sovrapponibile a quello sperimentale (Figura 5.4). I risultati

Figura 5.4: KND – confronto con la struttura monoclina della bumetanide: diffrattogrammasperimentale (blu), calcolato sulla base del modello strutturale monoclino (rosso), curva diffe-renza [sperimentale − calcolato] (grigio) e posizione attesa dei picchi di diffrazione per la cellacristallina monoclina (barre blu).

ottenuti dal processo di kneading suggeriscono quindi la possibile formazione di un composto

d’inclusione, amorfo, in cui il rapporto stechiometrico γ-CD : bumetanide e superiore a 1:1. Cio

spiega l’assenza di γ-CD e la presenza di un eccesso di bumetanide. Le operazioni di kneading

hanno inoltre indotto la transizione strutturale della bumetanide al polimorfo monoclino.

Figura 5.5: Spettri FT-IR ottenuti sperimentalmente per lo studio del sistemaγ-CD : bumetanide.

Osservando gli spettri FT-IR riportati in Figura 5.5, si notano evidenti variazioni nell’in-

tensita di alcuni picchi: a circa 1250 cm−1 vi e una diminuzione d’intensita del picco relativo

al bending del C–N aromatico della bumetanide. Tra gli 800 e poco dopo i 900 cm−1 abbiamo

un’altra diminuzione, stavolta dei picchi relativi ai bending Ar–H e dei C dell’anello aromatico

p- sostituito, cosı come il tipico doppietto 690+780 cm−1 relativo all’anello m- sostituito e il

picco a c.a. 740 cm−1 dell’anello o- sostituito. Osservando la struttura del farmaco (Figura 4.1),

si puo facilmente dedurre che gli unici due residui abbastanza idrofobi da poter essere inclusi

all’interno di una CD siano il fenossi e l’N -butile: il primo ha relazioni sia o- che p- con altri

20

Parte Sperimentale 5.2. Attivita Sperimentale e Risultati

sostituenti, il secondo sia o- che m- . Ha senso quindi pensare che l’inclusione di solo questi due

gruppi funzionali da parte della γ-CD sia effettivamente avvenuta. E inoltre probabile che la

miglior riuscita dell’inclusione da parte della γ-CD vista in XRD sia dovuta alle sue dimensioni

maggiori che permettono di complessare piu efficacemente il gruppo fenossi rispetto alla β-CD.

10

8

6

4

2

0

2

Flus

so d

i Cal

ore

(W/g

)

0 50 100 150 200 250

Temperatura (°C)

bumetanide–––––––gammaCD–––––––MIX–––––––KND–––––––

Exo Up

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Flus

so d

i Cal

ore

gam

maC

D (W

/g)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0.2

Flus

so d

i Cal

ore

bum

etan

ide

(W/g

)

0 50 100 150 200 250

Temperatura (°C)

Figura 5.6: Profili DSC ottenuti sperimentalmente per lo studio del sistemaγ-CD : bumetanide.

Anche le misure DSC supportano l’ipotesi proposta (Figura 5.6). La γ-CD presenta sola-

mente un profilo associato alla disidratazione[ 69] tra i 25 e i 90 ◦C e un picco poco intenso tra

i 100 e i 125 ◦C. La bumetanide mostra due eventi termici: il primo a circa 165 ◦C, dovuto

a transizione polimorfica, e il secondo a 234 ◦C, attribuito alla fusione del composto[ 75]. Il

processo di fusione comporta un ∆H di 117.8 J/g (ricavato per integrazione del picco). Se nel

MIX si osservano gli eventi termici della CD (disidratazione) e della bumetanide, nello KND si

nota solo il picco relativo alla fusione della bumetanide a cui corrisponde un ∆H di 13.5 J/g.

Poiche il campione e stato preparato a partire dal rapporto stechiometrico 1:1, la percentuale

in peso di bumetanide nel campione risulta essere 21.9%. Sulla base del ∆H della bumetanide

pura, nell’ipotesi in cui nel campione KND tutta la bumetanide della sintesi fondesse, si sarebbe

dovuto osservare un ∆H di 25.8 J/g alla fusione. Avendo ottenuto invece un ∆H di 13.5 J/g ,

si puo formulare l’ipotesi che parte della bumetanide abbia formato il complesso d’inclusione

con la γ-CD ed essendo il complesso amorfo (XRD), non si osservano altri effetti termici si-

gnificativi. Va tuttavia sottolineato che i risultati ottenuti sono preliminari e si riferiscono alla

sola composizione γ-CD : bumetanide 1:1.

