Chimica Inorganica BiologicaChimica Inorganica Biologica Il diossigeno O 2 L’azione lesiva di...

Tossicità di O2

La comparsa di O2 sulla terra ha rappresentato una catastrofe ecologica in quanto organismi anaerobici dovettero trasformarsi in aerobici.

• FeII (solubile) → FeIII (insolubile); • CuI (insolubile) → CuII (solubile); • S−II (insolubile) → SO4

2− (solubile); • Se−II (insolubile) → SeO3

2− (solubile); • MoSx (insolubile) → MoO4

2− (solubile); • CH4 → CO2; • H2 → H2O; • NH3 → NO3

−, NO2−, NO.

Chimica Inorganica Biologica Il diossigeno O2

Il diossigeno è essenziale per la vita degli organismi

aerobici, le cellule umane usano O2 come accettore finale di

elettroni nella respirazione:

O2 + 4H+ + 4e → 2H2O

• Per sopravvivere alla reattività dell'ossigeno e dei suoi derivati

gli organismi dovettero sviluppare una moltitudine di

antiossidanti biologici ed un processo opposto alla fotosintesi,

la respirazione.

• I batteri anaerobici attuali derivano dai primitivi organismi

anaerobici mentre gli attuali organismi aerobici si sono

sviluppati adattando il loro metabolismo al potere ossidante del

diossigeno.


Tossicità di O2

Cenni storici

o La tossicità del diossigeno fu riconosciuta da Rebecca Gerschman (1954).

o Irwin Fridowich imputò invece la tossicità allo ione superossido (1968)

o Attualmente il candidato principale è il radicale idrossile.


L’azione lesiva di queste specie reattive riguarda i lipidi, il DNA e le proteine.

Il DNA presente all'interno della cellula è vulnerabile all'attacco ossidativo alla

base e allo zucchero; L'ossidazione del DNA può portare a mutazioni.

Le proteine possono subire un danno ossidativo alle catene laterali

amminoacidiche in particolar modo i residui cisteinici e metioninici.

Nella cellula sono comunque presenti le difese opportune.

Chimica Inorganica Biologica Reattività del diossigeno O2

Perossidazione lipidica

Variazioni irreversibili della

catena fosfolipidica

o Lipidi o Proteine o DNA

I lipidi sono componenti essenziali delle membrane ed il danno

ossidativo osservato è dovuto ad autossidazione radicalica.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/9e/Lipid_peroxidation.svg

L'adattamento della vita alla presenza del diossigeno ha potuto

realizzarsi, in assenza di catalizzatori, grazie alla lentezza della

velocità di reazione del diossigeno.

L’utilizzazione del diossigeno comporta la possibilità di formazione

di specie reattive quali: diossigeno singoletto, superosso, perosso

ed ossidrile.

Quest’ultimo, uno dei più potenti radicali conosciuti, è prodotto dalla

riduzione monoelettronica dell’acqua ossigenata da Fe3+ e Cu2+



Sistemi di difesa dell’organismo contro i danni ossidativi

Le reazioni ossidative avvengono in compartimenti

cellulari chiusi: mitocondri e cloroplasti

Esistenza di specie molecolari capaci di catturare i derivati

tossici dell’ossigeno

Sistemi che sequestrano ioni metallici con attività redox

Enzimi detossificanti

Tocoferolo (E)

membrane

cellulari

acido

ascorbico (C)

glutatione

citosol Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/it/1/14/Tocotrienoli.jpg

Cellula


Citocromo P-450

Catalasi

Perossidasi

Superossidismutasi


Enzimi detossificanti


Citocromo P-450

Sono emoproteine il cui sito attivo è molto simile a quello della

emoglobina/mioglobina. Appartengono alla famiglia degli enzimi

mono-ossigenasi perché catalizzano l’inserzione di un atomo di

ossigeno in una grande varietà di substrati

C C OH

H OH

O

N N+_ O-

S S

O

Idrossilazione di composti alifatici

Idrossilazione di composti aromatici

Epossidazione di alcheni

Ossidazione di ammine a N-ossidi

Ossidazione di solfuri a solfossidi


Citocromo P-450


Citocromo P-450

Gli enzimi citocromo P450 costituiscono una superfamiglia (CYP) che

conta più di 7700 macromolecole.

Il nome deriva dalla lunghezza d’onda del picco di assorbimento

Sono stati difficili da caratterizzare perché

sono legati alle membrane del mitocondrio e

del reticolo endoplasmatico e sono poco

solubili in acqua.

