Prof. Ettore Biagi

Laboratorio di terapia cellulare “Stefano Verri”AO San Gerardo, Monza

Dipartimento di Scienze della SaluteUniversità degli Studi di Milano-Bicocca

CELLULE STROMALI MESENCHIMALI (MSCs) NELLA

RIPARAZIONE DEI TESSUTI OSTEO-ARTICOLARI

CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSC)

FONTI DI CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI

Agoaspirato midollare

Sangue cordonale placenta Sangue periferico

Tessuto adiposo

cells should expressCD105 (known as endoglin and originally recognized by the MAb SH2), CD73 (known as ecto 5’nucleotidase and originally recognized by the MAb SH3 and SH4)CD90 (also known as Thy-1).

lack of expression of hematopoietic AgCD45 is a pan-leukocyte markerCD34 marks primitive hematopoietic progenitors and endothelial cells; CD14 or CD11b expressed on monocytes and macrophagesCD79a or CD19 are markers of B cellsHLA-DR molecules are not expressed on MSC unless stimulated, e.g. by IFN-g

MSC ADULTE: DEFINIZIONE DEI MINIMI CRITERI …

2- DIFFERENZIAMENTO IN VITRO DELLE MSC NEI 3 LINEAGES MESENGENICI

1- CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA

Positive per: CD90, CD105, CD166, CD54, CD55, CD13, CD44, SH2, SH3, SH4, HLA-ABCNegative per: CD33, CD34, CD45, CD14, CD31, CD133, HLA-DR

MSC ADULTE: COME CARATTERIZZARLE? IDENTITA’

Science 1999;284:143-147

Oil red O staining Ab (typeII collagen) Alkaline phosphatase

Esempio:

Differenziamento osteogenicoIl differenziamento delle MSCs in osteoblasti non è sorprendente; il midollo osseo è contenuto all’interno del canale diafisario delle ossa lunghe dove la struttura dell’osso è estremamente simile a quella dell’osso spugnoso che si rimodella continuamente, perciò non sorprende che campioni di midollo prelevati dall’osso possano contenere precursori di osteoblasti.

MSCs Osteoblasti

Acido ascorbicoDesametasoneβ Glicerofosfato

Desametasone: glucocorticoide di origine sinteticaAcido ascorbico: (vitamina C), un antiossidante necessario per la produzione di collagene,

nonché modulatore positivo dell’attività della fosfatasi alcalinaβ-glicerol-fosfato: donatore di ioni fosfato, promuove la formazione dei cristalli della matrice

mineralizzata

- CTRL - OS

21g 28g 35gCTRL

OS

MSC ADULTE: IL DIFFERENZIAMENTO IN VITRO IN SENSO OSTEOGENICO

CTRL OS

Le MSC vengono piastrate (4000 MSC/cm2) e indotte al differenziamento con il MEZZO OSTEOGENICO (OS) composto da terreno di coltura a cui si aggiunge:

osteopontina

Differenziamento adipogenico

MSCs Adipociti

InsulinaDesametasone3-isobutil metilxantina

La capacità delle MSCs di differenziare in adipociti può essere associata all’osservazione che il midollo viene in parte sostituito con l’adipe durante la vecchiaia.

Differenziamento condrogenico

MSCs Condrociti

Acido ascorbicoInsulinahTGFβ1Poli- lisina

La capacità delle MSC di differenziare in condrociti può essere associata al processo di riparo di una frattura, poiché la cartilagine appare nei siti di frattura prima che il callo venga sostituito da osso.

Differenziamento• Differenziamento

Adipogenico (colorazione citochimica Oil Red O)

• Differenziamento Condrogenico(immunocitochimica Collagene II)

• Differenziamento osteogenico (colorazione citochimica fosfatasi alcalina)

Pittenger M.F. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. 1999 Science 284:143-147

STRATEGIE DI INGEGNERIA TISSUTALE

Un esempio di ingegneria tissutale è costituito dall’uso delle MSC nella riparazione di difetti ossei.