Per verificare l’ipotesi proposta, visti i due siti disponibili della bumetanide per la com-

plessazione, sarebbe interessante rioperare la procedura sperimentale con rapporti CD:farmaco

21

Parte Sperimentale 5.2. Attivita Sperimentale e Risultati

2:1 oppure eseguire delle titolazioni spettrofotometriche con il metodo di Job delle variazioni

continue o del rapporto molare, dato che il farmaco assorbe nell’UV, per la determinazione del

rapporto stechiometrico predominante.

In conclusione, proponiamo un modello strutturale pr il complesso d’inclusione con la γ-CD,

nel caso dell’associazione ad entrambi i gruppi funzionali idrofobi visti (Figura 5.7.a), e una

sua elaborazione in tre dimensioni ottenuta tramite il software Avogadro Ver 1.2.0 e l’Auto

Optimization Tool con un modello di campo di forza MMFF94[ 76] (Figura 5.7.b).

a.

S

O

H2N

HN

O O

HO

O

b.

Figura 5.7: Modello strutturale (a) e rispettiva elaborazione grafica in 3D (b) proposti per ilcomplesso [(γ-CD)2·bumetanide].

6. Conclusioni

Le CD risultano essere molecole facilmente ottenibili – in quanto derivati enzimatici di una

materia prima molto diffusa in natura come l’amido –, estremamente versatili in molti campi

industriali e particolarmente indicate nel trasporto di farmaci: ne aumentano infatti la solubi-

lita, la biodisponibilita e la stabilita. Sono inoltre funzionalizzabili tramite le tipiche reazioni

degli alcoli, il che permette loro di essere rese selettive per l’inclusione di determinate molecole

oppure di controllare il rilascio di un principio attivo all’interno dell’organismo, prolungandolo

o velocizzandolo o rendendo la molecola inclusa organo-specifica. Sono impiegate principalmen-

te CD formate da diversi monomeri di glucopiranosio aventi, per questo, cavita di dimensioni

differenti: questo aspetto influenza ulteriormente la loro selettivita, come dimostrato anche

sperimentalmente nel capitolo 5. Il loro punto di forza sta di sicuro nel fatto di associarsi ad

altre molecole con interazioni che non prevedono rotture o formazioni di legami covalenti: le

sintesi dei complessi prevedono infatti condizioni blande e possono essere operate anche per

semplice miscelazione o dissoluzione nello stesso solvente, solitamente acqua.

In virtu di cio, le CD possono essere considerate delle molecole green, sia per quanto riguarda

il loro ottenimento e quello dei loro complessi, sia per il loro eventuale utilizzo diretto in

green chemistry nella solubilizzazione di sostanze organiche in solventi polari non inquinanti[ 77].

Andrebbe pertanto incentivata la ricerca su di esse, in particolare prevedendo di sostituire altre

sostanze che associate a farmaci non solo sopperiscono magari solo ad alcuni dei molteplici

effetti per cui vengono sfruttate le CD nella complessazione, ma risultano essere spesso piu

tossiche, costose e inquinanti nella sintesi.

22

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Ringraziamenti

Vorrei innanzi tutto ringraziare la Prof.ssa Doretta Capsoni per avermi dato la pos-

sibilita di studiare e approfondire l’argomento di questa tesi, permettendomi anche

di integrarlo sperimentalmente grazie, tra l’altro, alla Sua disponibilita nel ricercare

i reagenti adatti: e stato un impegno che e di sicuro indice di vero interesse e ap-

prezzamento verso gli studenti di cui e relatrice, confermato inoltre dalla costanza

nel seguirmi e la reperibilita durante tutto il corso della stesura. Ringrazio poi il

Dott. Francesco Monteforte per le utilissime indicazioni nella pratica sperimentale di

laboratorio e il Prof. Maurizio Licchelli per i chiarimenti teorici sulle ciclodestrine.

Ringrazio tutta la mia famiglia per il caloroso sostegno e l’entusiasmo che mi sono

sempre stati offerti durante la preparazione degli esami in questi tre anni di studi e

della tesi ora. Un grazie particolare ai miei genitori Maria Vittoria e Giovanni le cui

passioni di chimica e informatica sono diventate anche alcune delle mie, a Luca che a

volte le indaga con amorevole curiosita e ai miei amici e compagni di corso che hanno

condiviso con me la prima durante gli studi, insieme a gioie, sofferenze e tante, tante

risate.

Grazie infine alla Prof.ssa Alessandra Zenari per aver destato in me, a suo tempo,

il fascino per le ciclodestrine e, ancora piu a monte, alla Prof.ssa Stefania Marinelli

che, prima tra tutti, ha gettato il seme del mio amore per la chimica che frutta oggi.

A tutti voi e dedicata questa tesi.

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