Si è isolato quello presente nel batterio

Pseudomonas putida P-450cam

Fegato

Corteccia Surrenale

Catalizza reazioni di

ossidazione con scarsa

selettività dei substrati

Metabolismo di sostanze

endogene (acidi grassi,

steroidi) attraverso reazioni

stereospecifiche


Citocromo P-450

Questi enzimi consistono di una singola catena

polipeptidica (400-530 aa).

Il gruppo eme b (Fe-protoporfirina IX) è privo di

legami covalenti fra l’ anello porfirinico e la proteina. L’atomo è un FeIII BS legato solo ad un atomo di S di una cisteina (RS-).

L’altra posizione assiale è probabilmente

occupata da una molecola di H2O in prossimità

di una cavità

Il potenziale redox, a pH 7 è – 330 mV.


Citocromo P-450

Interesse biologico/fisiologico

Interesse chimico/sintetico Meccanismo

Si è ipotizzato che il meccanismo avvenga

attraverso la reazione controllata di O2 e

substrato nella sfera di coordinazione

dello ione metallico (reazione templata)

Orientazione spaziale (stereospecificità)

Attivazione elettronica


Citocromo P-450

Fe

Cys

Fe

Met

Cys: donatore σ

donatore π

Campo Debole

Alto Spin

Met: donatore σ

accettore π

Campo Forte

Basso Spin

Fe(III) esacoordinato a

basso spin: potenziale

redox a -330 mV

Interazione con il substrato genera

Fe(III) pentacoordinato ad alto spin.

La variazione di spin cambia il

potenziale redox a +170 mV

L’aumento di potenziale favorisce la riduzione (via

FADH2): si ottiene Fe(II)

pentacoordinato ad alto spin,

del tutto simile alla specie

che coordina O2 in

emoglobina

O2 si coordina per

dare addotto Fe(II)O2

o Fe(III)-superossido

La seconda riduzione forma il

complesso perossidico

La cattura di un H+ forma un Fe(III)

idroperossido, il quale per rottura eterolitica del

legame O-O si trasforma in OH- che viene

eliminato come H2O per acquisto di un protone.

XOOH

XOH

Se all’enzima si aggiunge un

peracido XOOH (che funge

da donatore di O) il ciclo è

cortocircuitato (effetto

shunt); ne consegue che

l’atomo di ossigeno proviene

dal perossido -O-OH.

Rimane nel ciclo catalitico la

specie estremamente reattiva

[FeIVPO]+ che ossida

il substrato RH:

[FeIVPO]++RH→FeIII(P)++ ROH

Classe di emoproteine che catalizza

l’ossidazione di molecole organiche da

parte di H2O2 che viene ridotta ad acqua

H2O2 + AH2 2H2O + A

Il centro metallico è un Fe(III) alto spin

coordinato ad un imidazolo di una istidina.

Nella sesta posizione coordina l’H2O2: gli aa presenti da questo lato guidano la

coordinazione e promuovono la reazione


Perossidasi

Mn-perossidasi

V-perossidasi

Mfree-perossidasi

Questi enzimi consentono l’eliminazione di H2O2

La riduzione completa avviene solo per 80% di O2


Perossidasi

Acidi grassi

Ammine

Fenoli

Xenobiotici

Tossine

R-CH2-COOH + 2H2O2 3 H2O + R-CHO + CO2

R-COOH

Perossidasi

ossidazione

α-ossidazione controllata degli acidi

grassi durante la crescita vegetale con

formazione di anidride carbonica e di un

omologo inferiore

Tireoperossidasi

Citocromo c perossidasi (CCP)

Mieloperossidasi

Lignina perossidasi

L’enzima più studiato nel gruppo delle perossidasi è

HRP (Horseradish Peroxidase)


Perossidasi

H2O2 coordina sul Fe(III) e

istidina distale media il

trasferimento di un H+ in

modo che entrambi gli

idrogeni siano legati

sull’ossigeno non coordinato al ferro

Arg polarizza il legame

perossidico favorendo la

rottura eterolitica di detto

legame

Si libera una molecola

di acqua e si forma un

intermedio Fe(IV)=O

con il metallo in uno

stato di ossidazione

elevato. L’anello porfirinco è un

radicale catione

Composto I è ridotto al Fe(III) di partenza a seguito di due trasferimenti elettronici.

Gli elettroni provengono dal substrato che si ossida


Perossidasi


Catalasi

È stata determinata la struttura della

catalasi presente nel fegato di

vitello.

H2O2 + H2O2 2H2O + O2

È una perossidasi speciale

perché il suo substrato è una

seconda molecola di H2O2.