La procedura prevede il caricamento delle MSCs su scaffold opportuni, cioè in grado di fornire uno stimolo osteogenico alle MSCs e un ambiente favorevole al differenziamento di queste cellule in osteoblasti.

Bianco P. (2001) Stem cells in tissue engineering. Nature 414: 118-121

MESENCHYMAL STEM CELLS: REGENERATIVE THERAPY FOR BONE LOSS,

From bench to bed side

Validation under GMP conditions of tissue-engineering protocols applied to bone regeneration in different pathologies:

1- PERIODONTAL DISEASE2- TIBIAL NON-UNIONS3- OSTEONECROSIS

Salute e medicinaStaminali per rigenerare le ossa dei denti(Corriere delle Sera )

MONZA -- Traguardo italiano. Ieri mattina è stato eseguito al San Gerardo di Monza il primo impianto di staminali sull'uomo per rigenerare l'osso dei denti. L'intervento è stato eseguito da Marco Baldoni , direttore della ClinicaOdontoiatrica dell'università di Milano-Bicocca e da Fabrizio Carini , responsabile della chirurgia orale, su un malato di piorrea.Un ottimo passo avanti contro la piorrea, che colpisce circa il 60-70 per cento degli italiani oltre i 50 anno, ma anche il 5 per cento dei giovani.

La piorrea, o parodontite , è un'infezione cronica delle strutture parodontali, causata da batteri. Se trascurata può portare alla perdita dei denti.

Dopo sei anni di studio e di test coofinanziati dal ministero dell'Università e della ricerca scientifica, nei laboratori del Dipartimento di NeuroScienze e Tecnologie Biomediche della Bicocca, i medici hanno raggiunto buoni risultati. E in seguito c'è stata l'approvazione da parte dell'Istituto superiore di sanità del protocollo di fase 1 di sperimentazione sull'uomo.

"Abbiamo creato - spiega Baldoni - degli scaffold biocompatibili e riassorbibili in cui sono state inserite le staminali adulte già differenziate in cellule ossee ". Gli scaffold sono sfere di collagene che contengono un milione di staminali per centimetro cubo. "Nell'osso mascellare del quarantenne ne sono state impiantate una dozzina", dice Carini.

Non c'è alcun pericolo di rigetto perchè le cellule sono del paziente stesso. "Ora, là dove c'era atrofia, ci aspettiamo nuovo osso ", dice Baldoni.

"Le staminali adulte mesenchimali - dice Baldoni - servono a rigenerare tessuti quali l'osso, la cartilagine, il muscolo. Le abbiamo estratte dal paziente, moltiplicate in laboratorio, selezionate e poi impiantate".

1- PERIODONTAL DISEASEPROJECT IN COLLABORATION WITH THE

ODONTOIATRIC CLINIC (SAN GERARDO HOSPITAL)

PRODUCT OF CELL THERAPYhMSCs + collagen scaffold

Gingistat®

in vitroOsteogenic differentiation

CLINICAL TRIAL PHASE Iperiodontal disease

MESENCHYMAL STEM CELLS (MSC): CULTURE UNDER GMP CONDITIONS

- - - - - - - - - - - -

b- Four different expansions are shown for four different donors

a- Culture of MSCs at passage 3

�MSCs can be isolated from bone marrow and expandedunder GMP conditions to obtain adequate numbers for clinicalapplication without any microbic contamination.�MSCs retain their phenotypic pattern and theirdifferentiation potential.�MSC do not show any chromosomal abnormalities

Multilineages differentiation

osteogenic diff.

adipogenic diff.

chondrogenic diff.

Phenotypic characterization

mesenchymal antigens

haematopoietic markers

high expression (≥70%) CD90, CD105, HLA-ABClow expression (≤5%) CD33, CD34, HLA-DR

Salvadè et al, Cytotherapy, 2007; 9: 427-438

Kariotyping analysis

MSC: OSTEOGENIC DIFFERENTIATION UNDER GMP CONDITIONSClinical-grade GMP-vertified drugs (DRUGS) were compared to standard osteogenic

supplements (OS) in their ability to induce MSC osteogenic differentiation

The combined use of MSCs, exposed to an osteogenic clinical-grade medium, andbiodegradable scaffolds offers the possibility to produce adequate numbers ofbiological tissue-engineered cell-based constructs to be used in clinical trials.