Catalizza la reazione di

disproprozione di H2O2

Il Ferro (III) alto spin è coordinato

assialmente dal gruppo fenolato

dell’aminoacido tirosina e da una molecola di acqua che viene

spostata dall’H2O2.


Fe(III)porf + H2O2 Fe(III)porf(OOH) + H+

Fe(III)porf(OOH) Fe(IV)porf+.=O + OH-

Fe(IV)porf+.=O + H2O2 O2 + Fe(III)porf + H2O

Stesso

meccanismo

visto per le

perossidasi e si

forma

Composto I con

ferro ad alta

valenza

Usando H2O2 marcata si è stabilito che rottura legame O-O non avviene. Si tratta di una

riduzione bielettronica del composto I da parte di H2O2, con l’ossigeno coordinato al ferro che viene rilasciato in una molecola di acqua


Fe(IV)-Por+.

O

S-Cys

R-H

Fe(IV)-Por+.

O

His

+ArgHis

Compound I

Come è possibile che la stessa specie ipervalente dia due reazioni molto diverse:

trasferimento di atomo di ossigeno nel cyt P-450

trasferimento elettronico in perossidasi e catalasi

Le cavità in cui si dispone il substrato sono diverse: nel cytP450 RH è molto vicino al ferrile. Nella

perossidasi alcuni aminoacidi bloccano di fatto l’avvicinamento del substrato al ferrile, rendendo possibile solo il trasferimento dell’elettrone.

Come si effettua la rottura eterolitica del legame perossidico nei due sistemi enzimatici?

Nella perossidasi la polarizzazione del legame è raggiunta grazie all’azione degli aminoacidi. Nel

citocromo P-450 tali aminoacidi non ci sono perché il complesso si trova in una tasca idrofobica.

Probabilmente il legante assiale cisteina, per la sua natura basica, favorisce la rottura eterolitica.

Perossidasi e citocromo P-450


SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD)

Famiglia di metallo proteine che catalizza la disproporzione dello ione

superossido attraverso un meccanismo che consiste di due passaggi

consecutivi:

1) Mn+ + O2- M(n-1)+ + O2

2) M(n-1)+ + O2- Mn+(O2

2-) Mn+ + H2O2

2H+

Nello step 1) lo ione superossido riduce lo ione metallico ossidandosi ad ossigeno molecolare

Nello step 2) lo ione superossido riossida lo ione metallico riducendosi a perossido

La reazione complessiva è:

2O2- + 2H+ O2 + H2O2

SOD


Cu-Zn (SOD)

Si trova nei mitocondri delle cellule eucariote

consiste di due subunità identiche tenute

insieme da interazioni idrofobiche

il rame e lo zinco si trovano sul fondo di uno

stretto canale fatto ad imbuto. Le dimensioni di

questo canale consentono il passaggio solo a

molecole molto piccole (H2O) e a piccoli ioni

all’imboccatura del canale sulla superficie esterna della proteina ci sono due aa lisina,

che essendo carichi positivamente, attraggono

lo ione superossido.

lungo le pareti del canale vi è un aa arginina

anch’esso positivo che ha la funzione di

convogliare l’anione superossido verso il sito catalitico

una modifica chimica delle lisine e della

arginina comporta una forte diminuzione

dell’attività della SOD

Struttura della forma ossidata della

CuZn-SOD da eritrociti bovini


Cu-Zn (SOD)

Cu

His118 His44

His 46

H2O

Zn

His 69

Asp 81

His 78

His 61

Cu2+ è coordinato a

4 imidazoli istidinici

e a una molecola di

H2O. La geometria è

piramidale a base

quadrata con acqua

nella posizione

apicale

Zn2+ è coordinato a 3 imidazoli

istidinici e al carbossilato di un

aspartato

A ponte tra i due centri metallici


Cu-Zn (SOD)

Cu

His118 His44

His 46

H2O

Zn

His 69

Asp 81

His 78

His 61Rimozione dello Zn2+ non altera

l’attività della SOD ma rende più instabile la proteina che si denatura a

temperatura più bassa della SOD

nativa

Zn2+ ha ruolo strutturale

Cu2+ è il sito di interazione dello

ione superossido. Quindi il Cu2+ è

il sito su cui avviene la

disproporzione:

Cu2+ + O2- Cu+ + O2

Cu+ + O2- Cu2+(O2

2-) Cu2+ + H2O2

Attività della SOD è inibita in presenza di specie

anioniche piccole come CN-, F-, N3- che competono

con lo ione superossido nel sito catalitico.

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