Salvadè et al, Cytotherapy, 2007; 9: 427-438

Commercial clinical-grade scaffold Gingistat®

DOSSIER DEL PROTOCOLLO CLINICO APPROVATODALL’ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ

PHASE I CLINICAL TRIAL PTC-MSC-ODONTO (7 pazienti)PRELIEVO DEL MIDOLLO OSSEO (ematologia adulti) Espansione delle cellule

staminali mesenchimali1 mese

Coltura delle cellule su scaffolds differenziamento osteogenico

±10 scaffolds di 125mm3

2/3 settimane

CONTROLLI DI QUALITASterilitàVitalità cellulareQualità delle celluleDiff osteogenico

2 mesi di manipolazioni

cellulari

Inoculo nel paziente

classe B

11/10/2007: Approvazione trial clinico17/03/2008: paziente N121/05/2009: paziente N2, N322/01/2010: pazienti N4, N5May 2010: pazienti N6, N7

PRELIMINARY EVIDENCES

Fig.1 - RX preoperatoria

Fig. 2 - Deficit Periodontale Pre-opFig. 3 - Deficit Periodontale Pre-op

Fig. 4 – Trasporto Scaffold con MSCs

Fig. 5 - Fase chirurgica

Fig. 6 - Scaffold con MSCs

Fig. 8 - RX 6 mesi post-op

Fig. 9 - 6 mesi post-op Fig. 10 - 6 mesi post-op

REGENERATIVE THERAPY FOR BONE LOSS:PL-CULTURED MSCs SEEDED ONTO ORTHOSS® SCAFFOLD

TIBIAL NON-UNIONSPROJECT IN COLLABORATION WITH THE

ORTHOPEDIC CLINIC (SAN GERARDO HOSPITAL)

MSC GROWTH ON ORTHOSS® SCAFFOLD

•Scaffold were cut into 5mm3 cubes•Scaffolds were pre-coated 4h at T.A with a clinical grade fibronectin (RETRONECTIN)• 1X106 MSC were seeded into Orthoss®-scaffold and grown for 2-4 weeks

ORTHOSS®- GEISTLICH

Salvadè et al, Tissue engineering 2009

Cell proliferation onto the scaffold (1 vs 2 week of culture). At 2 weeks variability in cell concentration has been observed (single cells vs confluent layer).

Scaffold w/o cells +14 days MSC culture

MSCs PROLIFERATION INTO THE TAKARA PRE-COATED SCAFFOLD

PL-cultured MSCs can proliferate and well distribute into the Retronectin pre-coated scaffold

SEM ANALYSIS

Salvadè et al, Tissue Engineering 2009

Metodo: Pecora come modello sperimentaleScaffold: ceramica naturale, architettura a pori interconnessi simile a quella dell’ossoSono stati creati grossi difetti ossei (25 mm) nella tibia dell’animale in cui sono poi stati impiantati:

Petite H. et al. 2000. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol.18:959-63

Scopo: osservare se la combinazione di MSC+coral scaffold o FBM+coral scaffold migliorano (tempo/qualità) la rigenerazione ossea in grossi difetti ossei.

Follow up: 4 mesi mediante radiografie

Coral scaffold Coral scaffold +

FBMCoral scaffold +

MSC espanse ex-vivo

FBM: 1 MSC/3000 cellule nucleate

MSC autologhe isolate da BM (cresta iliaca) ed espanse fino a p2

Petite H. et al. 2000. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol.18:959-63

Radiographic follow up

PRIMI TRIALS CLINICI CON MSC IN ORTOPEDIA

1 - Iniezione percutanea di FBM w/o isolamento MSC; w/o scaffold

� Arruolati 20 pazienti affetti da frattura persistente della tibia con deformità modesta� E’ stato iniettato a livello del difetto FBM� La tecnica è risultata semplice, poco invasiva, sotto anestesia locale e senza

alcuna complicanza di rilievo né in sede di inoculo né sistemica� Nel 75% dei casi l’intervento ha portato ad un unione delle due parti con una

media del tempo di guarigione di 14 settimane� Nel 20% dei casi non si è rilevato alcun effetto terapeutico di rilievo, ma non ci

sono stati casi di infezioni o complicazioni post-inoculo

UNIONE TIBIALE:15/20 PAZIENTI (75%)

Goel A. et al. Injury 2005;36:203-6

2 - Espansione ex vivo di MSC:MSC espanse in vitro, deposte su scaffold in ceramica e impiantate nel difetto osseo

� Arruolamento di 3 pazienti con fratture ossee importanti a livello delle diafisi di tibia, ulna e omero� Le MSC sono state espanse in vitro, inserite su HA scaffold e impiantate nei

difetti ossei� Il follow-up ha mostrato un ottimo consolidamento tra la parte esogena

impiantata e l’osso, senza alcun effetto collaterale� I tempi di formazione del tessuto osseo sono stati più brevi (2 mesi) rispetto

ad un tradizionale approccio di trapianto osseo (12-18 mesi)

PRE-OPERATORIA POST-OPERATORIA

Quarto R. et al., N Engl J Med;344:385-6

Case 1

18 MESI DALL’INTERVENTO

Case 2

PRE-OPERATORIA POST-OPERATORIA 8 MESI DALL’INTERVENTO

Case 2

3 - MSC espanse in vitro, deposte su scaffold in ceramica, indotte in coltura al differenziamento osteogenico e impiantate nel difetto osseo

� Arruolati 3 pazienti affetti da osteoartrite sottoposti a protesi completa della caviglia� Prelevati 3 ml di midollo osseo, MSC isolate ed espanse in vitro per due passaggi � MSC seminate sullo scaffold (1x105 MSC/cm2), tenute in coltura 2 settimane con mezzo osteogenico

e in seguito impiantate nella caviglia� Campioni in vitro per valutare la capacità proliferativa e di differenziamento. → l’aumento progressivo

del differenziamento avviene solo nelle cellule trattate con mezzo osteogenico� Follow-up di 25-30 mesi, con esami radiologici e clinici (funzione dell’articolazione + dolore riportato) � Dopo 2 anni: l’analisi dell’area di interfacia ossea tra l’inoculo ed il tessuto limitrofo ha dimostrato la

presenza di aree radiodense solo in coincidenza delle zone porose dell’impianto, ove le cellule coltivate ex vivo erano state inoculate� L’ innesto della protesi con cellule autologhe non ha provocato né reazioni immunitarie avverse né

infiammazioni attorno alle aree dell’impianto

Future developments• Huge clinical need (bone resorption for tumors, distrofic

damage, osteonecrosis)• Appealing for companies selling scaffolds• Necessity to perform a phase 1 study (osteonecrosis in

kids affected by OSN – collaboration with Istituto Rizzoli –Bologna, Dr. Davide Donati)

• Necessisty to simplify the process for a larger application accomplishing future “academic-type” developments (collaboration with University of Pisa for production of novel devices)

Laboratorio Interdipartimentaledi Terapia Cellulare e Genica

Stefano Verri

Non classificato Classe D Cl asse C Classe B Classe A – cabi na a flusso laminare

Figura 1

FILTRO D

CLASSED FILTRO C

ARMADIO

Classi GMP:

LA CELL FACTORY

GMP AREAS

Class BProduction Actvity

Surgery

Physical

Pharmacology

Cell and Gene

Therapy

The future: just a dream?

Daniela BelottiBenedetta CabiatiStefania CesanaGiada MateraArianna IncontriPaolo PerseghinGiuseppe GaipaEttore Biagi

Laboratorio Interdipartimentale

di Terapia Cellulare e Genica“Stefano Verri”